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Behavior

Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Questo documento descrive una tecnica di manipolazione nei topi, la tecnica di manipolazione 3D, che facilita la manipolazione di routine riducendo i comportamenti simili all'ansia e presenta dettagli su due tecniche correlate esistenti (gestione del tunnel e della coda).

Abstract

Gli animali da laboratorio sono sottoposti a molteplici manipolazioni da parte di scienziati o fornitori di assistenza agli animali. Lo stress che questo provoca può avere effetti profondi sul benessere degli animali e può anche essere un fattore confondente per variabili sperimentali come le misure di ansia. Nel corso degli anni, sono state sviluppate tecniche di manipolazione che riducono al minimo lo stress correlato alla manipolazione con particolare attenzione ai ratti e poca attenzione ai topi. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi possono essere bituati a manipolazioni utilizzando tecniche di manipolazione. Abituare i topi alla manipolazione riduce lo stress, facilita la manipolazione di routine, migliora il benessere degli animali, diminuisce la variabilità dei dati e migliora l'affidabilità sperimentale. Nonostante gli effetti benefici della manipolazione, l'approccio tail-pick up, che è particolarmente stressante, è ancora ampiamente utilizzato. Questo documento fornisce una descrizione dettagliata e la dimostrazione di una tecnica di manipolazione del topo di nuova concezione intesa a ridurre al minimo lo stress sperimentato dall'animale durante l'interazione umana. Questa tecnica manuale viene eseguita nell'arco di 3 giorni (tecnica di manipolazione 3D) e si concentra sulla capacità dell'animale di abituarsi allo sperimentatore. Questo studio mostra anche l'effetto delle tecniche di gestione del tunnel precedentemente stabilite (utilizzando un tunnel in policarbonato) e la tecnica di raccolta della coda. Specificamente studiati sono i loro effetti sui comportamenti ansiosi, utilizzando test comportamentali (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interazione volontaria con gli sperimentatori e misurazione fisiologica (livelli di corticosterone). La tecnica di gestione 3D e la tecnica di gestione del tunnel hanno ridotto i fenotipi simili all'ansia. Nel primo esperimento, utilizzando topi maschi di 6 mesi, la tecnica di gestione 3D ha migliorato significativamente l'interazione dello sperimentatore. Nel secondo esperimento, utilizzando una femmina di 2,5 mesi, ha ridotto i livelli di corticosterone. Pertanto, la gestione 3D è un approccio utile in scenari in cui l'interazione con lo sperimentatore è richiesta o preferita, o in cui la gestione del tunnel potrebbe non essere possibile durante l'esperimento.

Introduction

Topi e ratti sono risorse essenziali per gli studi preclinici1,2 per molteplici scopi, tra cui studi endocrini, fisiologici, farmacologici o comportamentali2. Dal crescente numero di studi che coinvolgono animali, è emerso che variabili ambientali incontrollate tra cui l'interazione umana influenzano vari risultati nella ricerca biomedica3,4,5. Ciò è responsabile della significativa variabilità osservata tra esperimenti e laboratori di ricerca4,5, ponendo un avvertimento importante nella ricerca sugli animali.

Sono stati implementati vari approcci con l'obiettivo di limitare l'impatto dei fattori di stress ambientale e ridurre la reattività all'interazione umana. Ad esempio, per limitare l'impatto dei fattori di stress ambientale, la standardizzazione delle condizioni abitative e i sistemi abitativi automatizzati6,7 sono stati implementati in tutti i laboratori. Per quanto riguarda l'interazione con gli esseri umani, gli approcci comunemente usati per la manipolazione e il trasporto degli animali avevano poco riguardo per il disagio e lo stress degli animali. Ad esempio, raccogliere gli animali per la coda o usare la pinna8 aumenta l'ansia basale9,10,11,riduce l'esplorazione9,12 e contribuisce notevolmente alla variabilità interimpiale all'interno e tra gli studi13,14. Di conseguenza, sono stati sviluppati altri approcci, come la tecnica di gestione della tazza, che è applicabile a topi e ratti. In questo approccio, gli animali vengono "coppettati" fuori dalla loro gabbia e tenuti dagli sperimentatori con le mani che formano una tazza9,10,11. Un'altra utile alternativa alla movimentazione della coda prevede l'utilizzo di un tunnel in policarbonato per trasferire i topi9,10,15. Questo approccio elimina l'interazione diretta tra il mouse e lo sperimentatore. Sia l'approccio a coppa che a tunnel hanno mostrato efficacia nel ridurre i comportamenti ansiosi e la paura dello sperimentatore che possono essere esagerati da tecniche di manipolazione avverse, come il pick up / tail handling9,10.

Pertanto, prove crescenti dimostrano l'utilità di una corretta manipolazione del topo per ridurre la variabilità tra gli individui9,11e migliorare il benessere degli animali10. Tuttavia, le tecniche sopra menzionate devono ancora affrontare limitazioni. La tecnica di gestione della tazza è stata implementata con programmi che vanno da 10 giorni (10 sessioni in 2 settimane16)fino a 15 settimane17,che è una notevole quantità di tempo per il personale della struttura e gli sperimentatori. Inoltre, l'efficacia della manipolazione della tazza varia in base al ceppo9 e la manipolazione convenzionale della tazza in mani aperte può portare a topi ingenui o ceppi particolarmente saltellanti a saltare dalla mano9,18. La movimentazione delle gallerie si traduce in risultati più coerenti e generalmente più rapidi nella manipolazione19. I tunnel sono anche usati come arricchimento della gabbia domestica. Aiutano gli animali ad abituarsi a maneggiare rapidamente e forniscono i benefici aggiuntivi dell'arricchimento. La gestione delle gallerie, tuttavia, presenta limitazioni nel trasferimento di animali tra apparati. È interessante notare che Hurst e West9e Henderson et al.20 hanno dimostrato che l'uso di una manipolazione manuale delicata e breve per trasferire gli animali dal tunnel all'apparato non influisce sul loro fenotipo.

Per fornire un'alternativa ai metodi esistenti, con un'assuefazione realizzabile in un breve periodo di tempo, questo articolo descrive una nuova tecnica che espande la tecnica di movimentazione della tazza, quindi non richiede particolari attrezzature. Questo approccio utilizza pietre miliari per valutare il livello di comfort che i topi hanno con il processo di manipolazione. Mostra efficacia nel ridurre la reattività e lo stress del topo (a livello comportamentale e ormonale), facilita la manipolazione di routine e contribuisce a ridurre la variabilità tra gli animali. I dettagli di questa tecnica sono forniti qui e la sua efficacia nel ridurre i comportamenti simili all'ansia, migliorare l'interazione con gli sperimentatori e limitare il rilascio dell'ormone dello stress periferico (corticosterone) sono dimostrati in due studi separati (topi maschi e femmine), rispetto alla gestione del tunnel (controllo positivo) e alle tecniche di manipolazione della coda (controllo negativo).

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Protocol

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato per la cura degli animali camh e condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care.

NOTA: Il metodo di manipolazione qui descritto può essere utilizzato in vari ceppi di topo, comprese le linee non transgeniche (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, ecc.) e transgeniche. Può anche essere usato con topi giovani o vecchi, notando che i topi giovani adulti (4-6 settimane) tendono ad essere leggermente più attivi dei topi adulti o vecchi, specialmente il giorno 1.

1. Preparazione sperimentale

  1. Prima dell'inizio dello studio, secondo le linee guida ARRIVE21,assegnare casualmente i topi a ciascun gruppo di gestione (3D-Handling, Tunnel Handling o Tail Handling).
  2. Identificare la stanza in cui eseguire la manipolazione. Può essere eseguito nella stanza di alloggiamento o in una stanza separata. Se la manipolazione viene eseguita in una stanza separata, che richiede che gli animali vengano spostati su un carrello in movimento, consentire agli animali di abituarsi alla nuova stanza per 20-30 minuti prima dell'inizio del protocollo di manipolazione.
  3. Per gli animali ospitati in gruppo, utilizzare una gabbia temporanea per ospitare i topi dopo la manipolazione, prima di raggrupparli tutti nella loro gabbia domestica iniziale. Ciò riduce i potenziali combattimenti tra animali prima della manipolazione (in particolare nei maschi).
  4. Lavora su un bancone (preferibilmente un piano di lavoro sgomberato) o in un armadietto di biosicurezza, con la gabbia di alloggiamento lontana dall'animale che viene maneggiato. La vicinanza alla gabbia abitativa aumenta il rischio di saltare. Se gli animali sono alloggiati in gruppo, saltare il topo che viene maneggiato nella gabbia domestica può causare stress ai compagni di gabbia.
    NOTA: Lavorare in un armadio di biosicurezza limita il rischio che i topi saltino sul pavimento e può essere richiesto in alcune strutture. Questa tecnica può essere utilizzata in un armadio di biosicurezza, assicurandosi di eseguire sempre tutti i passaggi all'interno dell'armadio di biosicurezza ed evitando che i topi camminino sugli avambracci del gestore.

2. GIORNO 1: 5 min per mouse

  1. Aprire delicatamente la gabbia e posizionare il coperchio sul lato, rimuovere i materiali di nidificazione e altri arricchimenti come ruote da corsa o rifugi.
  2. Introdurre una mano aperta guantata nella gabbia di casa, posizionando lentamente la mano lungo un lato della parete della gabbia (la parete più vicina al conduttore, Figura 1A).
    1. Non provare immediatamente a prendere il mouse.
  3. Rimanere immobili e permettere all'animale di abituarsi alla presenza della mano nella gabbia per circa 30 s.
  4. Cerca di prendere il mouse nel palmo della mano (cioè, evita di raccogliere l'animale per la coda).
    1. Se il mouse non viene facilmente raccolto dopo 3 tentativi, guidare il mouse in un angolo e in una tazza con entrambe le mani.
    2. Muovi delicatamente le mani a coppa verso il mouse per cercare di raccoglierlo.
    3. Se non ha successo dopo un massimo di 3 tentativi con entrambe le mani, prendi delicatamente il mouse dalla base della coda e trasferiscilo sull'avambraccio o sulla mano piatta.
  5. Con il mouse in mano, tieni la mano il più piatta e aperta possibile.
    NOTA: questo fornisce una piattaforma piatta su cui il mouse può calpestare e limita il rischio di morsi.
  6. Tenendo la mano aperta e piatta con il palmo verso l'alto, posizionare l'altra mano adiacente alla mano che tiene il mouse e consentire al mouse di muoversi liberamente da una mano all'altra senza alcun ritegno (Figura 1B).
  7. Lascia che il mouse esplori e si muova tra le mani per 1 minuto.
    1. A questo punto i topi possono provare a saltare via. Posiziona le mani in modo tale che se il mouse salta, atterrerà su un piano di lavoro piuttosto che sul pavimento.
    2. Se un topo sembra che si stia preparando a saltare (muovendosi verso il bordo della mano e alzandosi sulle zampe posteriori), posiziona lentamente l'altra mano di fronte ad esso e cerca di guidarlo a camminare su questa mano. Evita movimenti improvvisi in quanto aumenta il rischio di saltare.
    3. Se un mouse salta, prova a prenderlo evitando la manipolazione della coda e riprendi la sessione di gestione. Se il mouse rimane sul pavimento o fuori dalle mani per più di 10 s, aggiungere ulteriore tempo alla sessione di manipolazione per compensare ogni volta che il mouse è stato fuori dalle mani.
    4. Prendi appunti del salto. Il numero totale di salti può essere utilizzato per valutare la potenziale variabilità tra gli animali.
  8. Dopo 1 minuto di manipolazione con le mani piatte, rilassare il palmo della mano e leggermente prendere il mouse in mano, prima di far rotolare delicatamente il mouse tra le mani (Figura 1C).
    1. Per "rotolare", posizionare il mouse nel palmo della mano, su una mano piatta, perpendicolare alle dita.
    2. Chiudi lentamente la mano, posizionando le dita sul retro del mouse.
    3. Posizionare la mano libera direttamente sotto la mano tenendo il mouse.
    4. Ruotare lentamente la mano con il mouse per trasferire delicatamente il mouse all'altra mano (rotazione di 180 °).
    5. Ripeti questo avanti e indietro tra le mani.
  9. Alterna il delicato rotolamento tra le mani e l'esplorazione libera a mani aperte per 60 s, alternando tecniche circa ogni 20 s.
  10. Eseguire un "test del rifugio" (Figura 1D).
    1. Lascia che il mouse si sposti sul bordo della mano, quindi unisci le 2 mani.
    2. Molto lentamente, coppettali in modo che il mouse si adatti all'interno di un "rifugio" formato dalle mani. Lasciare un'apertura in modo che il mouse possa fuggire se necessario.
    3. Cerca di tenere il mouse nel rifugio per 5-10 s, senza alcun ritegno.
    4. Alternare tra il test del rifugio, rotolare tra le mani e l'esplorazione libera delle mani aperte per altri 60 anni, assicurandosi di eseguire il passaggio del rifugio 3 o più volte.
  11. In tutte le procedure descritte in 2.10, non affrettare il processo. Se il mouse appare stressato (cioè, tentativo di fuga, salti dalle mani, evitando il contatto con le mani ecc.) essendo confinato all'interno delle mani, continuare con il rotolamento tra le mani e l'esplorazione libera per 20 s, e poi riprovare.
  12. Pietra miliare: eseguire almeno 1 test di rifugio di successo di 10 s per il completamento del giorno 1.
    1. Considera un test di rifugio di successo quando il mouse rimane nelle mani. Se il mouse fa scoppiare la testa e ritorna al rifugio, è ancora un test riuscito. Se l'animale esce completamente dal rifugio, è un fallimento.
  13. Consenti l'esplorazione gratuita nelle mani per 30 s.
  14. Sostituire delicatamente il mouse nella sua gabbia. Se il gruppo è alloggiato, metti il topo nella gabbia temporanea fino a quando tutti i compagni di gabbia non vengono maneggiati. Riporta i topi nella loro gabbia originale raccogliendoli nel palmo della mano. Non utilizzare un pick up di coda.
  15. Pulire il banco di potenziali feci e urina con il 70% di etanolo.
  16. Risciacquare accuratamente i guanti con etanolo al 70% (o soluzione detergente appropriata) o cambiare i guanti prima di maneggiare il mouse successivo (è possibile tenere gli stessi guanti per i compagni di gabbia).
    NOTA: Si consiglia di eseguire la manipolazione con un numero ragionevole di animali per evitare l'affaticamento del conduttore. La gestione di 24 topi richiede circa 2 ore e si consiglia di non superare i 24 topi per conduttore. Se è necessario maneggiare più animali, si consiglia di avere più conduttori o di dividere le procedure di manipolazione in sottogruppi, per più giorni.

3. GIORNO 2: da 3 a 5 minuti per mouse

  1. Prova a prendere il mouse nel palmo della mano. In questa fase, dovrebbe essere già fattibile e i topi non dovrebbero saltare fuori dalla mano.
  2. Inizia con il palmo aperto come il giorno 1, consentendo al mouse di esplorare liberamente per 20 s.
  3. Quindi, rotolare il mouse tra le mani un paio di volte (4-5 volte).
  4. Eseguire il "test del rifugio" per 5 s.
  5. Ripetere il test del rifugio più volte (~ 5-6) per un periodo da 2 a 3 minuti.
  6. Durante lo stesso periodo di 2 o 3 minuti, alternare con il rotolo tra le mani e l'esplorazione libera delle mani aperte passo dal giorno 1 per migliorare l'assuefazione.
    1. Toccare il mouse sulla testa e sulla schiena (Figura 1E), 5-6 volte. Un segno di assuefazione è quando il mouse ti permette di toccarlo senza tentare di fuggire.
    2. Eseguire un "Nose poke": provare a toccare il muso del mouse, 2 o 3 volte (Figura 1F).
      1. Se il mouse tenta di mordere o mostra evidenti segni di stress per essere toccato, non tentare immediatamente di nuovo il colpo del naso. Invece, alterna con l'esplorazione e il rollio a mano piatta. "L'assuefazione" si riflette nel fatto che l'animale non scappa o gira la testa in caso di contatto umano.
  7. In tutte le procedure descritte in 3.4-3.6, non affrettare il processo. Se il mouse appare stressato dall'essere confinato all'interno delle mani o non vuole essere toccato, continuare a rotolare tra le mani per 20-30 s e poi riprovare.
  8. Pietre miliari: eseguire almeno 1 colpo al naso di successo per 2-3 s per il completamento del giorno 2.
  9. Interrompere questa sessione dopo circa 3 minuti di manipolazione se l'animale reagisce bene al "rifugio", "accarezzamento della testa", "colpo al naso" e se il topo sembra essere disposto a esplorare le mani senza segni di stress.
  10. Se il topo continua a mostrare segni di stress o non sta reagendo bene al test di "rifugio" o al test "nose poke", continuare la sessione fino a raggiungere i 5 minuti come nel giorno 1.
  11. Sostituisci il mouse nella sua gabbia, pulisci il piano di lavoro e i guanti come nel giorno 1.

4. GIORNO 3: Circa 3 minuti per mouse

  1. Il terzo giorno, procedi attraverso gli stessi passaggi del giorno 2, per 2 o 3 minuti.
    1. Prendi il mouse nel palmo della mano.
    2. Trasferisci e rotola il mouse tra le mani
    3. Eseguire un test di rifugio.
    4. Prova ad accarezzare il mouse sulla schiena e sulla testa.
  2. Alternare questi passaggi per circa 1-2 minuti.
  3. Continuare la procedura fino a quando il mouse è abbastanza rilassato da sedersi nel palmo della mano senza tentare di fuggire.
  4. Prima della fine del giorno 3, ripeti il test del rifugio e il test del naso come test di assuefazione.
    1. Se entrambi i test possono essere completati al primo tentativo, il processo di assuefazione è completo. Continuare a maneggiare delicatamente il mouse per 30 s a un minuto.
    2. Se il mouse è inizialmente resistente a entrambi i test, ripetere i passaggi 4.1-4.3 per 20-30 s prima di riesamino il test del naso e del riparo.
    3. Se il topo rimane resistente a questi test dopo 3 minuti, il terzo giorno può essere ripetuto.
  5. Pietre miliari: eseguire almeno 2 test di rifugio di successo di 10 s ciascuno e 2 test di poke del naso di successo per il completamento del giorno 3 e il completamento dell'intera procedura di gestione 3D.
  6. Riportare il mouse nella sua gabbia, pulire il piano di lavoro e i guanti.

5. Approccio facoltativo per gli animali da sottoporre a ritenuta per iniezione o gavage

NOTA: Il giorno 3, se l'animale sarà trattenuto per scopi sperimentali (gavage orale, iniezione intra-peritoneale, ecc.), I topi possono essere sottoposti al test del pizzico del collo.

  1. Afferrare la nuca tra il pollice e l'indice (Figura 1G).
  2. Sollevare il mouse 3-5 cm sopra la mano per 2-3 s.
    NOTA: Questa è normalmente una posizione non naturale per i topi adulti, e se i topi rimangono quasi immobili, sono ben bituati alla manipolazione e saranno facili da trattenere per scopi sperimentali.
  3. Rimettere il mouse nella mano piatta o, se il mouse è reattivo al pizzico del collo, prendere in considerazione la possibilità di posizionarlo sulla manica dello sperimentatore, sul coperchio della gabbia o sul piano di lavoro
    NOTA: se si lavora in un armadio di biosicurezza, non posizionare il mouse sulla manica o potrebbe salire e uscire dall'armadio di biosicurezza. Preferisci posizionare il mouse sul piano di lavoro all'interno dell'armadio di biosicurezza.
  4. Lascia il mouse per esplorare liberamente la mano dello sperimentatore per 1 minuto.

6. Approccio facoltativo per ulteriori giorni di gestione

  1. Nell'eventualità di una linea di topo altamente stressata, aggiungere ulteriori giorni per ridurre la reattività e il livello di stress degli animali, utilizzando i metodi descritti nel Giorno 2/3.
    NOTA: Molti fattori possono influenzare lo stress basale degli animali, tra cui il ceppo, la presenza di modificazioni transgeniche, l'età, il sesso e le condizioni abitative. Se questi fattori non sono coerenti tra gruppi come gli animali anziani sottoposti a test contro i controlli giovani o gli animali transgenici testati contro i controlli di tipo selvatico, si raccomanda di utilizzare lo stesso numero di giorni di assuefazione per ciascun gruppo.

7. Gestione delle gallerie

NOTA: questa tecnica è applicabile solo ai mouse con gestione tunnel. I tunnel sono tubi in policarbonato di circa 13 cm di lunghezza e 5 cm di diametro.

  1. Posiziona il tunnel nella gabbia del mouse.
  2. Lasciare il tunnel nella gabbia per 7 giorni prima della manipolazione.
  3. Aprire la gabbia e posizionare il coperchio sul lato.
  4. Guidare delicatamente il mouse nel tunnel in policarbonato (già nella gabbia).
  5. Sollevare il tunnel dalla gabbia, orizzontalmente. Se necessario, coprire liberamente le estremità del tunnel per evitare che l'animale salti / cada fuori dal tunnel, potenzialmente ricadendo nella sua gabbia o sul pavimento.
  6. Sposta l'animale nel tunnel lontano dalla gabbia di casa e tienilo lontano da qualsiasi superficie per 30 s.
  7. Posiziona il tunnel nella gabbia di casa, consentendo al mouse di uscire dal tubo.
  8. Attendere 60 s e quindi ripetere i passaggi 7.4-7.7 una volta.
  9. Risciacquare accuratamente i guanti con etanolo al 70% o cambiare i guanti prima di abituare il mouse successivo.
  10. Ripetere questa procedura per 10 giorni consecutivi.

8. Manipolazione della coda

NOTA: questa tecnica è applicabile solo ai topi con manico a coda. È usato per trasferire i topi dalla loro gabbia a un apparato e viceversa.

  1. Aprire la gabbia e posizionare il coperchio sul lato.
  2. Afferra i topi per la base della coda tra pollice e indice.
  3. Sollevare il mouse dalla gabbia.
  4. In 2-3 s, trasferire il mouse all'avambraccio opposto dello sperimentatore mantenendo una presa sulla coda per evitare che il mouse penzoli.
  5. Quando è necessaria la manipolazione della coda nell'attuazione di questo esperimento (ad esempio, prima dei prelievi di sangue per il test del cortisolo) gli animali vengono trasferiti all'avambraccio dello sperimentatore mediante manipolazione della coda e tenuti per 15 s prima di essere restituiti alla loro gabbia.

9. Labirinto Elevato Plus

  1. Configurazione della sala
    1. Posiziona il labirinto al centro della stanza, sotto una fotocamera digitale dotata di una scheda di memoria.
    2. Imposta la luce della stanza a ~ 60 Lux usando 2 lampade da terra posizionate dietro il labirinto.
    3. Spegni l'illuminazione dall'alto per evitare la luce diretta sul labirinto che crea riflessione e interrompe il rilevamento degli animali nel labirinto.
    4. Una volta configurata tutta l'attrezzatura, trasferire gli animali nella stanza e lasciarli acclimatare alle impostazioni di luce e al nuovo ambiente per 30 minuti.
  2. Collaudo
    1. Pulire il labirinto con il 70% di etanolo per evitare odori di polvere o dell'animale che è stato testato in precedenza.
    2. Avviare la fotocamera.
    3. Usa un pezzo di carta con l'ID dell'animale per registrare l'ID sul video, prima di posizionare l'animale nel labirinto (questo faciliterà la corretta identificazione di quale topo viene filmato su ciascun video).
    4. Usa la tecnica di manipolazione appropriata per ogni animale per trasferirlo nel labirinto.
    5. Posiziona il mouse sulla piattaforma centrale, di fronte a un braccio aperto.
    6. Lascia che il mouse esplori l'apparato per 10 minuti, indisturbato.
    7. Dopo 10 minuti, arrestare la fotocamera.
    8. Recupera il mouse dal labirinto e rimettelo nella sua gabbia.
    9. Pulire le feci e l'urina dal labirinto con il 70% di etanolo.
    10. Una volta completato il test con tutti i mouse, trasferire i video dalla scheda di memoria a un computer per il monitoraggio video.
    11. Utilizzando un software di tracciamento automatizzato degli animali, tieni traccia del numero di voci a braccia aperte e chiuse e del tempo trascorso a braccia aperte o chiuse (qui Ethovision XT 14).

10. Interazione dello sperimentatore (derivato da Hurst e West9)

  1. Configurazione della sala
    1. Posizionare un tavolo al centro della sala prove sotto una fotocamera digitale dotata di una scheda di memoria.
    2. Imposta la luce a 50-70 Lux con 4 lampadine posizionate nell'angolo della stanza rivolte verso il soffitto. Spegni l'illuminazione dall'alto per evitare la luce diretta sul labirinto che crea riflessione e interrompe il rilevamento degli animali nell'arena.
    3. Porta gli animali nella stanza.
    4. Lasciateli acclimatare nella stanza per 30 minuti.
  2. Rsperimento
    1. Posizionare la gabbia domestica sotto la fotocamera digitale.
    2. Rimuovere il coperchio.
    3. Rimuovere il materiale di nidificazione e altri arricchimenti che potrebbero interferire con il monitoraggio degli animali.
    4. Avviare la fotocamera.
    5. Usa la scheda della gabbia con l'ID dell'animale per identificare l'animale nel video.
    6. Metti una mano nella gabbia di casa lungo la parete della gabbia nella parte anteriore destra.
      1. Assicurarsi che la testa del gestore non stia bloccando la fotocamera per filmare il mouse.
    7. Avviare un timer.
    8. Tenere la mano immobile per 2 minuti e lasciare che il mouse esplori la mano.
    9. Rimuovere la mano dalla gabbia per 15 s.
    10. Prova a prendere il mouse usando le mani a coppa e registra se il mouse fugge.
    11. Ripeti l'ultimo passaggio fino a cinque volte, ogni 5 secondi o fino a quando il mouse non si lascia prendere.
    12. Registrare il numero di tentativi necessari per prendere il mouse.
    13. Restituire il materiale di nidificazione e l'arricchimento alla gabbia.
    14. Pulire i guanti con etanolo al 70% o cambiare i guanti prima di procedere all'animale successivo.
    15. Dopo il test, trasferire i video dalla scheda di memoria a un computer.
    16. Utilizzando un software di tracciamento video automatizzato, dividere la gabbia in quattro quadranti uguali e registrare il tempo trascorso dal mouse in ciascun quadrante (qui, Ethovision XT 14).

11. Novità alimentazione soppressa

  1. Deprivazione alimentare
    1. 3 giorni prima del test, eseguire un cambio di gabbia completo e ospitare gli animali (è preferibile un singolo alloggiamento per eseguire il test della gabbia domestica).
      NOTA: fornire biancheria da letto fresca rimuove la polvere potenziale o piccoli pezzi di cibo che si accumulano nella lettiera dall'ultimo cambio di gabbia.
    2. Il giorno prima del test, pesare tutti gli animali intorno alle 18:00.
    3. Rimuovere tutto il cibo dalla tramoggia del cibo e assicurarsi che non ci siano pezzi di cibo nella gabbia o nella lettiera.
  2. Configurazione della sala
    1. Posizionare la camera NSF su un tavolo.
    2. Riempire la camera con un sottile strato di lettiera di mais (o altra lettiera diversa dalla lettiera utilizzata nella gabbia domestica degli animali).
    3. Impostare la luce a 70 Lux con 4 lampadine poste nell'angolo del tavolo dove si trova la camera, rivolte verso il soffitto. Spegnere le luci a soffitto per mantenere bassa l'illuminazione della stanza.
    4. Posizionare un pellet di chow standard utilizzato nella struttura, sul lato della camera rivolto verso lo sperimentatore (≈10 cm dal muro).
  3. Collaudo
    1. Al mattino dopo la privazione del cibo, porta gli animali nella stanza 30 minuti prima del test per farli acclimatare alle impostazioni di luce e al nuovo ambiente.
    2. Pesare tutti gli animali per misurare la loro perdita di peso in base al peso misurato il giorno precedente. Gli animali dovrebbero perdere l'8-12% durante la notte per essere in grado di eseguire correttamente il compito.
    3. Ordina gli animali per perdita di peso e selezionali a partire dal mouse che ha perso di più al mouse che ha perso meno peso.
    4. Assicurarsi che la camera sia riempita con lettiera e con un singolo pellet.
    5. Posizionare l'animale sul lato opposto della camera, lontano dal pellet di cibo.
    6. Avviare immediatamente il timer.
    7. Lascia che il mouse esplori la camera per un massimo di 12 minuti.
    8. Misurare la latenza per avvicinarsi e nutrirsi (l'animale deve mordere e mangiare) sul pellet alimentare.
      1. Consideralo un approccio quando l'animale si avvicina al pellet, lo annusa e non morde.
      2. Definisci un morso come quando l'animale inizia a consumare il pellet.
    9. Registra la latenza per avvicinarsi e alimentare il pellet in pochi secondi.
    10. Una volta che il mouse si è nutrito del pellet alimentare, rimuovere il mouse dalla camera.
    11. Scartare la biancheria da letto ma salvare il pellet che verrà utilizzato per testare l'appetito nella gabbia domestica del topo.
    12. Ripristina la camera per l'animale successivo e procedi con l'animale successivo.
    13. 15 minuti dopo il completamento del test nella camera, far cadere il pellet utilizzato durante il test, all'interno della gabbia domestica del topo, contro la parete nella parte anteriore della gabbia.
    14. Misurare la latenza per alimentare il pellet quando il pellet è nella gabbia domestica. Questa è una misura per l'appetito.
      1. È preferibile rimuovere il materiale di nidificazione per assicurarsi che il topo veda il pellet cadere nella sua gabbia.

12. Raccolta del siero e misurazione del corticosterone

  1. Maneggiare gli animali per 1 minuto utilizzando la tecnica assegnata, 15 minuti prima della raccolta del sangue (questo può essere fatto con animali alloggiati in gruppo o singoli ospitati, tenendo presente il rischio di combattimenti quando si raggruppano i topi).
    1. Per i topi gestiti dal tunnel, guidali verso il tunnel, solleva il tunnel dalla gabbia per 1 minuto e sostituisci il topo nella sua gabbia.
    2. Per i topi con la coda, afferrare la base della coda del mouse e rimuovere il mouse dalla sua gabbia. Trasferire il mouse nella manica degli sperimentatori per 1 minuto e riportare il mouse nella sua gabbia maneggiando la coda.
    3. Per i topi maneggiati in 3D, utilizzare le mani a coppa per rimuovere il mouse dalla sua gabbia. Tenere il mouse in mani a coppa per 1 minuto e riportarlo nella sua gabbia.
  2. 15 minuti dopo la manipolazione, procedere con la raccolta del sangue dalla vena sottomandibolare22.
  3. Scollare saldamente il mouse in modo tale che la testa del mouse sia immobilizzata saldamente.
  4. Individua il sito di foratura.
    1. C'è una piccola fossetta glatta lungo la mandibola del viso che può essere utilizzata come punto di riferimento per individuare il sito di puntura. Disegnando una linea tra la base della mascella e questa fossetta, il sito di puntura si trova dietro questa fossetta verso l'orecchio di circa 5 mm, appena dietro la cerniera della mascella.
  5. Tenere un ago pulito da 23 G perpendicolare al sito di puntura e utilizzare un rapido movimento di lancing deciso. La punta dell'ago deve penetrare a una profondità compresa tra 1-2 mm, il sangue scorrerà immediatamente non appena la vena viene perforata.
  6. Raccogliere ~ 150 μL di sangue in tubi di raccolta rivestiti di EDTA e conservare sul ghiaccio.
  7. Applicare una leggera pressione con una garza sterile al sito di puntura per 5 s o più per consentire al sangue di coagulare.
  8. Una volta che il sangue si è coagulato, riportare il topo nella sua gabbia di casa.
  9. Centrifugare il sangue a 4 °C 3.500 x g per 10 min.
  10. Decantare il surnatante.
  11. Conservare il surnatante a -20 °C per le analisi a valle.
  12. Misurare i livelli di corticosterone utilizzando un kit ELISA di corticosterone seguendo il protocollo del produttore.
  13. Utilizzare uno spettrofotometro per leggere i risultati ELISA.

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Representative Results

Due studi separati sono stati condotti con topi C57BL/6. I #1 dello studio includevano maschi di 6 mesi e i #2 dello studio includevano femmine di 2,5 mesi (N = 36 / studio) dei Jackson Laboratories (Cat #000664). I topi sono arrivati nella struttura all'età di 2 mesi. Mentre le femmine #2 sono state maneggiate e testate due settimane dopo l'arrivo, i maschi #1 dello studio sono stati maneggiati e testati solo all'età di 6 mesi (ritardo dovuto alla chiusura della pandemia globale). Durante questo periodo, un topo dello Studio #2 è morto, prima di iniziare a gestire gli esperimenti. Lo studio #1 topi maschi sono stati curati dal personale della struttura per animali. Tutti i topi sono stati mantenuti su un ciclo luce / buio di 12 ore (7:00 ON, 19:00 OFF), dato accesso a cibo e acqua ad libitum. La loro gabbia domestica era piena di giornali riciclati come materiale da letto, così come materiale di nidificazione. I topi sono stati alloggiati individualmente, al fine di limitare il potenziale comportamento agonistico nei maschi ospitati in gruppo durante la sessione di manipolazione o dopo procedure come la raccolta del sangue o i test comportamentali. I topi sono stati randomizzati in tre gruppi: gestione della coda, gestione del tunnel e gestione 3De gestiti in camera aperta secondo il design del rispettivo gruppo (Figura 2). Il gruppo gestito dal tunnel ha ricevuto il tunnel come arricchimento per 1 settimana prima della sessione di manipolazione. Sono stati quindi gestiti per dieci (10) giorni consecutivi, prima dei test comportamentali. Una settimana dopo il completamento delle diverse sessioni di gestione, sono iniziati i test comportamentali. Il giorno 16, i topi sono stati testati nell'EPM e poi nel test di interazione dello sperimentatore. Due giorni dopo, i topi sono stati testati nell'NSF. Infine, il giorno 24, il sangue è stato prelevato 15 minuti dopo una sessione di manipolazione di un minuto dello stesso tipo della manipolazione iniziale.

Per i test comportamentali, gli animali gestiti dal tunnel sono stati trasferiti dalla loro gabbia all'apparato usando il tunnel il più possibile. Tuttavia, per l'esperimento Del labirinto Elevato-Plus, le dimensioni del labirinto hanno reso difficile rimuovere o posizionare gli animali nel labirinto usando il tunnel. In questo caso, gli animali sono stati trasferiti dai tunnel alle mani a coppa e trasportati nel labirinto. I topi maneggiati in 3D sono stati gestiti nel corso dei tre giorni, in concomitanza con i giorni 8-10 di gestione del tunnel (Figura 2). I topi con la coda non erano abituati alla manipolazione, ma erano trattati con la coda durante le interazioni con gli sperimentatori. Durante il periodo dello studio, lo sperimentatore ha eseguito il cambio della gabbia per garantire l'uso della tecnica di manipolazione appropriata utilizzata per ciascun gruppo.

Nel test di interazione con lo sperimentatore, gli animali sono stati testati per la loro volontà di interagire volontariamente con lo sperimentatore e la facilità di manipolazione in un contesto sperimentale (Figura 3). ANOVA eseguito sul numero di tentativi di prelevare il topo dalla gabbia ha mostrato un effetto significativo dell'approccio di manipolazione nello studio #1 maschi (F(2,31)= 6,36, p = 0,004) e nello studio #2 femmine (F(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Le analisi post hoc di Scheffe hanno rivelato che il numero di tentativi necessari per raccogliere i topi è stato significativamente ridotto sia dal 3D (p = 0,0061 nello studio #1 maschi e p = 0,0002 nello studio #2 femmine) che dalla gestione del tunnel (p = 0,04 nello studio #1 maschi e p = 0,003 nello studio #2 femmine), rispetto al gruppo trattato con la coda (Figura 3A). ANOVA eseguito sul tempo trascorso nello stesso quadrante della mano ha mostrato un effetto significativo della manipolazione nello studio #1 maschi (F(2,31)= 5,38, p = 0,009) e nello studio #2 femmine (F(2,33)= 3,5, p = 0,04; Figura 3B). Le analisi post hoc di Scheffe hanno mostrato che lo studio #1 topi maschi trattati con la tecnica di manipolazione 3D hanno trascorso molto più tempo nello stesso quadrante rispetto alla mano dello sperimentatore, rispetto ai topi con manico a coda (p = 0,012). Non ci sono state differenze significative tra i gruppi di gestione nello Studio #2, donne di 2,5 mesi. Il grado di interazione con lo sperimentatore è ulteriormente dimostrato dalle mappe di calore combinate dei punti centrali dei topi (Figura 3C-E). Questi illustrano come i topi maschi maneggiati in 3D di Study #1 trascorso più tempo prossimale alla mano, comprese le aree vicino alla mano, mentre i topi con la coda hanno avuto la minima interazione complessiva con la mano.

Gli effetti della gestione 3D e del tunnel sono stati confrontati con la gestione della coda in due test di comportamenti simili all'ansia, il test di alimentazione soppressa della novità (NSF) e il labirinto plus elevato (EPM). Nel test NSF, ANOVA eseguito sulla latenza per avvicinarsi ha mostrato un effetto della tecnica di manipolazione utilizzata nello studio #1 maschi (F(2,31)= 3,5, p = 0,04). Le analisi post hoc di Scheffe nello Studio #1 maschi hanno mostrato tendenze dai topi maneggiati in 3D (p = 0,08) e dai topi gestiti a tunnel (p = 0,08), con una latenza ridotta all'approccio rispetto ai topi con gestione della coda (Figura 4A). Non sono stati osservati effetti nello studio #2. ANOVA eseguito sulla latenza di avvicinamento nella gabbia domestica del topo (dati non mostrati) non ha mostrato alcun effetto della manipolazione (p = 0,88 nello studio #1 maschi e p = 0,16 nello studio #2 femmine). ANOVA eseguito sul tempo percentuale a braccia aperte nell'EPM ha rivelato un effetto significativo della manipolazione nello studio #2 femmine (F(2,33)= 3,5, p = 0,04). Non sono stati osservati effetti nello studio #1 maschi (F(2,31)=2,1, p=0,1; Figura 4B). Le analisi post hoc di Scheffe hanno rivelato solo una tendenza verso un aumento del tempo trascorso a braccia aperte nei topi gestiti a tunnel dallo studio #2, rispetto ai topi con la coda (p = 0,07). Per quanto riguarda le entrate percentuali a bracciaaperte (Figura 4C),ANOVA non ha rivelato alcun effetto della manipolazione, né nello Studio #1 maschi né nello Studio #2 femmine (F(2,31)= 1,12, p = 0,33; e F(2,33)= 1,3, p = 0,26, rispettivamente). I punteggi comportamentali sono stati riassunti in uno z-score, come in Guilloux et al.23, informando sulla potenziale riduzione dei comportamenti ansiosi rispetto ai topi trattati con la coda (Figura 4D). ANOVA sugli z-score ha mostrato un effetto significativo della manipolazione nello studio #1 maschi (F(2,31)= 5,6, p = 0,008) ma non nello studio #2 femmine (F(2,33)= 1,07, p = 0,35). Le analisi post hoc di Scheffe hanno mostrato che la gestione 3D e la gestione del tunnel hanno ridotto significativamente lo z-score (p = 0,04 e 0,01, rispettivamente), rispetto alla gestione della coda, suggerendo che entrambi gli approcci riducono i comportamenti simili all'ansia nello studio #1 maschi.

Anche i livelli di corticosterone dopo la manipolazione sono stati valutati 15 minuti dopo una breve sessione di manipolazione (Figura 5). ANOVA ha riscontrato un effetto significativo della manipolazione nello studio #2 femmine(F (2,33)= 4,44, p = 0,01), ma non nello studio #1 maschi (F(1,31)= 0,53, p = 0,59). Nello studio #2 femmine, le analisi post hoc hanno rivelato una significativa diminuzione dei livelli di corticosterone nei topi del gruppo di manipolazione 3D rispetto al gruppo di gestione della coda (p = 0,02).

Per determinare se le tecniche di manipolazione hanno avuto un impatto significativo sulla variabilità dei dati ottenuti, abbiamo applicato il test di Bartlett sull'omogeneità della varianza. I nostri risultati non hanno trovato differenze significative nella variabilità nello studio #2 topi femmina tra le misurazioni (% tempo EPM B(2,33)= 4,95, p = 0,087; % voci EPM B(2, 33)= 3,68, p = 0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). Tuttavia, nello studio #1 topi maschi, c'è stata una significativa eterogeneità di varianza nel test NSF (B(2,31)= 8,08, p = 0,0175) e nei livelli misurati di CORT (B(2,32)= 11,63, p = 0,0029), ma non in nessuna delle misure per EPM (% tempo EPM B(2,32)= 1,16, p = 0,56; % Voci EPM B(2,32)= 2,79, p = 0,25). L'uso del test F per confrontare due varianze ha mostrato che nel test NSF la varianza era significativamente ridotta per i maschi #1 studio sia dal 3D (F(1,21)= 4,22, p = 0,04) che dalle tecniche di movimentazione del tunnel (F(1,22)= 4,01; p = 0,03) rispetto alla gestione della coda. Per la concentrazione di CORT dopo la manipolazione, solo la manipolazione 3D ha ridotto significativamente la variabilità (F(1,20)= 9,65, p = 0,0019) rispetto alla manipolazione della coda.

Figure 1
Figura 1. Immagini rappresentative della procedura di gestione 3D.  Le immagini illustrano la procedura di gestione 3D. A) Mano nella gabbia: la mano dello sperimentatore viene posta nella gabbia e tenuta ferma, permettendo al topo di abituarsi alla presenza della mano nella gabbia. B) Mano piatta: alla prima rimozione dalla gabbia, il mouse viene posto sul palmo piatto della mano. Il mouse può camminare liberamente intorno al palmo e muoversi tra le mani piatte adiacenti. C) Rotolo: rilassa il palmo della mano per formare una "tazza" sciolta attorno al mouse. Inclinare delicatamente la tazza nella mano opposta, il mouse dovrebbe muoversi liberamente verso questa mano, se non guidarla delicatamente nell'altra mano. D) Riparo: posizionare il mouse sul bordo della mano, quindi riunire entrambe le mani e formare molto lentamente la coppa attorno al mouse. Il mouse non deve essere trattenuto e deve essere lasciata un'apertura in modo che il mouse possa sfuggire. Tenere premuto per ~ 5-10 s e quindi aprire a mani piatte. E) Testa / Schiena Petting: Mentre il mouse sta esplorando il palmo piatto della mano, accarezza delicatamente il mouse sulla testa e sulla schiena. Questo abitua il topo all'approccio dello sperimentatore dall'alto. F) Nose Poke: Quando il mouse sembra essere abituato alla manipolazione, tentare di toccare delicatamente il mouse direttamente sul muso. Se il mouse non sposta la testa lontano è ben abituato alla manipolazione. G) E' possibile eseguire un pizzico corto (2-3 s) al collo l'ultimo giorno, per misurare l'assuefazione degli animali in caso di futuri interventi che richiedano contesa. Quando sono bituati alla manipolazione, i topi rimangono immobili durante il pizzicamento del collo, mentre i topi non fumatori cercheranno di fuggire ruotando la coda per liberarsi dalla contesa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Progettazione sperimentale.  Dopo l'arrivo nella struttura, i topi maneggiati con la coda non hanno ricevuto assuefazione. I topi con il tunnel sono stati ingobitati ai tunnel nella loro gabbia di casa per una settimana prima dell'inizio della manipolazione. I topi con gestione a tunnel sono stati gestiti con la tecnica di gestione del tunnel per 10 giorni (primo giorno di manipolazione = giorno 1), mentre i topi con gestione 3D sono stati abitati per tre giorni (giorno 8-10). I topi sono stati quindi sottoposti al labirinto plus elevato (EPM) (Giorno 16), al test di interazione dello sperimentatore (Giorno 19), all'alimentazione soppressa dalla novità (Giorno 21) e a una breve sessione di manipolazione seguita dalla raccolta di siero per la misurazione CORT (Giorno 24). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Impatto delle tre tecniche di manipolazione sulla facilità di gestione e sulla volontà di interagire con lo sperimentatore. A) Numero medio di tentativi di prelievo necessari per rimuovere un mouse dalla gabbia. Lo studio #1 maschio (pannello di sinistra, Gestione della coda N = 12, Gestione del tunnel N = 12 e manipolazione 3D N = 11) e Studio #2 topi femmina (pannello destro, N = 12 per gruppo) da entrambi i gruppi a tunnel e gestiti in 3D hanno mostrato una significativa riduzione del numero di tentativi necessari per rimuoverli dalla gabbia rispetto ai topi con la coda. B) Quantità media di tempo trascorso da un animale nello stesso quadrante della gabbia della mano dello sperimentatore. Lo studio #1 topi maschi gestiti con la tecnica 3D ha mostrato un aumento significativo del tempo trascorso nello stesso quadrante della mano dello sperimentatore. C-E) Le mappe di calore medie del punto centrale del topo per tempo rese in Ethovision XT 14, hanno dimostrato visivamente l'aumento dell'esplorazione e dell'interazione con lo sperimentatore dello studio #1 topi maschi gestiti in 3D. Le barre di errore indicano SEM. *p<0.05, **p<0.01 rispetto al gruppo Tail Handled. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 4
Figura 4. Impatto delle tre tecniche di manipolazione su comportamenti simili all'ansia. A) Latenza per avvicinarsi e nutrirsi del pellet nella camera di alimentazione soppressa nella camera di alimentazione soppressa nello studio #1 topi maschi (Gestione della coda N = 12, Gestione del tunnel N = 12 e Gestione 3D N = 11) e nello studio #2 topi femmina (N = 12 / gruppo). I dati dello studio #1 topi maschi nei gruppi di gestione 3D e gestione del tunnel hanno mostrato una tendenza verso una significativa riduzione della latenza per avvicinarsi al pellet. B) Mezzi di % del tempo trascorso a braccia aperte del labirinto più elevato. Non ci sono state differenze significative tra i gruppi nello studio #1 maschi e una tendenza verso più tempo a braccia aperte da parte dello studio #2 le femmine nel gruppo di gestione del tunnel. C) Voci a braccia aperte: non ci sono state differenze significative tra i gruppi nello studio #1 maschi, né nello studio #2 femmine. D) Z-score che riassume i comportamenti ansiosi. Utilizzando i dati presentati in A, B e C, è stato calcolato un punteggio z utilizzando i topi con la coda come riferimento. La diminuzione dello z-score suggerisce una diminuzione dei comportamenti simili all'ansia misurati dai test NSF ed EPM. Lo studio #1 topi maschi gestiti utilizzando la tecnica 3D o tunnel ha mostrato un fenotipo simile all'ansia ridotto rispetto ai topi con la coda. Le barre di errore indicano SEM. *p<0.05 confronto con il gruppo gestito dalla coda. t descrive il livello di significatività di tendenza (p<0,1) rispetto al gruppo trattato con la coda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 5
Figura 5. Livelli di corticosterone dopo la manipolazione.  Il siero è stato raccolto 15 minuti dopo una breve sessione di manipolazione e quindi i livelli di CORT sono stati misurati da ELISA sia nello studio #1 maschio (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 e 3D handling N = 11) che nello studio #2 topi femmina (N = 12 / gruppo). Lo studio #2 topi femmina gestiti tramite la tecnica di manipolazione 3D hanno mostrato livelli ridotti di corticosterone rispetto ai topi gestiti dalla coda. ANOVA nello studio #1 topi maschi non ha raggiunto il significato per le differenze tra i gruppi (p = 0,5). Le barre di errore indicano SEM. *p<0.05 rispetto al gruppo Tail Handled. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1.

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Discussion

Questo studio e lo sviluppo del metodo si basano sull'osservazione che le tecniche di manipolazione nei topi sono ancora trascurate dalla comunità scientifica e che alcuni laboratori sono ancora riluttanti a implementare tecniche di assuefazione o manipolazione per ridurre lo stress e la reattività dei loro animali prima degli esperimenti. Pur rappresentando un impegno di tempo, la manipolazione degli animali fornisce effetti benefici agli animali che possono contribuire al successo degli esperimenti da eseguire e impedisce che gli esperimenti debbano essere eseguiti più volte a causa della variabilità dei dati o dell'eccessiva reattività degli animali. L'uso della tecnica di gestione 3D ha ridotto i tentativi di fuga nei topi. Ha anche aumentato l'interazione con lo sperimentatore e diminuito i fenotipi simili all'ansia nei nostri topi maschi di 6 mesi. Inoltre, la gestione 3D ha ridotto la variabilità dei dati e diminuito i livelli di corticosterone nei topi femmina di 2,5 mesi dopo solo 3 giorni iniziali di manipolazione. Questo approccio si basa su manipolazioni delicate per abituare il mouse alla manipolazione da parte dello sperimentatore facilitando un trasporto più fluido e un intervento più semplice.

Qualcosa che vale la pena sottolineare dalla tecnica di gestione 3D è che la progressione dei metodi di manipolazione avviene in risposta alla reattività del mouse, a seconda del raggiungimento delle pietre miliari sopra descritte e nella Tabella 1. Gli animali dovrebbero aver ridotto la reattività a una fase di manipolazione prima di passare ai passaggi successivi. Tentare di progredire troppo rapidamente verso i passaggi "rifugio" o "nose-poke" su animali che non sono sufficientemente bituati probabilmente comporterebbe un aumento dello stress e potenzialmente ridurrebbe l'efficacia della procedura. Allo stesso modo, la reattività dell'animale in ogni giorno di manipolazione dovrebbe essere monitorata e dovrebbe essere presa in considerazione quando si decide se sono necessari ulteriori giorni di manipolazione. Se gli animali non rispondono bene al test del rifugio il primo giorno, non soddisfacendo i criteri per raggiungere il primo traguardo, il primo giorno di manipolazione potrebbe essere ripetuto fino al completamento della pietra miliare. Allo stesso modo, se gli animali non rispondono al test del naso il secondo giorno, il secondo giorno può anche essere ripetuto. Un altro avvertimento da notare con questo approccio è che il rischio che i topi saltino via è maggiore il primo giorno di manipolazione, in particolare in ceppi saltellanti come C57BL6. Seguire le linee guida sopra descritte dovrebbe ridurre il rischio di saltare e fornire modi per limitare tali comportamenti. La durata della manipolazione e la progressione attraverso le fasi possono variare a seconda dei ceppi, in particolare se si lavora con modelli transgenici noti per esibire fenotipi ansiosi.

Diversi fattori possono contribuire a ridurre l'efficacia della tecnica di gestione 3D presentata. Uno di questi fattori è la potenziale paura o esitazione da parte dello sperimentatore, nel caso in cui lo sperimentatore non abbia familiarità con la manipolazione del topo o abbia paura dei topi. Pertanto, anche l'effetto sul gestore è qualcosa da considerare. Tuttavia, il graduale aumento del livello di interazione con i topi consente agli sperimentatori alle prime armi di sviluppare fiducia e maggiori abilità nell'eseguire la tecnica di manipolazione mentre procedono attraverso le fasi di manipolazione. I passi / pietre miliari proposti (i test del rifugio e del naso) possono aiutare a contrastare la potenziale variabilità umana nei gestori alle prime armi, assicurando che gli animali raggiungano livelli simili di assuefazione. È stato riportato che la promozione di interazioni positive uomo-animale con gli animali aveva portato a una maggiore qualità della vita e alla soddisfazione della compassione nel personale di cura degli animali24. In quanto tale, la delicatezza dalla manipolazione presenta benefici sia per il conduttore che per l'animale durante qualsiasi interazione o intervento generale.

Con il suo impatto sulla diminuzione del numero di tentativi di raccogliere il topo, sia nei maschi di 6 mesi che nelle femmine di 2,5 mesi, la manipolazione 3D fornisce un'alternativa alla gestione del tunnel o ad altre tecniche, facilitando il trasferimento più facile degli animali dalla loro gabbia all'apparato sperimentale. La tecnica di gestione 3D ha anche aumentato l'interazione di topi maschi di 6 mesi con lo sperimentatore. Questo non è stato osservato nei topi femmina di 2,5 mesi, ma i topi femmina sono rimasti più facili da raccogliere, rispetto ai topi con la coda. Ciò suggerisce che la tecnica di gestione 3D potrebbe essere più adatta per esperimenti che richiedono interazioni dirette tra l'animale e lo sperimentatore, come il labirinto d'acqua di Morris (nonostante i potenziali fattori di confusione tra sesso / età discussi in seguito). Altri hanno sviluppato e utilizzato tecniche di movimentazione manuale, consistenti nel raccogliere gli animali con le mani a coppa, senza ulteriori manipolazioni10. Mentre queste tecniche hanno mostrato effetti benefici, i dati in letteratura presentano spesso protocolli di manipolazione con periodi di assuefazione superiori a 10 giorni9,16. Inoltre, la manipolazione a coppa senza l'interazione raffinata fornita dalla manipolazione 3D potrebbe non essere adatta per ceppi saltellanti che continuano a saltare fuori e lontano dalle mani. Anche se non abbiamo fatto un confronto diretto in questo studio con il metodo della tazza, la gestione 3D affronta questo problema e si basa su mosse raffinate per favorire l'interazione tra il mouse e il gestore. Lo studio di Ghosal et al.16 ha utilizzato una tecnica di manipolazione della tazza combinata con il massaggio per 5 giorni e ha dimostrato che questa tecnica limita l'impatto dello stress sugli endpoint metabolici, evidenziando la necessità di movimenti raffinati e interazione durante la manipolazione per una migliore efficacia. Sulla base di questa tecnica di massaggio a tazza, la gestione 3D utilizza un'interazione aggiuntiva per abituare i topi. Utilizzando l'approccio di gestione 3D, i gestori assicurano che tutti i topi raggiungano un livello simile di assuefazione eseguendo mosse standardizzate e adattando la durata della procedura a ciascun animale a seconda delle sue esigenze (nel presente studio, tutti i topi hanno superato le pietre miliari e terminato il protocollo di gestione 3D in 3 giorni). Questo approccio può essere considerato "personalizzato" per ogni topo, in modo che tutti gli animali raggiungano il livello desiderato di assuefazione in ogni giorno di manipolazione. Come accennato in precedenza, se gli animali non raggiungono le pietre miliari descritte nel protocollo, questa tecnica può essere regolata aumentando il numero di giorni. Questa tecnica ha mostrato effetti benefici per ridurre la variabilità tra gli animali negli studi comportamentali e nella misurazione fisiologica (livelli di CORT), suggerendo che questo approccio potrebbe contribuire alla riduzione della variabilità intra-studio e ridurre l'impatto dell'errore sperimentale potenzialmente guidando risultati distorti negli studi preclinici.

I risultati di supporto hanno suggerito che i topi sottoposti a manipolazione 3D e tunnel mostrano un'ansia ridotta nel test di alimentazione soppresso della novità, rispetto ai topi con la coda. Considerando i dati combinati dell'NSF e dell'EPM, entrambi gli approcci hanno mostrato effetti significativi nel ridurre l'ansia nei topi maschi di 6 mesi. Ciò replica i risultati secondo cui gli animali bituati alla gestione del tunnel avevano migliorato le prestazioni nei test per l'ansia9,15 dopo oltre 10 giorni di manipolazione e dimostrano ulteriormente il potenziale della manipolazione 3D di esibire effetti simili. Ciò ha anche dimostrato che i topi maschi di 6 mesi gestiti in 3D si avvicinano e interagiscono volontariamente di più con il loro sperimentatore rispetto ai topi maschi di 6 mesi sottoposti a gestione del tunnel e della coda. È importante sottolineare che i topi femmina di 2,5 mesi sottoposti a manipolazione 3D avevano livelli ridotti di CORT, che è in accordo con i risultati precedentemente pubblicati9. I due studi (Studio #1 in maschi di 6 mesi e Study #2 in femmine di 2,5 mesi) hanno confermato, in due modi diversi, che la manipolazione ha un impatto benefico sui fenotipi ansiosi (sia sui risultati comportamentali nello Studio #1, sia sui livelli di CORT nello Studio #2).

Un possibile fattore che contribuisce all'effetto è il sesso dello sperimentatore, in questo caso maschio. È stato dimostrato da Sorge et al.25 che la presenza di sperimentatori maschi può portare ad un aumento del CORT e comportamenti simili all'ansia nei topi maschi ma non femmine. Ciò è in contrasto con i risultati del presente studio. La principale differenza tra questo studio e lo studio di Sorge et al.25 è che l'approccio qui descritto consiste nell'abituare i topi alla manipolazione, promuovendo l'interazione positiva (non rinforzata) con lo sperimentatore, mentre Sorge et al.25 hanno usato roditori ingenui che non hanno mai interagito con gli esseri umani. Ci si può aspettare che i topi ingenui possano avere una forte reazione contro gli sperimentatori umani se non imparano che lo sperimentatore non rappresenta una minaccia. Tuttavia, il presente studio è stato eseguito solo con uno sperimentatore maschio e studi futuri dovrebbero indagare se tali effetti sono riproducibili con uno sperimentatore femminile. Sebbene l'isolamento di questi fattori sia al di fuori dello scopo di questo documento, vale la pena sottolineare l'importanza di identificare tali fonti di variabilità quando si implementa l'assuefazione della manipolazione o nella progettazione sperimentale più in generale.

Il presente studio ha anche confermato l'efficacia della tecnica di gestione del tunnel nel ridurre i comportamenti ansiosi e i livelli di CORT nei topi9,10,11. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il tunnel può essere lasciato nella gabbia come arricchimento26, che può anche contribuire a ridurre la risposta allo stress / ansia, contribuendo complessivamente a migliorare il benessere10,11. In questo caso, il ruolo dello sperimentatore è quello di manipolare il tunnel solo, con ogni animale, per un minuto. Tuttavia, come descritto da Gouveia et al19, il tunnel non deve necessariamente rimanere nella gabbia di casa e può invece essere presentato agli animali solo quando necessario per trasferire l'animale, senza causare ulteriore stress. Entrambi gli approcci, il tunnel e le tecniche di gestione 3D, offrono vantaggi che dovrebbero essere valutati dal laboratorio e dagli sperimentatori al fine di determinare quale approccio è il più appropriato per le loro esigenze. Nel presente studio, il tunnel è stato lasciato nella gabbia e gli effetti che abbiamo osservato sui comportamenti ansiosi possono essere dovuti a una combinazione di gestione e arricchimento del tunnel.

Mentre entrambi forniscono effetti benefici, le tecniche di gestione 3D e tunnel non sono prive di limitazioni. Una limitazione condivisa è che può richiedere molto tempo e potenzialmente scoraggiare le strutture per animali implementare tali procedure. Tuttavia, i benefici aggiuntivi sono inestimabili, migliorando il benessere degli animali riducendo lo stress e migliorando l'interazione con gli sperimentatore e i fornitori di assistenza agli animali (come descritto in Spangenberg e Kelling27)e l'affidabilità e la riproducibilità della ricerca. Le prove della nostra struttura suggeriscono che questa tecnica migliora le interazioni tra animali e personale zootecnia, facilitando il cambio di gabbia e il monitoraggio della salute. Da altri utenti nella nostra struttura, la contesa e la manipolazione generale sono segnalate come significativamente più facili con i topi maneggiati, in linea con i nostri risultati che i topi trattati con la tecnica 3D hanno meno probabilità di fuggire quando vengono raccolti e nel nostro esempio, i maschi di 6 mesi sono più inclini a interagire con il loro sperimentatore. Studi di follow-up potrebbero quantificare tali effetti per dimostrare ulteriormente l'utilità della tecnica. Complessivamente, questo approccio di gestione 3D, così come l'approccio a tunnel, contribuisce alla regola delle 3R, in particolare perfezionando le interazioni animali di routine per ridurre al minimo lo stress in risposta alla manipolazione. Data la riduzione osservata della variabilità dei dati, ciò ha anche il potenziale per ridurre il numero di animali necessari per ottenere risultati coerenti e perfezionare l'approccio utilizzato per limitare la variabilità.

Un altro punto di discussione basato sui dati presentati è che questo studio è stato eseguito con animali ospitati da un solo punto. L'alloggiamento singolo è stato preferito in quanto limita i potenziali comportamenti agonistici (in particolare nei topi maschi), che possono contribuire alla variabilità interimmaginale28,29. Per coerenza tra i gruppi, tutti gli animali erano alloggiati da solo. È anche interessante notare che le interazioni positive sperimentatore-animale nei ratti sotto forma di solletico di ratto, sono state in grado di mitigare alcuni degli effetti dell'isolamento sociale nei ratti single ospitati30,31. È possibile che le tecniche di manipolazione che coinvolgono il contatto diretto tra animale e sperimentatore, come la tecnica di manipolazione 3D o la tecnica di massaggio a coppa descritta da Ghosal et al.11, possano avere un effetto simile. Studi futuri potrebbero esplorare questa domanda confrontando gli effetti delle tecniche di manipolazione in animali ospitati singoli e di gruppo. Studi precedenti hanno studiato l'impatto degli approcci di gestione di tazze e tunnel con topi in un ambiente ospitato in gruppo e hanno ottenuto risultati simili7,8. Ciò conferma che è possibile utilizzare i protocolli di manipolazione qui descritti con animali tenuti in condizioni di casa singola o di gruppo, tenendo presente la possibilità di un comportamento agonistico quando si toglie un animale dalla gabbia e lo si rimette dentro (in particolare nei topi maschi o in linee di topo aggressive). In questi casi, si consiglia di utilizzare una gabbia temporanea prima di raggruppare tutti gli animali insieme.

Per concludere, l'approccio di gestione 3D proposto contribuisce a ridurre la reattività e lo stress nei topi. Aumenta inoltre l'affidabilità dei dati riducendo la variabilità dopo 3 giorni di gestione. Risultati simili sono osservabili con la gestione del tunnel, nel nostro caso dopo 10 giorni di gestione del tunnel. Rispetto alla tecnica di gestione del tunnel, la tecnica di gestione 3D ha fornito il vantaggio di aumentare l'interazione con uno sperimentatore nei nostri topi maschi di 6 mesi, che in alcuni casi può essere fondamentale. Se la tecnica di gestione 3D o tunnel dovesse essere implementata in tutte le strutture per animali, ciò rappresenterebbe un importante miglioramento per la generazione di dati e contribuirebbe notevolmente alla riduzione dell'uso degli animali nella ricerca.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Comitato per la cura degli animali di CAMH per aver supportato questo lavoro, così come gli animali caregiver di CAMH che hanno fornito un ampio feedback sull'utilità della procedura, motivando l'esecuzione degli esperimenti descritti e la presentazione del protocollo dettagliato per altri utenti. Questo lavoro è stato in parte finanziato da CAMH BreakThrough Challenge, assegnato a TP, e da fondi interni di CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

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Comportamento Numero 175
Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi
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Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

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