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Behavior

Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Este artigo descreve uma técnica de manuseio em camundongos, a técnica de manuseio 3D, que facilita o manuseio rotineiro reduzindo comportamentos semelhantes à ansiedade e apresenta detalhes sobre duas técnicas relacionadas existentes (manuseio de túneis e caudas).

Abstract

Animais de laboratório são submetidos a múltiplas manipulações por cientistas ou prestadores de cuidados com animais. O estresse que isso causa pode ter efeitos profundos no bem-estar animal e também pode ser um fator de confusão para variáveis experimentais, como medidas de ansiedade. Ao longo dos anos, técnicas de manuseio que minimizam o estresse relacionado ao manuseio foram desenvolvidas com um foco especial em ratos, e pouca atenção aos ratos. No entanto, foi demonstrado que os ratos podem ser habituados a manipulações usando técnicas de manuseio. Habituar camundongos ao manuseio reduz o estresse, facilita o manuseio de rotina, melhora o bem-estar animal, diminui a variabilidade dos dados e melhora a confiabilidade experimental. Apesar dos efeitos benéficos do manuseio, a abordagem de captação de cauda, que é particularmente estressante, ainda é amplamente utilizada. Este artigo fornece uma descrição detalhada e demonstração de uma técnica recém-desenvolvida de manuseio de camundongos destinada a minimizar o estresse experimentado pelo animal durante a interação humana. Esta técnica manual é realizada ao longo de 3 dias (técnica de manuseio 3D) e foca na capacidade do animal de habituar ao experimentador. Este estudo também mostra o efeito das técnicas previamente estabelecidas de manuseio de túneis (usando um túnel de policarbonato) e da técnica de captação de cauda. Especificamente estudados são seus efeitos sobre comportamentos semelhantes à ansiedade, usando testes comportamentais (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interação voluntária com experimentadores e medição fisiológica (níveis de corticosterona). A técnica de manuseio 3D e a técnica de manuseio do túnel reduziram fenótipos semelhantes à ansiedade. No primeiro experimento, usando camundongos machos de 6 meses de idade, a técnica de manuseio 3D melhorou significativamente a interação dos experimentadores. No segundo experimento, usando fêmea de 2,5 meses, reduziu os níveis de corticosterona. Como tal, o manuseio 3D é uma abordagem útil em cenários onde a interação com o experimentador é necessária ou preferida, ou onde o manuseio do túnel pode não ser possível durante o experimento.

Introduction

Camundongos e ratos são ativos essenciais para estudos pré-clínicos1,2 para múltiplos fins, incluindo estudos endocrinas, fisiológicos, farmacológicos ou comportamentais2. A partir do crescente número de estudos envolvendo animais, surgiu que variáveis ambientais descontroladas, incluindo a interação humana, influenciam vários desfechos em pesquisas biomédicas3,4,5. Isso é responsável pela variabilidade significativa observada em experimentos e laboratórios de pesquisa4,5, representando uma grande ressalva na pesquisa animal.

Várias abordagens foram implementadas com o objetivo de limitar o impacto dos estressores ambientais e reduzir a reatividade à interação humana. Por exemplo, para limitar o impacto dos estressores ambientais, a padronização das condições de habitação e os sistemas de habitação automatizados6,7 foram implementados em laboratórios. Quanto à interação com os seres humanos, abordagens comumente utilizadas para o manuseio e transporte de animais tinham pouca consideração pelo desconforto e estresse animal. Por exemplo, pegar animais pela cauda ou usar fórceps8 aumenta a ansiedade da linha de base9,10,11, reduz a exploração9,12 e contribui muito para a variabilidade inter-individual dentro e entre os estudos13,14. Como resultado, outras abordagens foram desenvolvidas, como a técnica de manuseio de copos, que é aplicável a ratos e ratos. Nesta abordagem, os animais são "acotosados" para fora de sua gaiola, e mantidos pelos experimentadores com as mãos formando um copo9,10,11. Outra alternativa útil ao manuseio da cauda envolve o uso de um túnel de policarbonato para transferir camundongos9,10,15. Esta abordagem elimina a interação direta entre o mouse e o experimentador. Tanto as abordagens do copo quanto do túnel mostraram eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade e medo do experimentador que pode ser exagerado por técnicas de manuseio aversivo, como o manuseio da cauda9,10.

Portanto, o aumento das evidências demonstra a utilidade do manejo adequado do camundongo para reduzir a variabilidade entre os indivíduos9,11e melhorar o bem-estar animal10. No entanto, as técnicas mencionadas acima ainda enfrentam limitações. A técnica de manuseio do copo foi implementada com horários que variam de 10 dias (10 sessões ao longo de 2 semanas16) até 15 semanas17, o que é uma quantidade considerável de tempo para funcionários e experimentadores de instalações. Além disso, a eficácia do manuseio do copo varia de acordo com a tensão9 e o manuseio convencional do copo em mãos abertas pode levar a ratos ingênuos ou particularmente cepas saltitantes para saltar da mão9,18. O manuseio do túnel resulta em resultados mais consistentes e geralmente mais rápidos na gentling19. Túneis também são usados como enriquecimento de gaiolas domésticas. Eles ajudam os animais a se habituarem a manusear rapidamente e fornecem os benefícios adicionais do enriquecimento. O manuseio do túnel, no entanto, tem limitações na transferência de animais entre aparelhos. Curiosamente, Hurst e West9, e Henderson et al.20 demonstraram que o uso de manuseio manual suave e breve para transferir animais do túnel para o aparelho não afeta seu fenótipo.

Para fornecer uma alternativa aos métodos existentes, com habitação alcançável em um curto período de tempo, este artigo descreve uma nova técnica que se expande na técnica de manuseio do copo, não necessitando, portanto, de nenhum equipamento específico. Esta abordagem usa marcos para medir o nível de conforto que os ratos têm com o processo de manuseio. Mostra eficácia na diminuição da reatividade e estresse do camundongo (nos níveis comportamental e hormonal), facilita o manuseio rotineiro e contribui para reduzir a variabilidade entre os animais. Detalhes dessa técnica são fornecidos aqui, e sua eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade, melhorando a interação com experimentadores e limitando a liberação periférica de hormônio do estresse (corticosterona) são demonstradas em dois estudos separados (camundongos masculinos e femininos), em comparação com técnicas de manuseio de túneis (controle positivo) e controle de cauda (controle negativo).

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Protocol

Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com animais do CAMH e realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

NOTA: O método de manuseio aqui descrito pode ser usado em várias cepas de camundongos, incluindo linhas não transgênicas (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) e linhas transgênicas. Também pode ser usado com camundongos jovens ou velhos, observando que camundongos adultos jovens (4-6 semanas de idade) tendem a ser um pouco mais ativos do que ratos adultos ou velhos, especialmente no primeiro dia.

1. Preparação experimental

  1. Antes do início do estudo, de acordo com as diretrizes do ARRIVE21,atribua aleatoriamente ratos a cada grupo de manuseio (manuseio 3D, manuseio de túneis ou manuseio de cauda).
  2. Identifique a sala para realizar o manuseio. Pode ser realizado na sala de alojamento, ou em uma sala separada. Se o manuseio for realizado em uma sala separada, o que exige que os animais sejam movidos em uma carroça em movimento, permita que os animais se habituam à nova sala por 20-30 minutos antes do início do protocolo de manuseio.
  3. Para animais abrigados em grupo, use uma gaiola temporária para abrigar ratos após o manuseio, antes de reagrupar todos eles em sua gaiola inicial. Isso reduz possíveis brigas entre animais antes do manuseio (particularmente em machos).
  4. Trabalhe em um balcão (preferencialmente uma bancada limpa) ou em um armário de biossegurança, com a gaiola de habitação longe do animal sendo manuseado. A proximidade com a gaiola de habitação aumenta o risco de pular. Se os animais são alojados em grupo, o salto do rato sendo manuseado na gaiola doméstica pode causar estresse aos companheiros de gaiola.
    NOTA: Trabalhar em um armário de biossegurança limita o risco de ratos saltarem no chão, e pode ser necessário em certas instalações. Esta técnica pode ser usada em um armário de biossegurança, certificando-se de sempre executar todos os passos dentro do armário de biossegurança, e evitando ratos andando em antebraços manipuladores.

2. DIA 1: 5 min por mouse

  1. Abra suavemente a gaiola e coloque a tampa ao lado, remova materiais de aninhamento e outros enriquecimentos, como rodas de corrida ou abrigos.
  2. Introduza uma mão aberta enluvada na gaiola de casa, colocando lentamente a mão ao longo de um lado da parede da gaiola (a parede mais próxima do manipulador, Figura 1A).
    1. Não tente imediatamente pegar o mouse.
  3. Mantenha-se imóvel e deixe o animal habituar-se à presença da mão na gaiola por cerca de 30 s.
  4. Tente pegar o rato na palma da mão (ou seja, evite pegar o animal pela cauda).
    1. Se o mouse não for facilmente captado após 3 tentativas, guie o mouse para um canto e copo com ambas as mãos.
    2. Mova suavemente as mãos em direção ao mouse para tentar pegá-lo.
    3. Se não tiver sucesso após um máximo de 3 tentativas com ambas as mãos, pegue o mouse suavemente pela base de sua cauda, e transfira-o para o antebraço ou mão plana.
  5. Com o mouse na mão, mantenha a mão o mais plana e aberta possível.
    NOTA: Isso fornece uma plataforma plana para o mouse pisar e limita o risco de mordidas.
  6. Segurando a mão aberta e plana com a palma da mão para cima, coloque a outra mão adjacente à mão segurando o mouse e deixe o mouse se mover livremente de mão em mão sem qualquer restrição(Figura 1B).
  7. Deixe o mouse explorar e mover-se entre as mãos por 1 minuto.
    1. Neste ponto, os ratos podem tentar pular. Posicione as mãos de tal forma que se o mouse pular, ele vai pousar em uma bancada em vez do chão.
    2. Se um rato parece estar se preparando para saltar (movendo-se em direção à borda da mão e criando em pernas traseiras), lentamente coloque a outra mão na frente dele e tente guiá-lo para caminhar sobre esta mão. Evite movimentos bruscos à medida que aumenta o risco de pular.
    3. Se um mouse pular, tente pegá-lo evitando o manuseio da cauda e retome a sessão de manuseio. Se o mouse ficar no chão ou fora das mãos por mais de 10 s, adicione mais tempo à sessão de manuseio para compensar qualquer momento que o mouse estivesse fora das mãos.
    4. Tome notas do salto. O número total de saltos pode ser usado para avaliar a variabilidade potencial entre os animais.
  8. Após 1 min de manuseio com as mãos planas, relaxe a palma da mão e levemente copo o mouse na mão, antes de rolar suavemente o mouse entre as mãos(Figura 1C).
    1. Para "rolar", posicione o rato na palma da mão, em uma mão plana, perpendicular aos dedos.
    2. Feche lentamente a mão, colocando os dedos na parte de trás do mouse.
    3. Coloque a mão livre diretamente sob a mão segurando o mouse.
    4. Gire/gire lentamente a mão com o mouse para transferir suavemente o mouse para a outra mão (180° flip).
    5. Repita isso para frente e para trás entre as mãos.
  9. Alternar de rolamento suave entre as mãos e exploração livre em mãos abertas para os anos 60, alternando entre técnicas a cada 20 s.
  10. Realizar um "teste de abrigo"(Figura 1D).
    1. Deixe o mouse mover-se para a borda da mão e, em seguida, juntar as 2 mãos.
    2. Muito lentamente, dou-os para que o rato se encaixe dentro de um "abrigo" formado pelas mãos. Deixe uma abertura para que o rato possa escapar se necessário.
    3. Procure manter o rato no abrigo por 5-10 s, sem qualquer restrição.
    4. Alternar entre o teste do abrigo, rolar entre as mãos e a exploração livre de mãos abertas por outros 60 anos, com certeza realizará o passo do abrigo 3 ou mais vezes.
  11. Em todos os procedimentos descritos em 2.10, não apresse o processo. Se o mouse aparecer estressado (ou seja, tentar escapar, pular das mãos, evitar contato com as mãos etc.) por estar confinado dentro das mãos, continuar rolando entre as mãos e exploração livre por 20 s, e depois tentar novamente.
  12. Marco: Realize pelo menos 1 teste de abrigo bem sucedido de 10 s para conclusão do dia 1.
    1. Considere um teste de abrigo bem sucedido quando o rato ficar nas mãos. Se o rato estourar a cabeça e voltar para o abrigo, ainda é um teste bem sucedido. Se o animal sair totalmente do abrigo, é um fracasso.
  13. Permitir a exploração gratuita em mãos por 30 s.
  14. Substitua suavemente o mouse em sua gaiola. Se o grupo estiver alojado, coloque o rato na gaiola temporária até que todos os companheiros de gaiola sejam manipulados. Devolva os ratos para sua gaiola original pegando-os na palma da mão. Não use uma pega-pega de cauda.
  15. Limpe o banco de fezes potenciais e urina com 70% de etanol.
  16. Enxágüe bem as luvas com 70% de etanol (ou solução de limpeza apropriada) ou troque as luvas antes de manusear o próximo mouse (é possível manter as mesmas luvas para os companheiros de gaiola).
    NOTA: Recomenda-se realizar o manuseio com um número razoável de animais para evitar a fadiga do manipulador. O manuseio de 24 ratos leva cerca de 2h e recomenda-se não exceder 24 ratos por manipulador. Se mais animais precisarem ser manuseados, recomenda-se ter vários manipuladores ou dividir os procedimentos de manuseio em subgrupos, ao longo de vários dias.

3. DIA 2: 3 a 5 min por mouse

  1. Tente pegar o rato na palma da mão. Nesta fase, já deve ser viável e os ratos não devem pular da mão.
  2. Comece com a palma da mão aberta como no dia 1, permitindo que o mouse explore livremente por 20 s.
  3. Em seguida, role o mouse entre as mãos algumas vezes (4-5 vezes).
  4. Realize o "teste de abrigo" para 5 s.
  5. Repita o teste de abrigo várias vezes (~5-6) durante um período de 2 a 3 minutos.
  6. Durante o mesmo período de 2 a 3 minutos, alternar com o rolo entre as mãos e a exploração livre das mãos abertas passo a partir do primeiro dia para melhorar a habitação.
    1. Toque o mouse na cabeça e atrás(Figura 1E), 5-6 vezes. Um sinal de habitação é quando o rato permite que você toque nele sem tentar escapar.
    2. Faça um "cutuces do nariz": Tente tocar o focinho do mouse, 2 a 3 vezes(Figura 1F).
      1. Se o rato tentar morder ou mostrar sinais óbvios de estresse ao ser tocado, não tente imediatamente o nariz cutucar novamente. Em vez disso, alternar com exploração de mão plana e rolar. "Habituação" é refletida pelo animal não fugir ou virar a cabeça em casos de contato humano.
  7. Em todos os procedimentos descritos em 3.4-3.6, não apresse o processo. Se o mouse aparecer estressado por estar confinado dentro das mãos ou não quiser ser tocado, continue rolando entre as mãos por 20-30 s e depois tente novamente.
  8. Marcos: Realize pelo menos 1 poke de nariz bem sucedido para 2-3 s para a conclusão do dia 2.
  9. Pare esta sessão após cerca de 3 minutos de manuseio se o animal reagir bem ao "abrigo", "acariciar a cabeça", "cutucar o nariz", e se o rato parece estar disposto a explorar as mãos sem sinais de estresse.
  10. Se o mouse continuar a exibir sinais de estresse ou não estiver reagindo bem ao teste de "teste de abrigo" ou "cutucador de nariz", continue a sessão até chegar a 5 minutos como no dia 1.
  11. Substitua o mouse em sua gaiola, limpe a parte superior do banco e as luvas como no dia 1.

4. DIA 3: Cerca de 3 minutos por mouse

  1. No terceiro dia, siga pelos mesmos passos do dia 2, por 2 a 3 min.
    1. Pegue o rato na palma da mão.
    2. Transfira e role o mouse entre as mãos
    3. Faça um teste de abrigo.
    4. Tente acariciar o rato nas costas e na cabeça.
  2. Alternar entre essas etapas ao longo de aproximadamente 1 a 2 min.
  3. Continue o procedimento até que o rato esteja relaxado o suficiente para sentar na palma da mão sem tentar escapar.
  4. Antes do final do dia 3, repita o teste de abrigo e o teste de cutucada do nariz como um teste de habitação.
    1. Se ambos os testes puderem ser concluídos em sua primeira tentativa, o processo de habitação estará completo. Continue manuseando suavemente o mouse por 30 s a um minuto.
    2. Se o mouse for inicialmente resistente a qualquer teste, repita as etapas 4.1-4.3 para 20-30 s antes de repetir o poke do nariz e o teste de abrigo.
    3. Se o rato permanecer resistente a esses testes após 3 minutos, o terceiro dia pode ser repetido.
  5. Marcos: Realize pelo menos 2 testes de abrigo bem sucedidos de 10 s cada, e 2 testes bem sucedidos de cutucada no nariz para conclusão do dia 3, e conclusão de todo o procedimento de manuseio 3D.
  6. Devolva o rato para sua gaiola, limpe a parte superior do banco e as luvas.

5. Abordagem opcional para que os animais sejam submetidos a contenção para injeção ou gavage

NOTA: No dia 3, se o animal será contido para fins experimentais (gavage oral, injeção intra-peritoneal, etc.), os camundongos podem ser submetidos ao teste de beliscão do pescoço.

  1. Segure a nuca entre o polegar e o dedo indicador(Figura 1G).
  2. Levante o mouse 3-5 cm acima da mão para 2-3 s.
    NOTA: Esta é normalmente uma posição não natural para ratos adultos, e se os ratos permanecem perto de imóveis, eles estão bem habituados ao manuseio e serão fáceis de conter para fins experimentais.
  3. Coloque o mouse de volta na mão plana, ou se o mouse estiver reativo ao aperto do pescoço, considere colocá-lo na manga do experimentador, tampa da gaiola ou bancada
    NOTA: Se trabalhar em um armário de biossegurança, não coloque o mouse na manga ou ele pode subir e sair do armário de biossegurança. Prefira colocar o mouse na bancada dentro do armário de biossegurança.
  4. Deixe o mouse explorar livremente a mão do experimentador por 1 min.

6. Abordagem opcional para dias adicionais de manuseio

  1. Na eventualidade de uma linha de camundongos altamente estressada, adicione dias adicionais para diminuir a reatividade e o nível de estresse dos animais, utilizando os métodos descritos no dia 2/3.
    NOTA: Muitos fatores podem afetar o estresse básico dos animais, incluindo tensão, presença de modificação transgênica, idade, sexo e condições de moradia. Se esses fatores não forem consistentes entre grupos como animais idosos sendo testados contra controles jovens ou animais transgênicos sendo testados contra controles do tipo selvagem, recomenda-se que o mesmo número de dias de habituação seja utilizado para cada grupo.

7. Manuseio de túneis

NOTA: Esta técnica é aplicável apenas aos ratos manuseados pelo Túnel. Os túneis são tubos de policarbonato de aproximadamente 13 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro.

  1. Coloque o túnel na gaiola do rato.
  2. Deixe o túnel na gaiola por 7 dias antes do manuseio.
  3. Abra a gaiola e coloque a tampa ao lado.
  4. Guie suavemente o mouse para dentro do túnel de policarbonato (já na gaiola).
  5. Levante o túnel da gaiola, horizontalmente. Se necessário, cubra livremente as extremidades do túnel para evitar que o animal pule/caia do túnel, potencialmente caindo de volta em sua gaiola ou no chão.
  6. Mova o animal no túnel para longe da gaiola e segure-o longe de qualquer superfície por 30 s.
  7. Coloque o túnel de volta na gaiola de casa, permitindo que o rato saia do tubo.
  8. Aguarde 60 s e repita as etapas 7.4-7.7 uma vez.
  9. Enxágüe bem as luvas com 70% de etanol ou troque as luvas antes de habituar o próximo mouse.
  10. Repita este procedimento por 10 dias consecutivos.

8. Manuseio de cauda

NOTA: Esta técnica é aplicável apenas aos camundongos manuseados por cauda. É usado para transferir ratos de sua gaiola para um aparelho, e vice-versa.

  1. Abra a gaiola e coloque a tampa ao lado.
  2. Segure os ratos pela base da cauda entre o polegar e o dedo indicador.
  3. Levante o rato da gaiola.
  4. Em 2-3 s, transfira o mouse para o antebraço oposto do experimentador, mantendo um aperto na cauda para evitar que o mouse pende.
  5. Quando o manuseio da cauda é necessário na implementação deste experimento (por exemplo, antes de coleta de sangue para testes de cortisol) os animais são transferidos para o antebraço do experimentador por manuseio de cauda e mantidos por 15 s antes de serem devolvidos à gaiola.

9. Labirinto de Mais Elevado

  1. Configuração do quarto
    1. Coloque o labirinto no meio da sala, sob uma câmera digital equipada com um cartão de memória.
    2. Coloque a luz da sala em ~60 Lux usando 2 lâmpadas em pé colocadas atrás do labirinto.
    3. Desligue qualquer iluminação aérea para evitar a luz direta no labirinto que cria reflexão e interrompe a detecção dos animais no labirinto.
    4. Uma vez que todo o equipamento é configurado, transfira os animais para a sala e deixe-os aclimatar-se às configurações de luz e ao novo ambiente por 30 minutos.
  2. Teste
    1. Limpe o labirinto com 70% de etanol para evitar cheiros de poeira ou do animal que foi testado anteriormente.
    2. Ligue a câmera.
    3. Use um pedaço de papel com o ID animal para gravar o ID no vídeo, antes de colocar o animal no labirinto (isso facilitará a identificação adequada de qual rato está sendo filmado em cada vídeo).
    4. Use a técnica de manuseio adequada para cada animal para transferi-lo para o labirinto.
    5. Coloque o mouse na plataforma central, de frente para um braço aberto.
    6. Deixe o mouse explorar o aparelho por 10 minutos, sem ser perturbado.
    7. Depois de 10 minutos, pare a câmera.
    8. Recupere o rato do labirinto e coloque-o de volta em sua gaiola.
    9. Limpe fezes e urina do labirinto com 70% de etanol.
    10. Uma vez que o teste esteja completo com todos os ratos, transfira vídeos do cartão de memória para um computador para rastreamento de vídeo.
    11. Usando um software automatizado de rastreamento animal, rastreie o número de entradas para os braços abertos e fechados, e o tempo gasto em braços abertos ou fechados (aqui Ethovision XT 14).

10. Interação experimentador (derivada de Hurst e West9)

  1. Configuração do quarto
    1. Coloque uma mesa no meio da sala de testes sob uma câmera digital equipada com um cartão de memória.
    2. Coloque a luz em 50-70 Lux com 4 lâmpadas colocadas no canto da sala voltadas para o teto. Desligue a iluminação aérea para evitar a luz direta no labirinto que cria reflexão e interrompe a detecção dos animais na arena.
    3. Leve os animais para o quarto.
    4. Deixe-os aclimatar para o quarto por 30 minutos.
  2. Experimentar
    1. Coloque a gaiola em casa sob a câmera digital.
    2. Retire a tampa.
    3. Remova o material de aninhamento e outros enriquecimentos que possam interferir no rastreamento dos animais.
    4. Ligue a câmera.
    5. Use o cartão da gaiola com a identificação do animal para identificar o animal no vídeo.
    6. Coloque uma mão na gaiola ao longo da parede da gaiola no lado direito da frente.
      1. Certifique-se de que a cabeça do manipulador não está bloqueando a câmera para filmar o mouse.
    7. Comece um temporizador.
    8. Mantenha a mão imóvel por 2 minutos e deixe o mouse explorar a mão.
    9. Retire a mão da gaiola por 15 s.
    10. Tente pegar o mouse usando as mãos e registrar se o mouse foge.
    11. Repita o último passo até cinco vezes, a cada 5 segundos, ou até que o mouse se permita ser pego.
    12. Regisso número de tentativas necessárias para pegar o mouse.
    13. Devolva material de aninhamento e enriquecimento para a gaiola.
    14. Limpe luvas com 70% de etanol ou troque luvas antes de seguir para o próximo animal.
    15. Após o teste, transfira vídeos do cartão de memória para um computador.
    16. Usando um software automatizado de rastreamento de vídeo, divida a gaiola em quatro quadrantes iguais e registe o tempo gasto pelo mouse em cada quadrante (aqui, Ethovision XT 14).

11. Nova alimentação suprimida

  1. Privação de alimentos
    1. 3 dias antes do teste, realize uma mudança completa da gaiola e abriga os animais (a única carcaça é preferível para realizar o teste da gaiola domiciliar).
      NOTA: Fornecer roupa de cama fresca remove poeira potencial ou pequenos pedaços de alimentos acumulados na cama desde a última mudança de gaiola.
    2. Um dia antes do teste, pesam todos os animais por volta das 18h.
    3. Retire todos os alimentos do funil alimentar e certifique-se de que não há pedaços de comida na gaiola ou na cama.
  2. Configuração do quarto
    1. Coloque a câmara NSF sobre uma mesa.
    2. Encha a câmara com uma fina camada de cama de milho (ou outra roupa de cama diferente da cama usada em animais de casa).
    3. Coloque a luz em 70 Lux com 4 lâmpadas colocadas no canto da mesa onde fica a câmara, de frente para o teto. Desligue as luzes aéreas para manter a iluminação baixa do quarto.
    4. Coloque uma pelota de chow padrão usada na instalação, na lateral da câmara de frente para o experimentador (≈10 cm da parede).
  3. Teste
    1. Pela manhã, após a privação de alimentos, leve os animais para a sala 30 minutos antes dos testes para deixá-los se aclimatar às configurações de luz e ao novo ambiente.
    2. Pesar todos os animais para medir sua perda de peso com base no peso medido no dia anterior. Os animais devem perder de 8 a 12% durante a noite para serem capazes de realizar a tarefa corretamente.
    3. Classifique os animais por perda de peso, e trie-os a partir do mouse que mais perdeu para o rato que perdeu menos peso.
    4. Certifique-se de que a câmara está cheia de roupa de cama e com uma única pelota.
    5. Coloque o animal do lado oposto da câmara, longe da pelota de comida.
    6. Inicie o temporizador imediatamente.
    7. Deixe o mouse explorar a câmara por até 12 minutos.
    8. Meça a latência para se aproximar e alimentar (o animal deve morder e comer) na pelota de alimentos.
      1. Considere que é uma abordagem quando o animal se aproxima da pelota, cheira e não morde.
      2. Defina uma mordida como quando o animal começa a consumir a pelota.
    9. Regissua a latência para se aproximar e se alimentar da pelota em segundos.
    10. Uma vez que o rato tenha se alimentado da pelota de comida, remova o rato da câmara.
    11. Descarte a cama, mas guarde a pelota que será usada para testar o apetite na gaiola do mouse.
    12. Reinicie a câmara para o próximo animal e prossiga com o próximo animal.
    13. 15 min após a conclusão do teste na câmara, solte a pelota usada durante o teste, dentro da gaiola do mouse, contra a parede na frente da gaiola.
    14. Meça a latência para se alimentar da pelota quando a pelota estiver na gaiola. Esta é uma medida para a unidade de apetite.
      1. É preferível remover o material de aninhamento para garantir que o rato veja a pelota sendo deixada cair em sua gaiola.

12. Coleta de Soro e Medição de Corticosterona

  1. Manuseie animais por 1 min usando a técnica atribuída, 15 minutos antes da coleta de sangue (isso pode ser feito com animais alojados em grupo ou alojados, tendo em mente o risco de lutas ao reagrupar camundongos).
    1. Para o túnel manuseado ratos, guie-os até o túnel, levante o túnel da gaiola por 1 minuto, e substitua o rato em sua gaiola.
    2. Para ratos manuseados na cauda, pegue a base traseira do mouse e remova o mouse de sua gaiola. Transfira o mouse para a manga dos experimentadores por 1 min, e devolva o mouse para sua gaiola por manuseio da cauda.
    3. Para ratos manuseados em 3D, use as mãos com as mãos para remover o mouse de sua gaiola. Segure o rato em mãos com as mãos por 1 min, e devolva-o à sua gaiola.
  2. 15 min após o manuseio, proceda com coleta de sangue da veia submandibular22.
  3. Escroto firmemente do mouse de tal forma que a cabeça do mouse esteja firmemente imobilizada.
  4. Localize o local da punção.
    1. Há uma pequena covinha sem cabelo ao longo da mandíbula do rosto que pode ser usada como um marco para localizar o local da punção. Desenhando uma linha entre a base da mandíbula e esta covinha o local da punção está atrás desta covinha em direção à orelha por cerca de 5 mm, logo atrás da dobradiça da mandíbula.
  5. Segure uma agulha limpa de 23 G perpendicular ao local da punção e use um movimento de lancing firme rápido. A ponta da agulha deve penetrar em uma profundidade entre 1-2 mm, o sangue fluirá imediatamente assim que a veia for perfurada.
  6. Colete ~150 μL de sangue em tubos de coleta revestidos EDTA e armazene no gelo.
  7. Aplique uma leve pressão com uma gaze estéril no local da punção por 5 s ou mais para permitir que o sangue coagula.
  8. Uma vez que o sangue tenha coagulado, devolva o rato para sua gaiola.
  9. Centrifugar sangue a 4 °C 3.500 x g por 10 min.
  10. Decantar o supernatante.
  11. Armazene o supernatante a -20 °C para análises a jusante.
  12. Meça os níveis de corticosterona usando um kit ELISA corticosterona seguindo o protocolo do fabricante.
  13. Use um espectrômetro para ler os resultados ELISA.

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Representative Results

Dois estudos separados foram realizados com camundongos C57BL/6. O estudo #1 incluiu homens de 6 meses de idade e #2 de estudo incluiu mulheres de 2,5 meses de idade (N=36/estudo) dos Laboratórios Jackson (Cat #000664). Os ratos chegaram à instalação aos 2 meses de idade. Enquanto o Estudo #2 fêmeas foram tratadas e testadas duas semanas após a chegada, o Estudo #1 os machos só foram tratados e testados aos 6 meses de idade (atraso devido à paralisação pandêmica global). Durante esse tempo, um rato de Study #2 morreu, antes de começar a manusear experimentos. O Estudo #1 camundongos machos foram atendidos por funcionários de estabelecimentos animais. Todos os camundongos foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 horas (7:00 ON, 19:00 OFF), tendo acesso a alimentos e ad libitumde água . Sua gaiola de origem estava cheia de jornal reciclado como material de cama, bem como material de aninhamento. Os camundongos foram alojados individualmente, a fim de limitar o comportamento potencial agonístico em homens abrigados em grupo durante a sessão de manuseio ou após procedimentos como coleta de sangue ou testes comportamentais. Os camundongos foram randomizados em três grupos: manuseio de cauda, manuseio de túnel e manuseio 3D, e manuseados na sala aberta de acordo com o projeto de seu respectivo grupo (Figura 2). O grupo manuseado pelo túnel recebeu o túnel como um enriquecimento por uma semana antes da sessão de manuseio. Em seguida, foram tratados por dez (10) dias consecutivos, antes dos testes comportamentais. Uma semana após a conclusão das diferentes sessões de manuseio, os testes comportamentais começaram. No dia 16, os camundongos foram testados no EPM e, em seguida, no teste de interação do experimentador. Dois dias depois, os ratos foram testados no NSF. Finalmente, no dia 24, o sangue foi extraído 15 min após uma sessão de manuseio de um minuto do mesmo tipo que o manuseio inicial.

Para testes comportamentais, animais manuseados por túneis foram transferidos de sua gaiola para o aparelho usando o túnel o máximo possível. No entanto, para o experimento Elevated-Plus Maze, as dimensões do labirinto dificultaram a remoção ou colocação de animais no labirinto usando o túnel. Neste caso, os animais foram transferidos de túneis para mãos acotodas, e transportados para o labirinto. Os camundongos manuseados em 3D foram manuseados ao longo dos três dias, concomitantemente com os dias 8-10 de manuseio do túnel(Figura 2). Os camundongos manuseados de cauda não estavam habituados ao manuseio, mas eram manuseados pela cauda durante as interações com experimentadores. Durante o período do estudo, a mudança da gaiola foi realizada pelo experimentador para garantir o uso da técnica de manuseio adequada utilizada para cada grupo.

No teste de interação do experimentador, os animais foram testados por sua vontade de interagir voluntariamente com o experimentador e a facilidade de manuseio em um contexto experimental(Figura 3). A ANOVA realizada no número de tentativas de retirada do camundongo da gaiola mostrou um efeito significativo da abordagem de manuseio em Estudo #1 machos (F(2,31)=6,36, p=0,004) e em Estudo #2 fêmeas (F(2,33)=12,21, p=0,0001). As análises pós-hoc de Scheffe revelaram que o número de tentativas necessárias para pegar os camundongos foi significativamente reduzido tanto pelo 3D (p=0,0061 em Estudo #1 machos, e p=0,0002 em Estudo #2 fêmeas) e manuseio de túneis (p=0,04 em Estudo #1 machos, e p=0,003 em Estudo #2 fêmeas), em comparação com o grupo manuseado de cauda(Figura 3A). A ANOVA realizada no tempo gasto no mesmo quadrante que a mão mostrou efeito significativo do manuseio em Estudo #1 machos(F (2,31)=5,38, p=0,009) e em Estudo #2 fêmeas (F(2,33)=3,5, p=0,04; Figura 3B). As análises pós-hoc de Scheffe mostraram que o Estudo #1 camundongos machos manuseados com a técnica de manuseio 3D passou significativamente mais tempo no mesmo quadrante do que a mão do experimentador, em comparação com ratos manuseados na cauda (p=0,012). Não houve diferenças significativas entre os grupos de manejo em #2 de Estudos, mulheres de 2,5 meses. O grau de interação com o experimentador é ainda demonstrado pelos mapas de calor combinados dos pontos centrais dos camundongos (Figura 3C-E). Estes ilustram como os camundongos machos manuseados em 3D do Study #1 passaram mais tempo proximal à mão, incluindo áreas próximas à mão, enquanto os camundongos manuseados pela cauda tiveram a menor interação global com a mão.

Os efeitos do manuseio de 3D e túnel foram comparados ao manuseio da cauda em dois testes de comportamentos semelhantes à ansiedade, o teste de alimentação suprimida da novidade (NSF) e o elevado labirinto plus (EPM). No teste de NSF, a ANOVA realizada na latência para abordagem mostrou efeito da técnica de manuseio utilizada no Estudo #1 do sexo masculino(F (2,31)=3,5, p=0,04). As análises pós-hoc de Scheffe em Estudo #1 machos mostraram tendências de camundongos manuseados em 3D (p=0,08) e dos camundongos manuseados por túnel (p=0,08), com latência reduzida à aproximação em comparação com camundongos manuseados por cauda(Figura 4A). Não foram observados efeitos no Estudo #2. A ANOVA realizada na latência para abordagem na gaiola domiciliar do camundongo (dados não mostrados) não mostrou efeito do manuseio (p=0,88 em Estudo #1 machos e p=0,16 em Estudo #2 fêmeas). A ANOVA realizada no tempo percentual em braços abertos no EPM revelou um efeito significativo do manuseio em Estudo #2 fêmeas (F(2,33)=3,5, p=0,04). Não foram observados efeitos no Estudo #1 do sexo masculino(F (2,31)=2,1, p=0,1; Figura 4B). As análises pós-hoc de Scheffe só revelaram uma tendência para o aumento do tempo gasto em braços abertos em camundongos manipulados por túnel do Study #2, em comparação com ratos manuseados de cauda (p=0,07). Quanto às entradas por cento no braços abertos(Figura 4C),a ANOVA não revelou nenhum efeito do manuseio, nem no Estudo #1 homens nem no Estudo #2 fêmeas (F(2,31)=1,12, p=0,33; e F(2,33)=1,3, p=0,26, respectivamente). Os escores comportamentais foram resumidos em um escore z, como em Guilloux et al.23, informando sobre a redução potencial de comportamentos semelhantes à ansiedade em comparação com camundongos manuseados de cauda(Figura 4D). ANOVA nos escores z mostrou um efeito significativo do manuseio em Estudo #1 do sexo masculino(F (2,31)=5,6, p=0,008), mas não no Estudo #2 fêmeas (F(2,33)=1,07, p=0,35). As análises pós-hoc de Scheffe mostraram que o manuseio 3D e o manuseio de túneis diminuíram significativamente a pontuação z (p=0,04 e 0,01, respectivamente), em comparação com o manuseio da cauda, sugerindo que ambas as abordagens reduzem comportamentos semelhantes à ansiedade em Estudo #1 homens.

Os níveis de corticosterona após o manuseio também foram avaliados 15 minutos após uma breve sessão de manuseio(Figura 5). A ANOVA encontrou um efeito significativo do manuseio em Estudo #2 fêmeas (F(2,33)=4,44, p=0,01), mas não em Estudo #1 machos (F(1,31)=0,53, p=0,59). No Estudo #2 fêmeas, as análises pós-hoc revelaram uma diminuição significativa nos níveis de corticosterona em camundongos do grupo de manuseio 3D em comparação com o grupo de manuseio de cauda (p=0,02).

Para determinar se as técnicas de manuseio tiveram um impacto significativo na variabilidade dos dados obtidos, aplicamos o teste de homogeneidade de variância de Bartlett. Nossos resultados não encontraram diferença significativa na variabilidade no Estudo #2 camundongos do sexo feminino em medições (% tempo EPM B(2,33)=4,95, p=0,087; % Entradas EPM B(2, 33)=3,68, p=0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). No entanto, no estudo #1 camundongos do sexo masculino, houve uma heterogeneidade significativa de variância no teste NSF(B (2,31)=8,08, p=0,0175) e nos níveis de CORT medidos(B (2,32)=11,63, p=0,0029), mas não em nenhuma das medidas para EPM (tempo epm b(2,32)=1,16, p=0,56; % Entradas EPM B(2,32)=2,79, p=0,25). O uso do teste F para comparar duas variâncias mostrou que no teste de NSF a variância foi significativamente reduzida para estudo #1 machos tanto pelo 3D(F (1,21)=4,22, p=0,04) quanto para as técnicas de manuseio de túneis (F(1,22)=4,01;p=0,03) em comparação com o manuseio da cauda. Para a concentração de CORT após o manuseio, apenas o manuseio 3D reduziu significativamente a variabilidade (F(1,20)=9,65, p=0,0019) em comparação com o manuseio da cauda.

Figure 1
Figura 1. Imagens representativas do Procedimento de Manuseio 3D.  As imagens ilustram o procedimento de manuseio 3D. R) Mão na gaiola: A mão do experimentador é colocada na gaiola e mantida parada, permitindo que o rato se habituar à presença da mão na gaiola. B) Mão plana: após a primeira remoção da gaiola, o mouse é colocado na palma da mão plana. O rato pode andar livremente ao redor da palma da mão e mover-se entre as mãos planas adjacentes. C) Role: Relaxe a palma da mão para formar um "copo" solto ao redor do mouse. Incline suavemente o copo para a mão oposta o mouse deve mover-se livremente para esta mão, se não guiá-lo suavemente para a outra mão. D) Abrigo: posicione o mouse na borda da mão e, em seguida, recomponha as duas mãos e forma lentamente o copo ao redor do mouse. O mouse não deve ser contido e uma abertura deve ser deixada para que o mouse possa escapar. Segure por ~5-10 s e depois abra para as mãos planas. E) Head/Back Petting: Enquanto o mouse está explorando a palma plana da mão, acaricie suavemente o mouse na cabeça e nas costas. Isso habita o mouse à aproximação do experimentador de cima. F) Cutucador de nariz: Quando o mouse parece estar habituado ao manuseio, tente tocar suavemente o mouse diretamente no focinho. Se o mouse não mover a cabeça para longe, ele está bem habituado ao manuseio. G) É possível realizar uma pequena (2-3 s) beliscão no pescoço no último dia, para medir a habituação dos animais em caso de futuras intervenções que exijam contenção. Quando habituados ao manuseio, os ratos permanecem imóveis durante a beliscão do pescoço, enquanto ratos não habitados tentarão escapar girando sua cauda para serem libertados da disputa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Design Experimental.  Após a chegada na instalação, os ratos manuseados de cauda não receberam nenhuma habituação. Ratos manuseados por túneis foram habituados aos túneis em sua gaiola por uma semana antes do início do manuseio. Os ratos manuseados pelo túnel foram manuseados com a técnica de manuseio do túnel por 10 dias (Primeiro dia de manuseio = Dia 1), enquanto os ratos manuseados em 3D foram habituados por três dias (dia 8-10). Os camundongos foram então submetidos ao labirinto mais elevado (EPM) (Dia 16), teste de interação experimentador (Dia 19), alimentação suprimida de novidades (Dia 21), e uma breve sessão de manuseio seguida de coleta de soro para medição de CORT (Dia 24). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Impacto das três técnicas de manuseio na facilidade de manuseio e disposição para interagir com o experimentador. A) Número médio de tentativas de recolhimento necessárias para remover um rato da gaiola. Estudo #1 Macho (painel esquerdo, Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 e 3D handling N=11) e Study #2 fêmea (painel direito, N=12 por grupo) camundongos de ambos os grupos de túnel e manuseados em 3D apresentaram uma redução significativa no número de tentativas necessárias para removê-los da gaiola em comparação com ratos manuseados de cauda. B) Tempo médio gasto por um animal no mesmo quadrante da gaiola que a mão do experimentador. Estudo #1 camundongos machos tratados com a técnica 3D mostraram um aumento significativo no tempo gasto no mesmo quadrante que a mão do experimentador. C-E) Mapas de calor médios do mouse ponto central por tempo renderizados no Ethovision XT 14, demonstraram visualmente o aumento da exploração e interação com o experimentador do Estudo #1 camundongos machos manuseados em 3D. As barras de erro indicam SEM. *p<0,05, **p<0,01 em comparação com o grupo Tail Handled. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 4
Figura 4. Impacto das três técnicas de manuseio em comportamentos parecidos com ansiedade. A) Latência para abordagem e alimentação da pelota na câmara de alimentação suprimida da novidade em Estudo #1 camundongos machos (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 e 3D handling N=11) e em Study #2 camundongos fêmeas (N=12/grupo). Dados do Estudo #1 camundongos machos nos grupos de manuseio 3D e manuseio de túneis mostraram uma tendência de redução significativa da latência para se aproximar da pelota. B) Meios de % de tempo gasto nos braços abertos do labirinto mais elevado. Não houve diferenças significativas entre os grupos no Estudo #1 homens, e uma tendência para mais tempo em braços abertos pelo Estudo #2 fêmeas no grupo de manuseio de túneis. C) Inscrições de braços abertos: Não houve diferenças significativas entre os grupos em Estudo #1 homens, nem no Estudo #2 mulheres. D) Pontuação Z resumindo os comportamentos semelhantes à ansiedade. Utilizando os dados apresentados em A, B e C, calculou-se como referência um escore z utilizando-se os camundongos manuseados por cauda. A diminuição do escore z sugere uma diminuição dos comportamentos semelhantes à ansiedade medidos pelos testes de NSF e EPM. Estudo #1 camundongos machos manipulados usando a técnica 3D ou túnel mostraram um fenótipo semelhante à ansiedade reduzido em comparação com camundongos manuseados por cauda. As barras de erro indicam SEM. *p<0.05 comparação com o grupo manuseado por cauda. t retrata o nível de significância da tendência (p<0.1) em comparação com o grupo manuseado de cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5. Níveis de corticosterona após o manuseio.  O soro foi coletado 15 min após uma breve sessão de manuseio e, em seguida, os níveis de CORT foram medidos por ELISA em ambos os estudos #1 masculino (Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 e 3D handling N=11) e em Study #2 camundongos femininos (N=12/grupo). Estudo #2 camundongos fêmeas manuseados através da técnica de manuseio 3D mostrou níveis reduzidos de corticosterona em comparação com camundongos manuseados pela cauda. A ANOVA em Estudo #1 camundongos machos não atingiram significância para diferenças entre os grupos (p=0,5). As barras de erro indicam SEM. *p<0,05 em comparação com o grupo Tail Handled. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1.

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Discussion

Este estudo e o desenvolvimento de métodos baseiam-se na observação de que as técnicas de manuseio em camundongos ainda são negligenciadas pela comunidade científica, e que alguns laboratórios ainda estão relutantes em implementar técnicas de habitação ou manuseio para reduzir o estresse e a reatividade de seus animais antes dos experimentos. Ao mesmo tempo em que representa um compromisso de tempo, o manejo animal proporciona efeitos benéficos aos animais que podem contribuir para o sucesso dos experimentos a serem realizados e impede que os experimentos tenham que ser realizados várias vezes devido à variabilidade dos dados ou à super-reatividade animal. O uso da técnica de manuseio 3D diminuiu as tentativas de fuga em camundongos. Também aumentou a interação com o experimentador e diminuiu fenótipos semelhantes à ansiedade em nossos camundongos machos de 6 meses de idade. Além disso, o manuseio 3D diminuiu a variabilidade dos dados e diminuiu os níveis de corticosterona em camundongos do sexo feminino de 2,5 meses após apenas 3 dias iniciais de manuseio. Esta abordagem se baseia em manipulações suaves para habituar o mouse ao manuseio pelo experimentador facilitando um transporte mais suave e uma intervenção mais fácil.

Algo que vale a pena enfatizar a partir da técnica de manuseio 3D é que a progressão dos métodos de manuseio ocorre em resposta à reatividade do mouse, dependendo da realização dos marcos descritos acima e na Tabela 1. Os animais devem ter reduzido a reatividade a um passo de manuseio antes de progredir para os próximos passos. Tentar progredir muito rapidamente para os passos de "abrigo" ou "cutucador de nariz" em animais que não são suficientemente habituados provavelmente resultaria em aumento do estresse e potencialmente reduziria a eficácia do procedimento. Da mesma forma, a reatividade do animal em cada dia de manuseio deve ser monitorada e deve ser considerada na hora de decidir se são necessários dias adicionais de manuseio. Se os animais não responderem bem ao teste de abrigo no primeiro dia, não atendendo aos critérios para alcançar o primeiro marco, o primeiro dia de manuseio pode ser repetido até a conclusão do marco. Da mesma forma, se os animais não responderem ao teste de cutucada no nariz no segundo dia, o segundo dia também pode ser repetido. Outra ressalva a ser notada com essa abordagem é que o risco de ratos saltarem para longe é maior no primeiro dia de manuseio, em particular em cepas saltitantes como C57BL6. Seguir as diretrizes descritas acima deve reduzir o risco de salto e fornecer maneiras de limitar tais comportamentos. A duração do manuseio e progressão através das etapas pode variar dependendo das cepas, particularmente se trabalhar com modelos transgênicos conhecidos por exibir fenótipos ansiosos.

Vários fatores podem contribuir para reduzir a eficácia da técnica de manuseio 3D apresentada. Um desses fatores é o medo potencial ou hesitação do experimentador, no caso do experimentador não estar familiarizado com o manuseio do rato, ou ter medo de ratos. Portanto, o efeito sobre o manipulador também é algo a considerar. No entanto, o aumento gradual do nível de interação com os camundongos permite que os experimentadores novatos desenvolvam confiança e maiores habilidades na realização da técnica de manuseio à medida que prosseguem através das etapas de manuseio. As etapas/marcos propostos (os testes de abrigo e cutucada no nariz) podem ajudar a combater a potencial variabilidade humana em manipuladores iniciantes, garantindo que os animais atinjam níveis semelhantes de habitação. Foi relatado que a promoção de interações positivas entre humanos e animais com animais resultou em maior qualidade de vida e satisfação de compaixão na equipe de cuidados com animais24. Como tal, o manuseio apresenta benefícios tanto para o manipulador quanto para o animal durante qualquer interação geral ou intervenção.

Com seu impacto na diminuição do número de tentativas de recolhimento do camundongo, tanto em machos de 6 meses quanto em fêmeas de 2,5 meses, o manuseio 3D fornece uma alternativa ao manuseio de túneis ou outras técnicas, facilitando a transferência mais fácil de animais de sua gaiola para aparelhos experimentais. A técnica de manuseio 3D também aumentou a interação de camundongos machos de 6 meses de idade com o experimentador. Isso não foi observado em camundongos fêmeas de 2,5 meses, mas os camundongos fêmeas permaneceram mais fáceis de pegar, em comparação com camundongos manuseados por cauda. Isso sugere que a técnica de manuseio 3D pode ser mais adequada para experimentos que requerem interações diretas entre o animal e o experimentador, como o labirinto de água de Morris (apesar de potenciais fatores de confusão sexo/idade discutidos posteriormente). Outros desenvolveram e utilizaram técnicas de manuseio manual, que consistem em pegar os animais com as mãos com as mãos, sem manipulação adicional10. Embora essas técnicas apresentassem efeitos benéficos, os dados na literatura frequentemente apresentam protocolos de manuseio com períodos de habitação superiores a 10 dias9,16. Além disso, o manuseio com um copo sem a interação refinada fornecida pelo manuseio 3D pode não ser adequado para cepas saltitantes que continuam a saltar para fora e para longe das mãos. Embora não tenhamos feito uma comparação direta neste estudo com o método do copo, o manuseio 3D aborda isso e conta com movimentos refinados para promover a interação entre o mouse e o manipulador. O estudo de Ghosal et al.16 utilizou uma técnica de manuseio de copos combinada com massagem por 5 dias, e mostrou que essa técnica limita o impacto do estresse nos pontos finais metabólicos, destacando a necessidade de movimentos refinados e interação durante o manuseio para melhor eficácia. Com base nesta técnica de massagem de copo, o manuseio 3D usa interação adicional para habituar ratos. Usando a abordagem de manuseio 3D, os manipuladores garantem que todos os ratos atinjam um nível semelhante de habitação realizando movimentos padronizados e adaptando a duração do procedimento a cada animal, dependendo de sua necessidade (no presente estudo, todos os ratos passaram dos marcos e terminaram o protocolo de manuseio 3D em 3 dias). Essa abordagem pode ser considerada "personalizada" para cada rato, para que todos os animais atinjam o nível desejado de habituação em cada dia de manuseio. Como mencionado anteriormente, se os animais não atingirem os marcos descritos no protocolo, essa técnica pode ser ajustada aumentando o número de dias. Esta técnica mostrou efeitos benéficos para a redução da variabilidade entre animais em estudos comportamentais e medição fisiológica (níveis de CORT), sugerindo que essa abordagem poderia contribuir para a redução da variabilidade intra-estudo e reduzir o impacto do erro experimental potencialmente conduzindo resultados tendenciosos em estudos pré-clínicos.

Os resultados de apoio sugeriram que os camundongos submetidos ao manuseio em 3D e túnel apresentam ansiedade reduzida no teste de alimentação suprimido da novidade, em comparação com camundongos manuseados por cauda. Considerando dados combinados do NSF e do EPM, ambas as abordagens mostraram efeitos significativos na redução da ansiedade em camundongos do sexo masculino de 6 meses. Isso replica os achados de que os animais habituados ao manuseio de túneis tiveram melhor desempenho em testes de ansiedade9,15 após mais de 10 dias de manuseio, e demonstram ainda mais o potencial do manuseio 3D para apresentar efeitos semelhantes. Isso também mostrou que camundongos machos de 6 meses de idade tratados em 3D se aproximam e interagem voluntariamente mais com seu experimentador do que camundongos machos de 6 meses de idade submetidos ao manuseio de túneis e caudas. É importante ressaltar que camundongos do sexo feminino de 2,5 meses submetidos ao manuseio 3D apresentaram níveis reduzidos de CORT, o que está de acordo com os resultados publicados anteriormente9. Os dois estudos (Estudo #1 em homens de 6 meses de idade e Estudo #2 em mulheres de 2,5 meses) confirmaram, de duas maneiras diferentes que o manuseio tem impacto benéfico sobre fenótipos semelhantes à ansiedade (seja sobre os desfechos comportamentais em estudo #1, ou sobre os níveis de CORT em Estudo #2).

Um possível fator contribuinte para o efeito é o sexo do experimentador, neste caso masculino. Foi demonstrado por Sorge et al.25 que a presença de experimentadores masculinos pode levar a um aumento no CORT e ansiedade como comportamentos em camundongos machos, mas não femininos. Isso contrasta com os resultados do presente estudo. A grande diferença entre este estudo e o estudo de Sorge et al.25 é que a abordagem descrita aqui consiste em habituar os camundongos ao manuseio, promovendo interação positiva (não reforçada) com o experimentador, enquanto Sorge et al.25 usaram roedores ingênuos que nunca interagiram com seres humanos. Pode-se esperar que ratos ingênuos possam ter uma forte reação contra os experimentadores humanos se não souberem que o experimentador não representa uma ameaça. No entanto, o presente estudo foi realizado apenas com um experimentador masculino, e estudos futuros devem investigar se tais efeitos são reprodutíveis com uma experimentador fêmea. Embora isolar esses fatores esteja fora do escopo deste artigo, vale ressaltar a importância de identificar tais fontes de variabilidade ao implementar o manuseio da habituação, ou em design experimental de forma mais geral.

O presente estudo também confirmou a eficácia da técnica de manuseio de túneis na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade e níveis de CORT em camundongos9,10,11. Um benefício adicional dessa abordagem é que o túnel pode ser deixado na gaiola como enriquecimento26, o que também pode contribuir para uma redução do estresse/resposta à ansiedade, contribuindo completamente para a melhoria do bem-estar10,11. Neste caso, o papel do experimentador é manipular o túnel apenas, com cada animal, por um minuto. No entanto, como descrito por Gouveia et al19, o túnel não precisa necessariamente permanecer na gaiola doméstica e, em vez disso, pode ser apresentado aos animais apenas quando necessário para transferir o animal, sem causar estresse adicional. Ambas as abordagens, o túnel e as técnicas de manuseio 3D, oferecem benefícios que devem ser avaliados pelo laboratório e pelos experimentadores, a fim de determinar qual abordagem é a mais adequada para suas necessidades. No presente estudo, o túnel foi deixado na gaiola, e os efeitos observados em comportamentos semelhantes à ansiedade podem ser devido a uma combinação de manuseio e enriquecimento do túnel.

Embora ambos forneçam efeitos benéficos, as técnicas de manuseio de 3D e túnel não são sem limitações. Uma limitação compartilhada é que pode ser demorado e potencialmente desanimador para as instalações animais implementarem tais procedimentos. No entanto, os benefícios adicionais são inestimáveis, melhorando o bem-estar animal reduzindo o estresse e melhorando a interação com experimentador e prestadores de cuidados com animais (como descrito em Spangenberg e Kelling27), e confiabilidade e reprodutibilidade da pesquisa. Evidências de nossa unidade sugerem que essa técnica melhora as interações entre animais e funcionários da criação, facilitando a mudança de gaiola e o monitoramento da saúde. De outros usuários em nossa instalação, a contenção e a manipulação geral são relatadas como sendo significativamente mais fáceis com ratos manuseados, consistente com nossas descobertas de que ratos manipulados com a técnica 3D são menos propensos a fugir quando são pegos e, em nosso exemplo, machos de 6 meses de idade são mais propensos a interagir com seu experimentador. Estudos de acompanhamento poderiam quantificar tais efeitos para demonstrar ainda mais a utilidade da técnica. Ao todo, essa abordagem de manuseio 3D, bem como a abordagem do túnel, contribui para a regra dos 3Rs, particularmente pelo refino das interações rotineiras dos animais para minimizar o estresse em resposta ao manuseio. Dada a redução observada na variabilidade dos dados, isso também tem o potencial de reduzir o número de animais necessários para obter resultados consistentes e refinar a abordagem utilizada para limitar a variabilidade.

Outro ponto de discussão baseado nos dados apresentados é que este estudo foi realizado com animais sendo alojados sozinhos. A habitação única foi preferencial, pois limita os potenciais comportamentos agonísticos (particularmente em camundongos machos), que podem contribuir para a variabilidade inter-individual28,29. Para consistência entre os grupos, todos os animais foram alojados. Também é interessante notar que as interações positivas entre experimentador e animais em ratos na forma de cócegas de ratos, foram capazes de mitigar alguns dos efeitos do isolamento social em ratos alojados30,31. É possível que técnicas de manuseio envolvendo contato direto entre animal e experimentador, como a técnica de manuseio 3D ou a técnica de massagem de copos descrita por Ghosal et al.11 poderiam ter um efeito semelhante. Estudos futuros poderiam explorar essa questão comparando os efeitos das técnicas de manuseio em animais alojados em animais solteiros e agrupados. Estudos anteriores investigaram o impacto das abordagens de manuseio de copos e túneis com camundongos em um ambiente em grupo, e obtiveram resultados semelhantes7,8. Isso confirma que é possível usar os protocolos de manuseio aqui descritos com animais mantidos em condições de casa única ou casa em grupo, tendo em vista a possibilidade de comportamento agonizante ao tirar um animal da gaiola e colocá-lo de volta (particularmente em ratos machos, ou em linhas agressivas de ratos). Nesses casos, recomenda-se usar uma gaiola temporária antes de reagrupar todos os animais juntos.

Para concluir, a abordagem proposta de manuseio 3D contribui para reduzir a reatividade e o estresse em camundongos. Também aumenta a confiabilidade dos dados reduzindo a variabilidade após 3 dias de manuseio. Resultados semelhantes são observáveis com o manuseio do túnel, no nosso caso após 10 dias de manuseio do túnel. Em comparação com a técnica de manuseio do túnel, a técnica de manuseio 3D proporcionou o benefício de aumentar a interação com um experimentador em nossos camundongos machos de 6 meses de idade, o que pode ser crítico em alguns casos. Se a técnica de manuseio de 3D ou túnel fosse implementada em todas as instalações animais, isso representaria uma grande melhoria para a geração de dados e contribuiria muito para a redução do uso de animais em pesquisas.

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Disclosures

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Comitê de Cuidados Com Animais da CAMH por apoiar este trabalho, bem como aos cuidadores de animais do CAMH que forneceram amplo feedback sobre a utilidade do procedimento, motivando a execução dos experimentos descritos e a apresentação do protocolo detalhado para outros usuários. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo CAMH BreakThrough Challenge, concedido ao TP, e por fundos internos da CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

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References

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Comportamento Questão 175
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Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

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