Intervertebral diskin anulus fibrozusunda optik kesit yöntemi kullanarak mekansal kondrosit organizasyonunu araştırmak için bir yöntem sunuyoruz.
Intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu bel ağrısının önde gelen bir nedenidir ve etkilenen bireyler için yüksek derecede bozulma gerektirir. Disk dejenerasyonunun şifresini çözmek ve rejeneratif yaklaşımlar geliştirebilmek için IVD’nin hücresel biyolojisinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması esastır. Bu biyolojinin hala cevapsız kalan bir yönü, hücrelerin fizyolojik bir durumda ve dejenerasyon sırasında nasıl mekansal olarak düzenlendiği sorusudur. IVD’nin biyolojik özellikleri ve mevcudiyeti bu dokunun analizini zorlaştırır. Bu çalışma anulus fibrozusunda erken embriyonik gelişimden son evre dejenerasyona kadar mekansal kondrosit organizasyonunu araştırmamaktadır. Omurga ameliyatı geçiren hastalardan elde edilen hayvan modeli ve insan disk dokusu olarak sığır embriyonik dokusu kullanılarak yüksek çözünürlüklü boyama analizleri yapmak için optik kesitleme yöntemi (Apotome) uygulanır. Erken embriyonik sığır diskinde çok yüksek bir kondrosit yoğunluğundan, gebelik, büyüme ve olgunlaşma sırasında hücre sayısı azalır. İnsan disklerinde, hücresel yoğunluktaki bir artış doku dejenerasyonu ilerlemesine eşlik etti. Eklem kıkırdaklarında daha önce de gösterildiği gibi, küme oluşumu gelişmiş disk dejenerasyonun karakteristik bir özelliğini temsil eder.
Intervertebral disk (IVD), biyokimyasal olarak ve hücresel mimariye göre, ilk bakışta, eklem kıkırdağı1’ebirçok yönden benzeyen kıkırdak bazlı bir yapıdır. Nitekim, eklem kıkırdusunun hem IVD dejenerasyonu hem de osteoartrit (OA), kıkırdak aşınması, subkondral kist ve osteofit oluşumu ve subkondral skleroz2,3nedeniyle eklem alanı daralması ile karakterizedir. Bu görünüşte benzerliklere rağmen mimari ve her iki dokunun fonksiyonel rolü farklıdır. Eklem kıkırdak matrisi esas olarak bir arcade oluşturan kolajen tip II ağından oluşurken, IVD üç farklı doku türünden oluşur: merkezdeki kollajen tipi II bakımından zengin çekirdek pulposus eksenel yükleri kaplar ve bunları anulus fibrosus adı verilen yoğun paketlenmiş dairesel kollajen tipi I liflerinin kuşatıcı bir halkasına iletir. İşlevleri, proteoglikan ve su bakımından zengin çekirdeğin aldığı çevrilmiş eksenel basınçları, gerilme boyuna lif mukavemetleriyle emmektir. Her çekirdeğin ve anulusun üst ve alt kısmında bir hyaline kıkırdaklı uç plakası bitişik omurlar4 (Şekil 1)için birleşim oluşturur.
Eklem kıkırdaklarında dört farklı mekansal kondrosit deseni bulunabilir: çiftler, dizeler, çift telli, küçük sırasıyla büyük kümeler5,6,7 ( Şekil2). Bu desendeki değişiklikler OA başlangıcı ve ilerlemesi8,9ile ilişkilidir. Mekansal kondrosit organizasyonu, kıkırdağın doğrudan işlevsel bir özelliği, yani sertliği için de gösterge niteliğindedir ve bu görüntü tabanlı derecelendirme yaklaşımının işlevsel ilgisinin altını çizmektedir10,11. Bu desenler ayrıca zaten mevcut olan klinik olarak mevcut teknoloji12ile tanımlanabilir. IVD ve eklem kıkırdağı arasındaki benzerlikler nedeniyle, karakteristik kondrosit desenlerinin DE IVD’de mevcut olduğu varsayılabilir. Küme oluşumu dejenere IVD13,14‘te de gözlenen bir olgudur.
IVD’deki mekansal hücresel organizasyonu analiz etmeye çalışırken, eklem kıkırdaklarını araştırırken mevcut olmayan birkaç teknik zorluğun üstesinden gelmek gerekir:
İlk olarak, dokunun kendisinin işlenmesi, büyük ölçüde kollajen tip II’den oluşan homojen hyaline kıkırdaktan çok daha zordur. IVD’nin ana lif bileşeni kollajen tip I’dir, bu da ince histolojik bölümler üretmeyi çok daha zor hale getirir. Hyaline eklem kıkırdağında, dokunun “cam benzeri” doğası nedeniyle kalın bölümler bile kolayca analiz edilebilirken, IVD’nin kollajen tipi I ağı optik olarak son derece aşılamazdır. Bu nedenle, güçlü bir arka plan gürültüsü IVD histolojisinde yaygın bir sorundur. Bu optik yoğun dokuya nüfuz etmenin hızlı ve ucuz bir yolu, örneğin bir Apotome aracılığıyla optik bir kesit cihazının kullanılmasıdır. Böyle bir Apotome’de, geleneksel bir floresan mikroskopunun aydınlatma yoluna bir ızgara yerleştirilir. Izgaranın önüne düzlem paralel bir cam plaka yerleştirilir. Bu, görüntüdeki ızgarayı üç farklı konumda yansıtarak ileri geri eğilir. Her z konumu için, yansıtılan ızgaraya sahip üç ham görüntü oluşturulur ve üst üste bindirilir. Özel yazılımlar vasıflı olarak, odak dışı ışık hesaplanabilir. Temel ilke, ızgara görünürse, bu bilgilerin odakta olmasıdır, değilse odak dışında olduğu kabul edilir. Bu teknikle, iyi odaklanmış ve yüksek çözünürlüklü görüntüler makul bir sürede elde edilebilir.
İkincisi, insan donörlerden doku bulmak zor. Total diz protezi yaparken ameliyat sırasında daha fazla analiz için eklemin tüm yüzeyi elde edilebilir. Diarthrodial eklemin osteoartriti aynı zamanda tüm eklemin bir hastalığı olmasına rağmen, kıkırdak kalitesinde güçlü odak farklılıkları vardır ve genellikle eklemin bazı bölgeleri hala bozulmamıştır, örneğin bu alanda yüklemenin azalması nedeniyle. Bu durum, ameliyatın genellikle sadece disk küresel olarak tahrip edildiğinde yapıldığı IVD’de farklıdır. Operasyon odasından insan donörlerden doku elde edilirken, doku da oldukça parçalıdır ve daha fazla analiz yapmadan önce dokuyu IVD’nin üç kıkırdak türünden birine doğru bir şekilde tahsis etmek gerekir. Daha büyük doku bölümlerinin daha ayrıntılı analizlerine izin vermek ve IVD’nin embriyonik gelişimine bakmak için bir hayvan modeli organizma seçimi gereklidir.
Böyle bir model organizma seçerken, anatomisi ve boyutları, mekanik yüklemesi, mevcut hücre popülasyonu ve doku bileşimi açısından insan diski ile karşılaştırılabilir bir sisteme sahip olmak önemlidir. Burada sunulan tekniğin amacı için sığır bel disk dokusunun kullanılmasını öneriyoruz: İnsan diskinin düşük rejeneratif potansiyeli ile sonuçlanan kritik bir özelliği, çekirdekteki olgunlaşma sırasında notochordal hücrelerin kaybıdır. Bununla birlikte, çok sayıda model organizmada notochordal hücreler tüm yaşamları boyunca tespit edilebilir. Koyun, keçi veya kondrodistrophig köpekleri gibi notochordal hücrelerini kaybeden az sayıda hayvanın çoğu, insan disklerinden çok daha küçük bir IVD’ye sahiptir. Sadece lumbar sığır diskleri, insanIVD’lerininkiylekarşılaştırılabilir bir sagittal disk çapına sahip 15 .
Erken disk dejenerasyonuna yol açan önemli bir faktör aşırı mekanik yüklemedir. Bel omurgasında duran bir intradiskal basınçları, omurga yatay olarak hizalanmış olarak 0,8 MPa civarındadır. Şaşırtıcı bir şekilde bu basınçlar, dik insan omurgası (0,5 MPa)15,16için bildirilen bel intradiskal basınçlarla karşılaştırılabilir. Ayrıca sığır disklerindeki su ve proteoglikan miktarı, genç insanlardan IVD ile karşılaştırılabilir17. Bu nedenle, hareket segmentlerinin gerçek hareket düzeni, iki ayaklı insandan dört katına çıkarken, toplam yükleme ve disk özellikleri açısından farklılık gösterse de, insan biyolojisine koyun ve köpek gibi IVD için diğer yerleşik hayvan modellerinden çok daha yakındır.
Bu protokolde, erken embriyonik gelişimden evre dejenerasyonuna kadar mekansal kondrosit organizasyonu açısından IVD’deki değişikliklerin nasıl analiz edeceğine dair bir teknik sunuyoruz.
Mozaik görüntüleme ve optik kesit ile güçlendirilen floresan mikroskopiyi kullanarak, kondrositlerin bel IVD’nin anulusundaki mekansal düzenini gelişim, olgunlaşma ve dejenerasyon boyunca değerlendirdik. Disk dejenerasyonu için omurga ameliyatı alan hastalardan dejeneratif doku toplanabilirken, embriyonik dönem ve olgunlaşma evresinin analizi model bir organizma (sığır) kullanılmasını gerektirdi. Erken embriyonik gelişim sırasında anulusta yüksek hücresel yoğunluklar kaydedildi. Gelişimin ileris…
The authors have nothing to disclose.
Orijinal yayınlardan ortak yazarlarımıza yardımları ve destekleri için teşekkür ederiz. Charlotte Emma Bamberger’e apotom görüntülerini elde etmesine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |