Summary

Embriyonik Gelişimden Dejenerasyona Kadar Intervertebral Diskin Optik Kesitlenmesi ve Görselleştirilmesi

Published: July 08, 2021
doi:

Summary

Intervertebral diskin anulus fibrozusunda optik kesit yöntemi kullanarak mekansal kondrosit organizasyonunu araştırmak için bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

Intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu bel ağrısının önde gelen bir nedenidir ve etkilenen bireyler için yüksek derecede bozulma gerektirir. Disk dejenerasyonunun şifresini çözmek ve rejeneratif yaklaşımlar geliştirebilmek için IVD’nin hücresel biyolojisinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması esastır. Bu biyolojinin hala cevapsız kalan bir yönü, hücrelerin fizyolojik bir durumda ve dejenerasyon sırasında nasıl mekansal olarak düzenlendiği sorusudur. IVD’nin biyolojik özellikleri ve mevcudiyeti bu dokunun analizini zorlaştırır. Bu çalışma anulus fibrozusunda erken embriyonik gelişimden son evre dejenerasyona kadar mekansal kondrosit organizasyonunu araştırmamaktadır. Omurga ameliyatı geçiren hastalardan elde edilen hayvan modeli ve insan disk dokusu olarak sığır embriyonik dokusu kullanılarak yüksek çözünürlüklü boyama analizleri yapmak için optik kesitleme yöntemi (Apotome) uygulanır. Erken embriyonik sığır diskinde çok yüksek bir kondrosit yoğunluğundan, gebelik, büyüme ve olgunlaşma sırasında hücre sayısı azalır. İnsan disklerinde, hücresel yoğunluktaki bir artış doku dejenerasyonu ilerlemesine eşlik etti. Eklem kıkırdaklarında daha önce de gösterildiği gibi, küme oluşumu gelişmiş disk dejenerasyonun karakteristik bir özelliğini temsil eder.

Introduction

Intervertebral disk (IVD), biyokimyasal olarak ve hücresel mimariye göre, ilk bakışta, eklem kıkırdağı1’ebirçok yönden benzeyen kıkırdak bazlı bir yapıdır. Nitekim, eklem kıkırdusunun hem IVD dejenerasyonu hem de osteoartrit (OA), kıkırdak aşınması, subkondral kist ve osteofit oluşumu ve subkondral skleroz2,3nedeniyle eklem alanı daralması ile karakterizedir. Bu görünüşte benzerliklere rağmen mimari ve her iki dokunun fonksiyonel rolü farklıdır. Eklem kıkırdak matrisi esas olarak bir arcade oluşturan kolajen tip II ağından oluşurken, IVD üç farklı doku türünden oluşur: merkezdeki kollajen tipi II bakımından zengin çekirdek pulposus eksenel yükleri kaplar ve bunları anulus fibrosus adı verilen yoğun paketlenmiş dairesel kollajen tipi I liflerinin kuşatıcı bir halkasına iletir. İşlevleri, proteoglikan ve su bakımından zengin çekirdeğin aldığı çevrilmiş eksenel basınçları, gerilme boyuna lif mukavemetleriyle emmektir. Her çekirdeğin ve anulusun üst ve alt kısmında bir hyaline kıkırdaklı uç plakası bitişik omurlar4 (Şekil 1)için birleşim oluşturur.

Eklem kıkırdaklarında dört farklı mekansal kondrosit deseni bulunabilir: çiftler, dizeler, çift telli, küçük sırasıyla büyük kümeler5,6,7 ( Şekil2). Bu desendeki değişiklikler OA başlangıcı ve ilerlemesi8,9ile ilişkilidir. Mekansal kondrosit organizasyonu, kıkırdağın doğrudan işlevsel bir özelliği, yani sertliği için de gösterge niteliğindedir ve bu görüntü tabanlı derecelendirme yaklaşımının işlevsel ilgisinin altını çizmektedir10,11. Bu desenler ayrıca zaten mevcut olan klinik olarak mevcut teknoloji12ile tanımlanabilir. IVD ve eklem kıkırdağı arasındaki benzerlikler nedeniyle, karakteristik kondrosit desenlerinin DE IVD’de mevcut olduğu varsayılabilir. Küme oluşumu dejenere IVD13,14‘te de gözlenen bir olgudur.

IVD’deki mekansal hücresel organizasyonu analiz etmeye çalışırken, eklem kıkırdaklarını araştırırken mevcut olmayan birkaç teknik zorluğun üstesinden gelmek gerekir:

İlk olarak, dokunun kendisinin işlenmesi, büyük ölçüde kollajen tip II’den oluşan homojen hyaline kıkırdaktan çok daha zordur. IVD’nin ana lif bileşeni kollajen tip I’dir, bu da ince histolojik bölümler üretmeyi çok daha zor hale getirir. Hyaline eklem kıkırdağında, dokunun “cam benzeri” doğası nedeniyle kalın bölümler bile kolayca analiz edilebilirken, IVD’nin kollajen tipi I ağı optik olarak son derece aşılamazdır. Bu nedenle, güçlü bir arka plan gürültüsü IVD histolojisinde yaygın bir sorundur. Bu optik yoğun dokuya nüfuz etmenin hızlı ve ucuz bir yolu, örneğin bir Apotome aracılığıyla optik bir kesit cihazının kullanılmasıdır. Böyle bir Apotome’de, geleneksel bir floresan mikroskopunun aydınlatma yoluna bir ızgara yerleştirilir. Izgaranın önüne düzlem paralel bir cam plaka yerleştirilir. Bu, görüntüdeki ızgarayı üç farklı konumda yansıtarak ileri geri eğilir. Her z konumu için, yansıtılan ızgaraya sahip üç ham görüntü oluşturulur ve üst üste bindirilir. Özel yazılımlar vasıflı olarak, odak dışı ışık hesaplanabilir. Temel ilke, ızgara görünürse, bu bilgilerin odakta olmasıdır, değilse odak dışında olduğu kabul edilir. Bu teknikle, iyi odaklanmış ve yüksek çözünürlüklü görüntüler makul bir sürede elde edilebilir.

İkincisi, insan donörlerden doku bulmak zor. Total diz protezi yaparken ameliyat sırasında daha fazla analiz için eklemin tüm yüzeyi elde edilebilir. Diarthrodial eklemin osteoartriti aynı zamanda tüm eklemin bir hastalığı olmasına rağmen, kıkırdak kalitesinde güçlü odak farklılıkları vardır ve genellikle eklemin bazı bölgeleri hala bozulmamıştır, örneğin bu alanda yüklemenin azalması nedeniyle. Bu durum, ameliyatın genellikle sadece disk küresel olarak tahrip edildiğinde yapıldığı IVD’de farklıdır. Operasyon odasından insan donörlerden doku elde edilirken, doku da oldukça parçalıdır ve daha fazla analiz yapmadan önce dokuyu IVD’nin üç kıkırdak türünden birine doğru bir şekilde tahsis etmek gerekir. Daha büyük doku bölümlerinin daha ayrıntılı analizlerine izin vermek ve IVD’nin embriyonik gelişimine bakmak için bir hayvan modeli organizma seçimi gereklidir.

Böyle bir model organizma seçerken, anatomisi ve boyutları, mekanik yüklemesi, mevcut hücre popülasyonu ve doku bileşimi açısından insan diski ile karşılaştırılabilir bir sisteme sahip olmak önemlidir. Burada sunulan tekniğin amacı için sığır bel disk dokusunun kullanılmasını öneriyoruz: İnsan diskinin düşük rejeneratif potansiyeli ile sonuçlanan kritik bir özelliği, çekirdekteki olgunlaşma sırasında notochordal hücrelerin kaybıdır. Bununla birlikte, çok sayıda model organizmada notochordal hücreler tüm yaşamları boyunca tespit edilebilir. Koyun, keçi veya kondrodistrophig köpekleri gibi notochordal hücrelerini kaybeden az sayıda hayvanın çoğu, insan disklerinden çok daha küçük bir IVD’ye sahiptir. Sadece lumbar sığır diskleri, insanIVD’lerininkiylekarşılaştırılabilir bir sagittal disk çapına sahip 15 .

Erken disk dejenerasyonuna yol açan önemli bir faktör aşırı mekanik yüklemedir. Bel omurgasında duran bir intradiskal basınçları, omurga yatay olarak hizalanmış olarak 0,8 MPa civarındadır. Şaşırtıcı bir şekilde bu basınçlar, dik insan omurgası (0,5 MPa)15,16için bildirilen bel intradiskal basınçlarla karşılaştırılabilir. Ayrıca sığır disklerindeki su ve proteoglikan miktarı, genç insanlardan IVD ile karşılaştırılabilir17. Bu nedenle, hareket segmentlerinin gerçek hareket düzeni, iki ayaklı insandan dört katına çıkarken, toplam yükleme ve disk özellikleri açısından farklılık gösterse de, insan biyolojisine koyun ve köpek gibi IVD için diğer yerleşik hayvan modellerinden çok daha yakındır.

Bu protokolde, erken embriyonik gelişimden evre dejenerasyonuna kadar mekansal kondrosit organizasyonu açısından IVD’deki değişikliklerin nasıl analiz edeceğine dair bir teknik sunuyoruz.

Protocol

Embriyonik gelişim ve olgunlaşma analizi için sığır diskleri kullanıldı. IVD’nin dejenerasyonunu değerlendirmek için insan örnekleri analiz edildi. Tübingen Üniversitesi Hastanesi ortopedi cerrahisi bölümü ve BG Travma Merkezi Tübingen’de bel disk dejenerasyonu, disk prolapsi veya spinal travma nedeniyle ameliyat olan hastalardan insan IVD dokusu elde edildi. Çalışma başlamadan önce tam etik kurul onayı alınmıştır (proje numarası 244/2013BO2). Katılımdan önce tü…

Representative Results

Mozaik görüntüler kullanılarak, anulus ve daha yumuşak çekirdeklerdeki yoğun kolajen lif ağı ile IVD mimarisi açıkça tanınabilir (Şekil 4). Embriyonik gelişim sırasında hücresel yoğunlukta sürekli bir azalma gözlenebilir (Şekil 5). IVD gelişiminin ilk aşamalarında sığır anulus fibrosusunda 11.435 hücre/mm², sığır çekirdeği pulposusunda ise 17.426 hücre/mm² hücre yoğunluğu bulunabilirken, bu sayılar doğuma kadar hızla 1….

Discussion

Mozaik görüntüleme ve optik kesit ile güçlendirilen floresan mikroskopiyi kullanarak, kondrositlerin bel IVD’nin anulusundaki mekansal düzenini gelişim, olgunlaşma ve dejenerasyon boyunca değerlendirdik. Disk dejenerasyonu için omurga ameliyatı alan hastalardan dejeneratif doku toplanabilirken, embriyonik dönem ve olgunlaşma evresinin analizi model bir organizma (sığır) kullanılmasını gerektirdi. Erken embriyonik gelişim sırasında anulusta yüksek hücresel yoğunluklar kaydedildi. Gelişimin ileris…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Orijinal yayınlardan ortak yazarlarımıza yardımları ve destekleri için teşekkür ederiz. Charlotte Emma Bamberger’e apotom görüntülerini elde etmesine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Materials

Amphotericin B Merck KGaA,  Germany A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus R. Langenbrinck, Germany 03-0060
ApoTome Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany
CellMask Actin Tracking Stain Thermo Fischer Scientific, US A57249
Cryostat Leica Biosystems, US CM3050S
DAPI Thermo Fischer Scientific, US D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Germany 41966052
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich, US 60004
Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 3834000604
Formaldehyde Merck KGaA,  Germany 104002
Image J 1.53a, with Cell counter plugin National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin Thermo Fischer Scientific, US A12380
Microscopic Cover Glasses R. Langenbrinck, Germany 01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker Science Sevices  GmbH, Germany N71310
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, US P4333
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,US P5119
Scalpel pf medical AG, Germany 2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Netherlands SA6255012

References

  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
  3. Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
  4. Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
  5. Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
  6. Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  7. Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
  8. Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
  9. Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
  10. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
  11. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  12. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  13. Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
  14. Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
  15. Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
  16. Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
  17. Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
  18. Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
  19. Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
  20. Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
  21. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  22. Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
  23. Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
  24. Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
  25. Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
  26. Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
  27. Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
  28. Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
  29. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  30. Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
  31. Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
  32. Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
  33. Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
  34. Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
  35. Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
  36. McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).

Play Video

Cite This Article
Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Wolfgart, J. M., Breuer, W., Walter, C., Hofmann, U. K., Danalache, M. Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration. J. Vis. Exp. (173), e62594, doi:10.3791/62594 (2021).

View Video