Bioengineering

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599

Christina M. Bailey-Hytholt¹, Veronica LaMastro², Anita Shukla²

¹Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, ²Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

Abstract

מודל קרום התא הם כלי סינון שימושי עם יישומים החל גילוי סמים מוקדם מחקרים רעילות. קרום התא מהווה מחסום מגן חיוני לכל סוגי התאים, המפריד בין הרכיבים התאיים הפנימיים לסביבה החוץ-תאית. ממברנות אלה מורכבות בעיקר מביבאי שומנים, המכיל קבוצות ראש הידרופיליות החיצוניות וקבוצות זנב הידרופוביות פנימיות, יחד עם חלבונים וכולסטרול שונים. הרכב ומבנה השומנים עצמם ממלאים תפקיד מכריע בוויסות התפקוד הביולוגי, כולל אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה התאית, שעשויה להכיל תרופות, רעלים ביולוגיים וטפילים סביבתיים. במחקר זה, שיטות לגיבוש חד שומנים, מרובה שומנים תומכים ותא מושעה מחקה bilayers שומנים מתוארים. בעבר, פוספטידילכולין חד שומני (PC) bilayers שומנים, כמו גם רב שומנים שליה טרופיבלסט בהשראת bilayers שומנים פותחו לשימוש בהבנת אינטראקציות מולקולריות. כאן יוצגו שיטות להשגת שני סוגי דגמי הדו-שכבתיה. עבור תאים מחקים דו-שכבתיים מרובי שומנים, הרכב השומנים הרצוי נקבע תחילה באמצעות מיצוי שומנים מתאים ראשיים או מקווי תאים ואחריו ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS). באמצעות קומפוזיציה זו, שלפוחיות השומנים מפוברקות בשיטת הידרציה ושחול סרט דק ואת הקוטר ההידרודינמי שלהם ואת פוטנציאל זטה מאופיינים. לאחר מכן ניתן ליצור דו-שכבתי שומנים נתמכים ומושעים באמצעות מיקרו-איזון קריסטל קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) ועל קרום נקבובי לשימוש בבדיקת חדירות מקבילה של קרום מלאכותי (PAMPA), בהתאמה. התוצאות הייצוגיות מדגישות את הרבייה והרבגוניות של דגמי דו-שכבתי השומנים של קרום התא במבחנה. השיטות המוצגות יכולות לסייע בהערכה מהירה ומקלה של מנגנוני האינטראקציה, כגון חדירות, ספיחה והטמעה, של מולקולות שונות ומקרומולקולות עם קרום התא, המסייעות בהקרנת מועמדים לתרופות וחיזוי רעילות תאית פוטנציאלית.

Introduction

קרום התא, המורכב בעיקר פוספוליפידים, כולסטרול, וחלבונים, הוא מרכיב מכריע של כל התאים החיים¹. עם ארגון מונע על ידי אמפיפיליות שומנים בדם, קרום התא מתפקד כמחסום מגן ומסדיר כיצד התא אינטראקציה עם הסביבה שמסביב². מספר תהליכים תאיים תלויים בהרכב השומנים והחלבון של הממברנה¹^,². לדוגמה, אינטראקציות קרום התא חשובות עבור משלוח סמים יעיל³. תרופות, ביולוגיות, ננו-חומרים, רעלנים ביולוגיים ורעילים סביבתיים יכולים להשפיע על שלמות קרום התא, ובכך להשפיע על תפקוד התא⁴. בניית תאי במבחנה מחקה מודלים ממברנה המבוססים על הרכב השומנים של קרום התא יש פוטנציאל לספק כלים facile כדי לשפר מאוד את המחקר של ההשפעה הפוטנציאלית של חומרים אלה על תאים.

דו-שכבתי השומנים לדוגמה כוללים שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ובולייה שומנים מושעים. bilayers שומנים נתמכים הם מודל של קרום התא פוספוליפיד נפוץ ביישומי ביוטכנולוגיה שבו שלפוחיות השומנים נקרעים על חומר מצע נתמך⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. טכניקה נפוצה אחת המשמשת לניטור היווצרות bilayer היא מיקרו-איזון גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), הבוחן את ספיחת שלפוחיות בהשוואה למאפיינים הנוזליים בתפזורת במקום⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ . בעבר, QCM-D שימש כדי להדגים כי בתנאי זרימה, פעם כיסוי ארסית קריטית של שלפוחיות שומנים (PC) מושגת על פני השטח, הם נקרעים באופן ספונטני לתוך bilayers שומנים נוקשים¹⁵. עבודה קודמת חקרה גם היווצרות דו-שכבתית שומנים נתמכת עם הרכבים שומנים שונים¹⁶, שילוב של חלבונים שומנים^{בדם 17,}¹⁸^,¹⁹, וניצול כריות פולימר²⁰, מניב bilayers שומנים נתמכים מסוגל לחקות היבטים שונים של תפקוד קרום התא.

bilayers השומנים שימשו כדי לחקות מחסומים ביולוגיים שונים מן תת התא לרמות איברים כולל מיטוכונדריון, תא דם אדום, קרום תא הכבד על ידי שינוי רכיבי פוספוליפיד, כולסטרול, וגליקולפיד²¹. שלל רב שומנים מורכבים יותר אלה עשויים לדרוש שיטות נוספות כדי להשיג קרע ארסי, בהתאם להרכב השומנים. לדוגמה, מחקרים קודמים השתמשו בפפטיד α-סלילי (AH) הנגזר מהחלבון הלא מובנה של נגיף הפטיטיס C 5A כדי לגרום להיווצרות דו-שכבתית על ידי ערעור שלטי השומנים הפולאים²²^,²³. באמצעות פפטיד AH זה, דו-שכבות שומנים נתמכות המחקות תאי שליה נוצרו בעבר²⁴. הפוטנציאל הגדול של bilayers שומנים נתמך עבור יישומים ביו-רפואיים הוכח עם חקירות המשתרעות על פני מולקולרית וננו-חלקיקים^25,²⁶, אינטראקציות רעילות סביבתיות²⁷, הרכבת חלבון ופונקציה¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, סידור פפטיד והכנסת^28,²⁹, הקרנת סמים^30,ופלטפורמות מיקרופלואידיות³¹.

bilayers שומנים מושעים שימשו למחקרי הקרנה פרמצבטית באמצעות בדיקת חדירות קרום מלאכותי מקביל (PAMPA) שבו bilayer שומנים מושעה על פני תוספת הידרופובית נקבובי^32,³³^,³⁴^,³⁵. מודלים שומנים PAMPA פותחו עבור ממשקים ביולוגיים שונים כולל הדם - מוח, buccal, מעיים, וממשקים transdermal³⁶. על ידי שילוב הן של דו-שכבתי השומנים הנתמכות והן טכניקות PAMPA, ספיחה, חדורות והטמעה של תרכובות בתוך רכיבי השומנים של רקמה רצויה או סוג התא ניתן ללמוד ביסודיות.

פרוטוקול זה מתאר את הייצור והיישום של מודלים bilayer השומנים קרום התא במבחנה לחקור מספר אינטראקציות מולקולריות. הכנת דו-לשוניים חד-שומניים ורב-שומנים הנתמכים והשעייתם של שכבות השומנים מפורטת. כדי ליצור דו-שכבתית שומנים נתמכת, שלפוחיות שומנים מפותחות לראשונה באמצעות שיטות הידרציה ושחול סרט דק ואחריו אפיון פיזיקוכימי. היווצרות של דו-שכבתי שומנים נתמך באמצעות ניטור QCM-D ייצור של קרומי שומנים מושעים לשימוש PAMPA נדון. לבסוף, שלל רב שומנים להתפתחות של ממברנות מורכבות יותר חיקוי תאים נבדקים. באמצעות שני סוגי ממברנות שומנים מפוברקות, פרוטוקול זה מדגים כיצד כלי זה יכול לשמש לחקר אינטראקציות מולקולריות. בסך הכל, טכניקה זו בונה תאים מחקים שכבות שומנים עם רבייה גבוהה ורבגוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פיתוח שלשלפי שומנים חד-שומניים

שיטת הידרציה סרט דק
1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי שומנים בדם
  הערה: כל השלבים באמצעות כלורופורם צריכים להתבצע במכסה אדים כימי. כלורופורם תמיד צריך להיות pipetted באמצעות טיפים פיפטה סיבי פחמן בטוח ממס. פתרונות המכילים כלורופורם תמיד צריך להיות מאוחסן בבקבוקונים זכוכית.
  1. הכן פתרון מלאי שומנים 10 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת הנפח המתאים של כלורופורם לתוך הבקריאל המכיל את אבקת השומנים ומערבבים היטב. לדוגמה, להוסיף 20 מ"ל של כלורופורם ל 200 מ"ג של L-α-פוספטידילכולין (ביצה, עוף) (eggPC). פתרון המניות עשוי להיעשות בריכוז שונה במידת הצורך.
    הערה: אם השומנים אבקה אוחסנה אמפולה, לאחר הוספת העברת כלורופורם בקבוקון זכוכית עם כובע מרופד פוליטרפלואורואתילן (PTFE).
  2. אוטמים את מכסה המצקה עם Parafilm ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
2. היווצרות סרט שומנים יבשים
  1. הוסף את הנפח המתאים של תמיסה מלאי שומנים לתוך בקבוקון זכוכית נקי הדרוש לריכוז ארסיות סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, כדי ליצור 1 מ"ל של שלל מחשב ביצה ב 2.5 מ"ג / מ"ל, pipette 250 μL של פתרון ציר מחשב ביצה לתוך המשחקון.
    הערה: אמצעי האחסון המוכן עשוי להיות תלוי בתהליך ההבלטה הנמצא בשימוש (ראה שלב 1.3). הנפח המרבי המומלץ של האקספלודר הוא 1 מ"ל ואילו טווח עוצמת הקול הגדול של המהלל הוא 5-50 מ"ל.
  2. הסר כלורופורם מפתרון מלאי השומנים באמצעות זרם של גז N₂ (ultrapure 5.0 כיתה).
  3. כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם, חבר את סרט השומנים היבש לוואקום ולהשאיר לפחות 4 שעות.
    הערה: ניתן לעצור את התהליך כאן. אם סרט השומנים לא ישמש מיד לאחר ייבוש ואקום, יש לאחסן במתייבש עד לשימוש. ראינו כי אלה סרטי שומנים מניבים שלל איכות דומה לאחר שבוע אחד של אחסון בתנאים אלה; יש לחקור עוד יותר את איכות ההסתה בעקבות משכי אחסון ארוכים יותר.
3. ביצוע הקפאה-הפשרת מערבולת מחזורים
  1. הכן פתרון חיץ נתרן כלורי (NaCl) של טריס המכיל 10 מ"ר של בסיס טריס ו-100 מ"ר של NaCl. Rehydrate סרט השומנים היבש עם הנפח הנדרש של חוצץ Tris NaCl כדי להניב ריכוז נצנית סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל ומערבולת עבור כ 15-30 s.
  2. מעבירים את ההשעיה ההדבקה למיכל עם קרח יבש עד להקפאה, כ-30 דקות. לאחר המדגם קפוא לחלוטין, להפשיר את ההשעיה באמבט מים 30-40 מעלות צלזיוס. מערבולת השעיית ארסיה מופשרת.
    הערה: נוזל N₂ עשוי לשמש במקום קרח יבש. מעבירים את ההשעיה הססנית לחנן נוזלי למשך 30 מעלות, ומיד מפשירים באמבט מים של 80 מעלות צלזיוס.
  3. חזור על שלב 1.1.3.2 4 פעמים נוספות, עבור סך של 5 מחזורי הפשרת-ההקפאה-מערבולת.
שחול
הערה: לאחר השלמת מחזורי הפשרת-ההקפאה-מערבולת, שלשלות multilamellar נוצרים. שחול מסייע בהפחתת גודל ופיתוח שלל חד-צדדי גדול.
1. תהליך ההבלטה הקטן (1 מ"ל)
  1. נקו ביסודיות את כל מרכיבי המסלק באמצעות חומר ניקוי עדין במים אולטרה-תפירה ושטפו לפחות שלוש פעמים במים אולטרה-סברים המבטיחים את הסרת כל חומרי הניקוי. יבש עם גז N_2.
  2. להרכיב את שתי תומכי הממברנה הפנימית וטבעות O (קוטר פנימי של 12.7 מ"מ; קוטר חיצוני של 15.2 מ"מ). מקם כל תמיכה בממברנה כך שטבעת ה-O פונה כלפי מעלה.
  3. יש להרטיב מסנן עם מים אולטרה-טורפים. מניחים אותו על משטח התמיכה בממברנה בתוך טבעת ה-O. חזור על הפעולה לקבלת התמיכה הפנימית השנייה בממברנה.
  4. מקם תמיכה פנימית אחת בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה. מניחים קרום פוליקרבונט אחד של 100 ננומטר על התמיכה הפנימית בממברנה, ישירות מעל התמיכה במסנן.
    הערה: ממברנות פוליקרבונט מאוחסנות בנפרד בין חתיכות נייר בצבע כחול. הסר את נייר ההפרדה לפני החדרה על התמיכה בממברנה.
  5. מקם את התמיכה הפנימית השנייה בממברנה לתוך המארז החיצוני של המבליט עם טבעת O וצד התמיכה בסינון מול קרום הפוליקרבונט. חבר את נושאת ה- PTFE לאגוז שכר הטרחה וסגור עם המארז החיצוני של המכבש. חותכים את המהלל לבלוק החימום.
  6. לטעון את ההשעיה השומנים לתוך אחד המזרקים למקם את המזרק לתוך בלוק חום extruder, החדרת המחט באופן מלא לתוך קצה אחד של המכבש. הכנס את המזרק השני, הריק לצד הנגדי ונעל את שני המזרקים באמצעות מהדקי הזרוע על בלוק החום.
    הערה: במידת הצורך, מניחים את בלוק החום של המכבש על צלחת חמה ומגדירים את הטמפרטורה לערך מעל טמפרטורת המעבר של השומנים. הכנס מדחום לתוך המחזיק המובנה לתוך בלוק החום לקריאות טמפרטורה מדויקות ולחכות עד הטמפרטורה הנדרשת הגיע (~ 15 דקות). של שלל שומנים PC ביצה אינם דורשים חום במהלך שחול.
  7. לאט לאט לדחוף את ההשעיה הזרקית לתוך המזרק הריק, ולאחר מכן בחזרה למזרק המקורי. נטר לשינויי לחץ לאורך כל ההבלטה המצביעים על דליפה. חזור על 20 פעמים נוספות עבור סך של 21 עובר דרך קרום פוליקרבונט. מעבירים את שלל השומנים ל בקבוקון זכוכית נקי לאחסון.
    הערה: מספר שחול ניתן למטב בהתאם להרכב השומנים.
  8. אם נעשה שימוש בחום, אפשר השעיית ארסיה בולטת כדי להגיע לטמפרטורת החדר. יש לאחסן את שלל השומנים המובלטים ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    הערה: משך אחסון הלסייה המומלץ תלוי מאוד בהרכב השומנים, ויש לעקוב אחר המאפיינים הפיזיקוכימיים הארסיים (למשל, קוטר הידרודינמי, פוטנציאל זטה) לאורך זמן. לדוגמה, שלל מחשב ביצה אוחסנו לפחות שבועיים ללא שינוי בגודל ארסיה או קיבולת היווצרות bilayer.
2. תהליך מחול גדול (5-50 מ"ל)
  הערה: בצע את השלבים 1.2.2.1-1.2.2.5 אם יש צורך בחום עבור השומנים שנבחרו. דלג לשלב 1.2.2.5 אם אין צורך בחום. שלבים 1.2.2.1-1.2.2.4 אינם נדרשים עבור מחשב ביצה.
  1. מלא בקבוקון 1 L עם מים אוסמוזה הפוכה (RO).
    הערה: אין להשתמש במים אולטרה-סברים כדי להסתובב במערכת 50 מ"ל מכיוון שהם עלולים לגרום ליוני מתכת לחלץ מהגליל של האסטרונדר.
  2. מניחים את בקבוקון 1 L באמבט מים על צלחת חמה ומניחים את הצלחת החמה לטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר של השומנים.
  3. חבר את גליל הדגימה לבקבוקון עם צינורות גמישים דרך המפרצון על גליל המדגם. חבר צינורות על שקע הגליל לחלק העליון של בקבוקון 1 L. צינורות מאובטחים הן בפרצון והן בשקע, לפי הצורך. זה ייצור זרימה חד כיוונית של המים דרך גליל המדגם.
  4. הפעל את המשאבה כדי להתחיל זרימת מים. אם יש צורך בחום, אפשרו כ-30-45 דקות עד שגליל מדגם יגיע לטמפרטורה הרצויה.
  5. חבר את המכסה של גליל המדגם למיכל חנקן באמצעות המחבר הגמיש המחובר ליחידת שסתום הקלה בלחץ.
  6. נקה את כל חלקי המהלל 50 מ"ל עם 70% (v/v) אתנול.
  7. להרכיב את המהוצץ על ידי הצבת התמיכה במסך החור הגדול, דיסק sintered, דיסקי ניקוז, וקרום פוליקרבונט לתוך החלל בתמיכה התחתונה extruder. חבר את התמיכה העליונה והתחתון באמצעות ארבעת הברגים והידוק.
  8. חבר את יחידת המכבש לצילינדר המדגם על ידי הברגה לתחתית והידוק עם מפתח ברגים כדי לאבטח.
    הערה: אם משתמשים בחום, מניחים מדחום לתוך הגליל וממתינים עד שהמים יגיעו לטמפרטורה הרצויה לפני שתמשיכו. זה יבטיח כי טמפרטורת המדגם נשמרת לאורך כל תהליך שחול.
  9. מלאו את גליל הדגימה במים אולטרה-תותים. יש לתבל את המים דרך יחידת המהלוה לפני הוספת הדגימה לצילינדר המדגם. זה נעשה כדי להרטיב מראש את הממברנות, בדומה להוונדר המיני.
    הערה: ודאו שהמכסה מוברג במלואו ושסתום ההקלה בלחץ סגור לחלוטין לפני הפעלת החנקן. לחץ מינימלי נדרש עבור שלב זה (~ 5-10 פסאיי).
  10. מוסיפים את מתלה השומנים לצילינדר המדגם ומברגים את החלק העליון סגור. לאט להגביר את הלחץ עד המדגם מתחיל לטפטף מיחידת extruder בקצב של כ 2-3 טיפות / s לתוך בקבוקון זכוכית נקי.
    הערה: אל תגביר את הלחץ במהירות בשלב זה, שכן לחץ רב מדי עלול להשפיע לרעה על הממברנות ולהוביל להבלטה לא מוצלחת.
  11. לאחר כל המדגם כבר extruded, לכבות את אספקת N 2 ולשחרר את_הלחץבצילינדר המדגם על ידי פתיחת שסתום הקלה בלחץ לאט. יוצקים את שלטי השומנים בחזרה לתוך גליל המדגם ולחזור על שלב 1.2.2.11, 9 פעמים נוספות עבור סך של 10 שחול.
    הערה: הלחץ הנדרש עבור שחול עשוי להקטין עם מספר גדל והולך של שחול, כמו המדגם הופך הומוגני יותר קרוב יותר בגודלו לגודל נקבובית קרום פוליקרבונט.
  12. יש לאחסן השעיית ארסיית שומנים מובלטת ב-4 °C (70 °F) עד לשימוש נוסף.

2. אפיון שלשלות שומנים

מדידת קוטר הידרודינמי באמצעות פיזור אור דינמי (DLS)
1. שלשולי שומנים מערבולת ופיפטה 50 μL של השעיית מצע השומנים לתוך cuvette בנפח נמוך חד פעמי. לכסות כדי למנוע זיהום עם אבק ופסולת.
2. טען את ההשעיה ההזנה למכשיר DLS, הזן את פרטי המדגם ובצע את המדידה באמצעות התוכנה המשויכת.
פוטנציאל זטה
1. הכן תא זטה נימי מקופל על ידי כביסה עם מים אולטרה-סבר, 70% אתנול ומים אולטרה-סבר באמצעות מזרקים המתחברים לכניסות של התא. לדחוף בעדינות את הנוזל דרך התא 3-4 פעמים ולרוקן את התא לחלוטין לפני המעבר לפתרון הבא.
2. מערבולת שלשלות השומנים ולהכין 1:10 (v/ v) דילול של שלבי שומנים במים אולטרה-תפומיים.
3. טען את ההשעיה השומנים מדולל. הסר בועות אוויר על ידי דחיפת המתלה הלוך ושוב בין המזרקים. חבר את המעצורים לכל מפרצון.
  הערה: חשוב להסיר את כל הבועות, שכן זה ישפיע על המדידה.
4. מקם את תא הזטה בתא הדגימה, ומבטיח שהאלקטרודות יהיו בקשר. סגור את החלק העליון של תא הדגימה. בתוכנה המשויכת, הזן את הפרטים לדוגמה ואסוף מדידה.

3. יצירת דו-שכבתית שומנים הנתמכת על ידי שומנים חד-שומנים באמצעות QCM-D

הכנות לפתרון
1. הכן פתרון נתרן דודסיל סולפט (SDS) 2% (w/v) במים אולטרה-פרופים. מערבבים על צלחת ערבוב עד להמסה מלאה. פתרונות עבודה Aliquot של לפחות 10 מ"ל של מים אולטרה-תות, 2% SDS, ו Tris NaCl.
2. הכן דילול של שלל שומנים במאגר Tris NaCl. ריכוז שלשלות תלוי ביישום. עבור מחשב ביצה, ריכוזים בטווח של 0.01-0.5 מ"ג/מ"ל הוכחו כתוצאה של היווצרות דו-שכבתית נתמכת בהצלחה.
ניקוי חיישני גביש קוורץ מצופים סיליקה
הערה: ניקוי גבישי QCM-D תלוי בחומר פני השטח של החיישן הנמצא בשימוש. כדי ליצור דו-שכבתיות שומנים נתמכות, גבישי קוורץ מצופים סיליקה משמשים בפרוטוקול זה ומפורטים להלן כמותאמים מהליך ההפעלה הסטנדרטי של היצרן.
1. הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למודול הזרימה ומבטיח שה-t על הגביש יתיישר עם ה-"t" במודול. בורג מודול הזרימה סגור.
  הערה: אם ה- QCM-D המנוצל מאפשר לחבר ולנהל מודולי זרימה מרובים בו-זמנית, חזור על ההליכים הבאים עבור המודולים הנוספים לפי הצורך.
2. הכנס את מודול הזרימה לבסיס המכשיר עם האלקטרודות ממודול הזרימה המתחברות למערכת המנתח. נעל את המודול למקומו.
3. חבר את הצינורות והשקע למודול הזרימה והמשאבה. מניחים את הצינורות לתוך שומרי ההחזקה וסוגרים את המכסה של מערכת המנתח. מניחים מיכל פסולת בשקע המשאבה כדי לאסוף פתרונות שהוצאו.
4. כדי לבצע את הניקוי, הפעל תחילה את המשאבה. הגדר את מהירות הזרימה ל- 400 μL/min. הכנס את צינורות הכניסה לתוך מים אולטרה-תול וזרם 5-10 מ"ל דרך המודול.
5. החלף את צינורות הכניסה לתוך 2% SDS ולזרום 5-10 מ"ל דרך המודול. החליפו את הצינורות המכניסים בחזרה למים אולטרה-זורמים וזרמו 10-20 מ"ל דרך המודול. הסר את צינורות המפרצון מהפתרון ולהזרים אוויר דרך הצינורות עד שכל הנוזל נפלט.
  הערה: פרוטוקול הניקוי לעיל משמש מדי יום לפני ואחרי כל מדידה. ניתן לבצע ניקוי יסודי לפי הצורך. בקצרה, כדי לבצע ניקוי יסודי, לפרק את מודולי הזרימה. כל הרכיבים למעט הצד האלקטרודה של מודול הזרימה צריך להיות שקוע 2% (w / v) SDS ו sonicated אמבטיה, ואחריו שטיפה יסודית עם מים אולטרה-ספיר וייבוש עם זרם של גז N_2. הרכיב של מודול הזרימה המכיל את סיכות האלקטרודה לעולם לא צריך להיות במגע עם נוזל.
6. הסר את החיישן ממודול הזרימה ושטוף את החיישן במים אולטרה-תפומיים. יבש את החיישן עם זרם גז N_2. יבש את מודול הזרימה עם זרם גז N_2. ודא האלקטרודה תמיד להישאר ללא כל נוזל.
7. במכסה המנוע הכימי אדים, הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למכשיר ניקוי אולטרה סגול (UV)/אוזון. הפעל את המכשיר ולאפשר טיפול לפחות 2 דקות. הסר את החיישנים בזהירות ולחזור למודול הזרימה.
יצירת תוכנית בסיסית של טריס NaCl
1. הפעל את מכשיר המנתח כדי להתחבר לתוכנה המשויכת והגדר את הטמפרטורה לערך הרצוי עבור דו-שכבתי השומנים הנתמך. אפשר לטמפרטורה להתייצב לקלט הרצוי.
  הערה: אם הטמפרטורה שנקבעה היא מעל טמפרטורת החדר, כל הפתרונות צריכים להיות מחוממים לאותה טמפרטורה באמצעות בלוק חום.
2. קבע את תצורת המדידה ומצא את כל תדרי התהודה וההתפוגגות של החיישן עבור צלילים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13 לפני תחילת המדידה.
  הערה: ניתן להתעלם מהטון של^רחוב 1 מכיוון שההרמוניה הזו רגישה מדי ומייצרת נתונים רועשים.
3. הפעל את המשאבה והגדר את קצב הזרימה ל- 175 μL / min או את קצב הזרימה הניסיוני הרצוי.
4. נגב את הצינורות עם אתנול לפני הכניסה לתוך טריס NaCl. התחל את המדידה ולהתחיל לזרום טריס NaCl.
  הערה: הנתונים נאספים ומנוטרים בזמן אמת. השינוי מאוויר לנוזל במודול הזרימה ייצפה בתוכנת איסוף הנתונים על ידי שינוי פיזור מהיר (ΔD) עלייה ושינוי תדירות (ΔF).
5. אפשר ל- Tris NaCl לזרום דרך המודול למשך 5-10 דקות, מה שמבטיח שערכי ה- ΔF ו- ΔD הבסיסיים בנוזל יישארו יציבים.
יצירת דו-שכבתית עם שומנים חד-שומנים
1. עצרו את המשאבה והסירו את צינורות הכניסה מפתרון Tris NaCl והכניסו בזהירות לתמיסת השומנים. זרימה אחורית עבור 5 s כדי להסיר את כל בועות האוויר מן צינורות המפרצון, ולאחר מכן להמשיך זרימה קדימה. הפעל מחדש את המדידה בתוכנה כדי לאפס את קו הבסיס.
  הערה: היזהר כדי למנוע בועות אוויר בצינורות, אשר יכול לזרום דרך המודול ולשבש היווצרות bilayer ואת הקלטת הנתונים.
2. זרימה של שלבי שומנים עד היווצרות bilayer הוא ציין בזמן אמת בתוכנה לרכישת נתונים (לפחות 8 דקות עבור שלל מחשב ביצה).
3. חזור על שלב 3.4.1 כדי לשנות את צינורות הכניסה של שלטי השומנים בחזרה למאגר Tris NaCl.
  הערה: אם היישום הרצוי הוא ללמוד אינטראקציות מולקולריות, המשך ישירות לשלב 6.1 מבלי לעצור את זרימת הפתרון או רכישת נתונים. אם היווצרות bilayer היא נקודת הקצה, המשך לשלב 3.4.4.
4. בתוכנה, הפסק את המדידה ושמור את הקובץ. תעצור את המשאבה.
5. נקה את מודול הזרימה וחיישן גביש קוורץ מצופה סיליקה בעקבות שלבי הפרוטוקול 3.2.4 ו- 3.2.5.

4. יצירת דו-שכבתית מושעית

הערה: הפרוטוקול ליצירת דו-שכבתי שומנים מושעה מותאם מפרוטוקול חדירות הממברנה המלאכותית המקבילה (PAMPA) המסופק על ידי יצרן צלחת המסנן³⁷.

Solubilize השומנים הרצוי דודקן ב 20 מ"ג / מ"ל (למשל, 1,2-dioleoyl-sn-גליצרי-3-פוספוצולין (DOPC)).
הוסף 5 μL של פתרון השומנים לתא התורם, שהוא דיפלואוריד פוליווינילידן נקבובי (PVDF) 96-היטב צלחת מסנן מרובת מסך (0.45 מיקרומטר נקבוביות גודל).
מיד להטביע את צלחת המסנן לתוך תא הקבלה, שהוא צלחת מקלט תובלה המכיל 300 μL של 1× תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). הוסף 200 μL של 1× PBS לתא התורם.
הערה: ניתן לכלול פקדים של מסננים עם שומנים בלבד ומסננים לא מטופלים החשופים ל- PBS 1×.
המשך ישירות לסעיף 6.2 כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות עם דו-שכבתי השומנים המושעה. מומלץ להשלים את המחקר בתוך 16 שעות של יצירת bilayer מושעה.

5. פיתוח תאים מרובי שומנים המחקים שלפוחיות ושכבות דו-שכבתיות

מיצוי שומנים מתאי יונקים
הערה: מיצוי השומנים עוקב אחר גישת בליי-דייר³⁸.
1. תרבות קו התא הרצוי בהתאם לצורך. לאחר השגת 70-80% מפגש (T75 בקבוקון), לנתק תאים באמצעות חומצה טריפסין-אתילנדיאמיןטרטאצטטטית ב 37 °C (5 דקות).
2. תאי צנטריפוגות ב 200 × גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 1 מ"ל של מים אולטרה-תול.
3. הוסף 3.75 מ"ל של תערובת 1:2 (v/v) של כלורופורם:מתנול להשעיית התא ומערבולת במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1.25 מ"ל של כלורופורם ומערבולת במשך 1 דקות. לבסוף, להוסיף 1.25 מ"ל של מים ומערבולת במשך 1 דקות.
4. תערובת תאי צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 10 דקות. לאסוף את השכבה התחתונה של נוזל, אשר מכיל שומנים בשלב האורגני. יבש מתחת לזרם של גז N_2.
5. לכמת את תוכן השומנים באמצעות ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS) באמצעות שלב הפוך C18, 3.5 מיקרומטר × עמוד 50 מ"מ.
6. עבור השלב הנייד, להכין שני פתרונות, הראשון עם 60:40 (v/ v) acetonitrile:מים והשני עם 90:10 (v/ v) isopropanol:acetonitrile. אמוניום formate צריך להתווסף לשני הפתרונות בריכוז סופי של 10 מ"מ. מעל 60 דקות, להגדיל את מעבר הצבע שלב נייד מ 35% (v/ v) של הפתרון השני ל 95% (v/ v).
7. זהה את השפכים במצב יינון שלילי, עם טרשת נפוצה סריקה מלאה רצופה ו- MS/ MS. לזהות את המינים הפוספוליפידים בודדים מיחסי המסה לטעינה (m/ z). נתח את ספקטרום המסה מפיצול דיסוציאציה המושרה בהתנגשות, באמצעות כלי ניתוח ספקטרומטריית מסה של LIPID MAPS. להשיג כרומטוגרמה יונים שחולצו כדי לשלב את האזור מתחת לעקומה, קביעת השפע של כל מינים שומנים.
8. בצע את השלבים 5.1.5-5.1.7 עבור תקן שומנים המכיל את מחלקות השומנים העיקריות כדי לקבוע את הרגישים היחסיים של זיהוי עבור כל סוג פוספוליפיד שונה.
פיתוח שלדים מרובי שומנים
1. בצע את השלבים ב- 1.1.1 כדי להכין פתרונות מלאי שומנים עבור שומנים המייצגים כל רכיב דו-שכבתי הרצוי, כפי שזוהה בשלב 5.1.
2. בהתבסס על הרכבי השומנים המתקבלים בשלב 5.1, להוסיף את הנפח המתאים של מלאי שומנים / כלורופורם לתוך בקבוקון זכוכית נקי הדרוש לריכוז ארסיות סופית של 2.5 מ"ג / מ"ל. הסר פתרון ייבוש כלורופורם בתפזורת תחת זרם של גז N_2.
3. בצע את השלבים 1.1.2, 1.1.3 ו- 1.2 כדי ליצור שלד רב שומנים. בצע את שלב 2 לאפיון ארסיות.
יצירת דו-שכבתי שומנים הנתמך על ידי שומנים באמצעות QCM-D
הערה: כמה שלל מרובה שומנים יכול לגרום קרע ארסיות שומנים ספונטני היווצרות bilayer דומה שלל מחשב חד שומנים המוצגים בשלב 3. עם זאת, שלל מרובה שומנים מורכב יותר עשוי לדרוש קלט חיצוני כדי לסייע בקרע ארסית. כאן, פפטיד AH משמש כדי לערער את העלון החיצוני של ההון וכתוצאה מכך היווצרות bilayer. שיטות אחרות להשגת חוסר היציבות וקרע ארסי עשוי להיחשב אם תרצה.
1. בצע את שלב 3 כדי ליצור את דו-שכבתי השומנים הנתמך מרובה שומנים תוך שימוש בשלל מרובה שומנים שנוצר בשלב 5.2.
2. אם לא נצפתה קרע ספונטני של שלל לתוך דו-שכבתי, נסה לערער את היציבות באמצעות פפטיד AH. הכן את הפפטיד AH (רצף פפטיד: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Thr−Asp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מפרט שיטות ליצירת דו-שכבתיות שומנים נתמכות ומושעות(איור 1). הצעד הראשון ליצירת דו-שכבתי שומני נתמך הוא לפתח שלל שומנים. מחשוף מיני מאפשר כמויות קטנות של שלשולי שומנים להיות מוכן (1 מ"ל או פחות), בעוד המחשוף הגדול מאפשר 5-50 מ"ל של שלשולי שומנים להיות מוכן באצווה אחת. התפלגות הגודל של שלשלולי השומנים החד-שומניים שנוצרו על ידי האקספלודר המיני או הגדול מוצגות באיור 2A. כמו extruder גדול משתמש בלחץ גבוה N₂ גז לדחוף את הפתרון ארסית דרך קרום פוליקרבונט, שלל שומנים לגרום התפלגות גודל ממוצעת בקוטר הידרודינמי היעד 100 ננומטר. המבליט המיני גם גורם לחלוקה אחידה, אם כי הקוטר ההידרודינמי הרוסקל מעט גדול יותר מגודל הנקבבובית הפוליטית, האופיינית לשיטה ידנית זו של שחול.

איורים 2B-D להשוות גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של שלל מחשב ביצה חד שומנית ושני הרכב שלל מרובה שומנים. טבלה 1 משווה את הקוטר ההידרודינמי הממוצע של כל הרכב ארסיות שומנים. הרכב של ארסית השומנים הרב-שומנית הראשונה (ML1) מייצג שלשלולי שומנים בהשראת שליה-טרוטובלסט עם הרכב של 57:15:8:8:12 % (w/w) של PC: פוספטידילטנולמין (PE): פוספטידילינוזיטול (PI): פוספטידילסרין (PS): sphingomyelin (SPH). התפלגות הגודל של שלפוחיות מחשב הביצה ושלפוחיות ML1 אחידות מאוד וכמעט זהות, עם הבדלים קטנים בפולידיספרסיות הממוצעת(איור 2A,B). כצפוי, בשל הבדלים בהרכב, פוטנציאל הזטה של שלל השומנים החד-שומנים של מחשב הביצה ו vesicle ML1 נמצאו שונים(איור 2D). ה-ML2 הוא 60% מחשב ביצה ו-40% 1,2-דיסטרויל-סן-גלייצרו-3-אתילפוסכולין (EPC). המטען החיובי של EPC הוביל לפוטנציאל זטה חיובי עבור שלל אלה (איור 2D), ועלייה במדד polydispersity של שלטי ML2 נצפתה גם בהשוואה למחשב ביצה או שלשלות ML1, ככל הנראה תוצאה של הרכב ספציפי של שלשלות אלה.

QCM-D יכול לשמש ליצירת bilayers שומנים נתמך באמצעות קרע vesicle על חיישן מצופה סיליקה, ו ΔF ו ΔD במהלך תהליך זה מנוטרים בזמן אמת. ΔF קשור הפוך לשינויים המוניים, ו- ΔD מוגבר מצביע על עלייה בנזילות המבנה. כמו שלדפיות ספיחת החיישן, ΔF פוחתת ו ΔD עולה. כאשר ההדבקה תגיע לכיסוי מקיף קריטי על פני השטח, תהיה רמה של ΔF ו- ΔD. לבסוף, כמו שלל נקרע, עלייה ΔF ו ΔD ירידה נצפתה, עקב שחרור של מים עטופים משלל קרוע ויצירת bilayer נוקשה, בהתאמה. איור 3 מראה את ה-ΔF וה-ΔD המתרחשים כספיחת שלל וקרע על פני השטח לתצורות דו-ליפיד ורב-שומנים דו-שכבתיות. שלל מחשב ביצה חד-שומנים בקלות ספיחה על פני השטח כפי שמוצג על ידי ΔF להקטין ו ΔD להגדיל. כיסוי ארסית קריטית הוא הגיע בתוך 5 דקות, ולאחר מכן שלל מתחיל להיקרע. ΔF הכולל נצפה על היווצרות bilayer PC ביצה נתמך הוא ~ -25 הרץ, עם ΔD של ~ 0.

שלל ML1 לוקח יותר זמן ספיחה לעומת שלל מחשב ביצה ובניגוד שלל אלה, הם לא באופן ספונטני לקרוע, אבל להישאר יציב על פני השטח. במקום זאת, פפטיד AH מותר לדגור עם שלל ספיחה גורם לקרע שלהם כאשר פפטיד AH מוסר עם שטיפה של טריס NaCl. במהלך היווצרות קרע דו שכבתית, ΔF להגדיל ו ΔD ירידה נצפתה, בדומה שלטי PC ביצה. ה- ΔF של דו-שכבתי מרובה שומנים זה גורם ל- -28 הרץ ו- ΔD של כ - 1 × 10^-6. למרות דומה bilayer השומנים PC ביצה, הבדלים קלים אלה ΔF ו ΔD סביר לציין את הנזילות המוגברת של bilayer בשל סוגי שומנים מרובים הנוכחים במבנה.

לאחר היווצרות bilayer, מבנים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד אינטראקציות עם תרכובות שונות. עם bilayers שומנים נתמכים, ΔF ו ΔD ניתן לנתח לפני ואחרי ההקדמה של המתחם. כדוגמה, אינטראקציית DEHP עם דו-שכבתיות חד-שומניות (ML1) נתמכות מוצגות באיור 4A,B. במקרה זה, רמות דומות של ספיחות DEHP נצפות עבור שני סוגי דו-שכבתי השומנים(איור 4A). עם זאת, הבדלים ב- ΔD נצפו בין הדו-שכבתיות, עם ΔD גדול יותר שנראה עבור bilayer PC ביצה לעומת bilayer ML1 (איור 4B). בעוד דו-שכבתית השומנים הנתמכת מאפשרת לחקור את הספיגה ואת ההטבעה הפוטנציאלית של תרכובות עניין יחד עם הסרת שומנים פוטנציאליים, bilayers שומנים מושעים יכול לספק מידע על חדור ברחבי bilayer באמצעות PAMPA. במקרה של DEHP, חלאה קטנה נצפתה עבור bilayers uni- ו- ML1(איור 4C). _{אפליקציית} P שחושבה עבור DEHP על פני שומנים חד-שומניים (כ-5.5 × 10-11 ס"מ לשנייה) ובולייה מרובת שומנים (כ-6.5 × 10-6 ס"מ לשנייה) הייתה אופיינית לחלחיליות נמוכה. עם זאת, תרכובות אחרות עלולות לגרום חדירה גדולה יותר, אשר ניתן לחקור באמצעות טכניקה זו.

איור 1: תהליך יצירת שכבות שומנים נתמכות (למעלה) ובוליות שומנים מושעות (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון ארסיות חד-שומנית ורב-שומנים. (A) התפלגות קוטר הידרודינמי של שלל מחשב ביצה שנוצר באמצעות מחבט מיני ומוצץ גדול. (B) התפלגות קוטר הידרודינמי של שלפוחיות חד-שומניות המכילות מחשב ביצה ושני ניסוחים מרובי שומנים, ML1 (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) ו- ML2 (60:40 % (w/w) מחשב ביצה:EPC). (ג) מדדי פולידיספרסיטי של שלל חד-שומני ורב שומנים. (ד) פוטנציאלי זטה של שלל חד-שומני ורב שומנים. התוצאות מוצגות כסטיית תקן ממוצעת ±. המשמעות הסטטיסטית חושבה באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם ניתוח פוסט הוק של טוקי (α=0.05, p<0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: היווצרות bilayer PC ביצה חד-שומנית (ΔF בכחול בהיר ו- ΔD באדום בהיר) ומבנה דו-שכבתי מרובה שומנים (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) (ΔF בכחול כהה ו- ΔD באדום כהה) מנוטר לאורך זמן באמצעות QCM-D. קווים מקווקווים מציינים שינויים בתמיסה להיווצרות דו-שכבתית חד-שומנית (כחול בהיר) ולהיווצרות דו-שכבתית מרובת שומנים (כחול כהה). bilayer PC ביצה נוצר על ידי ~ 15 דקות, בעוד bilayer מרובה שומנים לוקח ~ 45 דקות ודורש תוספת של פפטיד AH. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אינטראקציות מולקולה עם שכבות שומנים נתמכות ומושעות. (א) ΔF עקב אינטראקציה DEHP עם שומנים חד-שומניים ורב שומנים (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) bilayers. (B) ΔD עקב אינטראקציה DEHP עם 22226 חד שומנים ורב שומנים. (ג) אחוז מה-DEHP חלחל על פני הדו-ליפיד והשכבות המושעות מרובות השומנים. התוצאות מוצגות כסטיית תקן ממוצעת ±. המשמעות הסטטיסטית חושבה באמצעות מבחן tשל תלמיד (α= 0.05, p<0.05 נחשב למשמעותי סטטיסטית, *p<0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חד-שומנים לעומת מולטי-שומנים	הרכב	מחול	קוטר הידרודינמי (nm)
חד-שומנים	100% מחשב ביצה	מיני	165 ± 1
חד-שומנים	100% מחשב ביצה	גדול	108 ± 2
ריבוי שומנים	57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH	גדול	109 ± 1
ריבוי שומנים	60:40 % (w/w) מחשב ביצה:EPC	גדול	91.0 ± 0.2

טבלה 1: קטיפת השומן קטרים הידרודינמיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר היווצרות שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ו bilayers שומנים מושעה. כאן מוצגים צעדים קריטיים ליצירת כל אחד מהמבנים הללו. בעת יצירת שלל שומנים, חשוב להבלט מעל טמפרטורת המעבר של השומנים³⁹. כאשר מתחת לטמפרטורת המעבר, השומנים נוכחים פיזית בשלב הג'ל המוזמן שלו³⁹. בשלב מסודר זה זנבות השומנים פחמימנים מורחבים לחלוטין ומאפשרים אריזה קרובה, מה שהופך את שחול מאתגר³⁹. כאשר מחומם מעל טמפרטורת המעבר, השומנים הופך יותר הפרעה וכתוצאה מכך שלב גבישי נוזלי³⁹. זנבות פחמימנים של השומנים הם נוזלים יותר בטמפרטורות אלה, המאפשר שחול מוצלח³⁹. מאפייני השומנים כגון הרכב קבוצת הראש, רוויה ומטען ישפיעו על טמפרטורת המעבר שלהם. חשוב גם להסיר את כלורופורם בעת יצירת סרט השומנים, כמו כלורופורם שיורית ישפיע לרעה על היווצרות ארסיה ומאפיינים לאחר rehydration.

במהלך היווצרות דו-שכבתית שומנים נתמך באמצעות QCM-D זה חיוני עבור חיישן גביש קוורץ מצופה סיליקה להיות במצב טהור. ניתן להשתמש מחדש בחיישנים, אך יש לבדוק אותם בכל פעם אחר שריטות, פסולת או שחיקה אחרת ולהשליך אותם אם נמצא פגם כלשהו, שכן פגמים בחיישן יכולים להשפיע על ספיח פסולת ארסית ועל היווצרות דו-שכבתית. התדירות הבסיסית של חיישן הקוורץ הפיזואלקטרי היא 5 מגה-הרץ, כאשר ΔF ו-ΔD מנוטרים בגוונים מוזרים (3, 5, 7, 9, 11 ו-13). הבטחת כי תדרי התהודה הבסיסיים עבור כל צליל שנמצא לפני המדידה דומים לערכים התיאורטיים הצפויים יכול לעזור לזהות בעיית גביש אפשרית. איסוף מדידות מגוונים מרובים חשוב למידול ויסקולאסטי באמצעות הנתונים שהושגו. חשוב גם להבטיח כי האוויר אינו נכנס למערכת במהלך זרימת נוזלים דרך מודולי זרימת QCM-D. אוויר יגרום לשינוי נוזלי אוויר להתרחש אשר יצפו באיסוף נתונים בזמן אמת ולגרום לאובדן שלמות של bilayer השומנים. כדי ליצור דו-שכבתי שומנים הנתמכים על ידי שומנים בדם, ציינו את השימוש בפפטיד AH כדי לגרום לקרע ארסי. בהתאם להרכב השומנים, שיטות אחרות עשויות להיחקר כדי לגרום לקרע ארסי, כגון חוזק יוני משתנה, טמפרטורה, וזרימה. לדוגמה, שינוי ריכוז מלח המאגר שימש להשגת bilayers מרובי שומנים, כגון אלה מחקים ממברנות חיידקיות הכוללות PE ו פוספטידילגליצרל (PG) בהרכב. ⁴⁰ במהלך היווצרות דו-שכבתית שומנים מושעה, חשוב כי שומנים נבחרים כי הם מסיסים דודקאן, כגון DOPC³⁸^,³⁹. בהתאם ליישום ובמיוחד עבור קרום התא מחקה bilayers, מומלץ לבצע מחקרי השוואה חלחול בין bilayers השומנים מושעה ו monolayers התא נוצר על תוספות נקבוביות⁴²^,⁴³^,⁴⁴.

קיימים שלבים רבים בפרוטוקול זה שעשויים להיות מותאמים או משתנים עבור יישום מסוים. השומנים וההרכבים המשמשים, ריכוז ההשעיה של ארסילי השומנים, נפח שלפוחיות שהוכנו, חיץ התייבשות ארסית, מספר המעברים דרך המהלומה, גודל נקבובית קרום פוליקרבונט, חומר מצע גביש קוורץ, קצב זרימת QCM-D, האינטראקציות המולקולריות שנחקרו, משך הזמן לאינטראקציה, והטמפרטורה עשויה להיות מותאמת, מה שהופך את זה גישה רב-תכליתית. תהליכי השחול המפורטים כאן יכולים לשמש גם ליצירת ליפוזומים טיפוליים. לדוגמה, הן extruder מיני extruder גדול שימשו כדי ליצור ליפוזומים אנטי פטרייתית להישאר יציב לפחות 140 ימים ב 4 °C (55), במים אולטרה-סבר⁴⁵. שיטות אחרות להיווצרות ואפיון דו-שכבתיים ארסית או שומנים בדם עשויות להיחשב גם להשוואה או לאימות נוסף. לדוגמה, sonication היא טכניקה נוספת המשמשת ליצירת שלפוחיות שומנים⁴⁶, וטכניקות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת קריו עשוי לשמש כדי לאשר lamellarity¹⁵^,⁴⁵. מיקרוסקופיה כוח אטומי⁴⁷, תהודה פלסמון פני השטח⁴⁸, ורפלקטיביות נויטרונים⁴⁹ יכול לשמש גם בשילוב עם QCM-D כדי לחקור bilayers שומנים נתמך⁵⁰. bilayers שומנים מושעים נוצרו גם במכשירים microfluidic³⁰^,⁵¹ בנוסף לשימוש במסנן ומקלט היטב לוחות שנדונו בפרוטוקול זה.

בעוד השיטה המתוארת כאן יכול לספק bilayers שומנים facile המחקים הרכב שומנים תאיים, הם מספקים רק מידע על אינטראקציות מולקולריות עם שומנים אלה. חלבונים הם גם מרכיבים מרכזיים של קרום התא ויכולים להשפיע על ספיפה, חדירות, ומאפייני תחבורה פעילים ופסיבים. לכן, קידום דו-שכבתי שומנים מודל אלה לשלב חלבונים יגרום תכונות נוספות חיקוי תאים, שיכול לשפר את המידע המתקבל מגישות אלה. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה שילב חלבונים לתוך bilayers שומנים נתמכים באמצעות מצעים סיליקה mesoporous המאפשר גודל נקבובית משטח מותאם אישית לשלב חלבונים transmembrane מקומי⁵². יישומים שבהם bilayers אלה יהיו חשובים במיוחד כוללים בדיקות רעילות ומחקרי הקרנה פרמצבטית²⁴^,²⁷. בסך הכל, הרבגוניות והשחזור של מודלים אלה לחיקוי תאים מוסיפה לכלי השירות שלהם למגוון חקירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס ' 1942418 שהוענק ל- A.S., ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע שהוענקה ל- C.M.B.H., תחת גרנט מס '1644760. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע. המחברים מודים לד"ר נואל ורה-גונזלס על רכישת נתוני אפיון השומנים. המחברים מודים לפרופסור רוברט הארט (אוניברסיטת בראון) על השימוש בזטסייזר שלו. המחברים מודים למתקן ספקטרומטריית המסה של אוניברסיטת בראון, בפרט, ד"ר טון-לי שן על הסיוע בכימות הרכב השומנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC)	Avanti Polar Lipids	850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE)	Avanti Polar Lipids	850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS)	Avanti Polar Lipids	840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE)	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt))	Avanti Polar Lipids	890703
3 mL Luer-Loc syringes	BD	309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner	Duran Wheaton Kimble	W224605
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Alconox	Fisher Scientific	50-821-781
Ammonium formate	Millipore Sigma	LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire	Waters	186002551
Chloroform	Millipore Sigma	LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK	Sarstedt	67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)	Millipore Sigma	36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore Sigma	LSAC472301
Ethanol	Pharmco	111000200
Filter supports, 10 mm	Avanti Polar Lipids	610014	Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell	Malvern Panalytical	DTS1070
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764-4L
Kimwipes	Kimberly Clark	34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)	Avanti Polar Lipids	840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	840051
LiposoFast ® LF-50	Avestin, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block	Avanti Polar Lipids	610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile	Millipore Sigma	MAIPS4510	for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure	TechAir	NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um	Whatman	800309	Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um	Whatman	110605	Size for large extruder
Parafilm	Bemis	PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x	Genesee Scienfitic	25-507X	Dilute to 1x
Qsoft 401 software	Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer	Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL	Duran Wheaton Kimble	986561
Silicon Dioxide, thin QSensors	Biolin Scientific	QSX 303
Sodium chloride (NaCl)	Millipore Sigma	LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-100
Solvent Safe pipette tips	Sigma-Aldrich	S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids	860061
Trizma base	Millipore Sigma	LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid	Caisson Labs	TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm	Whatman	230600	Size for large extruder
Zetasizer ZS90	Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software	Malvern Panalytical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Bioengineering

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.