В данной статье представлена подробная методика измерения изолевугландинов в тканях методом иммунофлюоресценции с использованием щелочного фосфатаз-конъюгированного антитела ScFv D11. Модели гипертонии как у мышей, так и у людей используются для объяснения пошаговых процедур и фундаментальных принципов, связанных с измерением изолевугландина в образцах тканей.
Изолевугландины (IsoLG) представляют собой высокореакционноспособные гамма-кетоальдегиды, образующиеся из H2-изопростанов в результате перекисного окисления липидов и сшитых белков, что приводит к воспалению и различным заболеваниям, включая гипертонию. Обнаружение накопления IsoLG в тканях имеет решающее значение для того, чтобы пролить свет на их участие в процессах заболевания. Однако измерение изоЛГ в тканях чрезвычайно сложно, а доступные в настоящее время инструменты, включая масс-спектрометрический анализ, трудоемки и чрезвычайно дороги. Здесь мы описываем новый метод обнаружения in situ изоЛГ в тканях с использованием щелочной фосфатазы-конъюгированной D11 ScFv и рекомбинантного фагового антитела, продуцируемого в E. coli с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Для валидации окрашивания использовали четыре контроля: (1) окрашивание с D11 и без него, (2) окрашивание бактериальным периплазматическим экстрактом линкером щелочной фосфатазы, (3) нерелевантное окрашивание антителами scFV и (4) конкурентный контроль с IsoLG перед окрашиванием. Мы демонстрируем эффективность щелочной фосфатазы-конъюгированной D11 как в тканях человека, так и в тканях мыши с артериальной гипертензией или без нее. Этот метод, вероятно, послужит важным инструментом для изучения роли IsoLG в широком спектре болезненных процессов.
Изолевугландины (IsoLGs), также известные как изокетали, представляют собой изомеры семейства 4-кетоальдегидов, которые являются продуктами перекисного окисления липидов и реагируют с первичными аминами на белках 1,2 и аддуктируют их. ИзоЛГ были вовлечены в несколько заболеваний, включая сердечно-сосудистые, болезни Альцгеймера, заболевания легких и печени, а также многие виды рака3. ИзоЛГ были наиболее широко изучены с точки зрения их вклада в сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые являются значительным бременем для здоровья и экономики во всем мире, включая Соединенные Штаты. По оценкам, 92,1 миллиона взрослых в США имеют по крайней мере один тип сердечно-сосудистых заболеваний, при этом оценочные прогнозы на 2030 год охватывают 43,9% взрослого населения США4. Снижение артериального давления, холестерина и отказ от курения снижают общий риск и возникновение сердечно-сосудистых заболеваний5.
Высокое кровяное давление или гипертония является основным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и затрагивает примерно половину населения США6. Предыдущие исследования показали, что воспаление является основной причиной гипертонии и что IsoLG играют роль7. Гипертензивные стимулы, включая ангиотензин II, катехоламины, альдостерон и избыток пищевой соли, индуцируют накопление IsoLG в антигенпрезентирующих клетках, включая дендритные клетки (ДК), которые, в свою очередь, активируют Т-клетки для пролиферации и продуцирования воспалительных цитокинов, способствующих гипертонии 8,9.
Ранее IsoLG измеряли с помощью иммуногистохимии, масс-спектрометрии, иммуноферментного анализа и проточной цитометрии10,11. Чтобы облегчить измерение IsoLGs, было разработано рекомбинантное антитело (D11) с одноцепочечной переменной фрагментом (scfv) против IsoLGs12. Первоначально это антитело D11 содержало E-метку из 11 аминокислот и требовало вторичного антитела для иммуногистохимического обнаружения11. Однако найти надежное вторичное антитело против Е-метки после прекращения ее производства производителем было сложно. Поэтому мы разработали надежный протокол иммунофлуоресцентного окрашивания IsoLG с использованием D11, конъюгированного со щелочной фосфатазой (D11-AP), который мы продемонстрировали на тканях мышей и человека с гипертонией и без нее.
D11 широко использовался для обнаружения IsoLG-аддуктированных белков в клетках или тканях в качестве маркера воспаления или окислительного стресса при заболевании 8,9,20. Ранее D11 содержал E-метку, и разработка IHC требовала использования вторичного антитела против E-метки, конъюгированного с HRP10,20,21. Здесь мы разработали и оптимизировали протокол для обнаружения IsoLG-аддуктированных белков с использованием антитела D11, конъюгированного со щелочной фосфатазой вместо E-tag, что устраняет необходимость инкубации вторичных антител.
Для определения специфичности D11-AP было проведено четыре отрицательных контрольных эксперимента. Мы выполнили протокол без присутствия D11 и имели минимальную разработку. Эти результаты имеют двоякое указание: эндогенная щелочная фосфатаза не способствует развитию, а наблюдаемое окрашивание связано с D11, а не с другим способствующим фактором. Далее мы окрашивали слайды линкером AP без D11. Этот эксперимент привел к небольшому окрашиванию, что указывает на то, что свободный AP или другие факторы в периплазматическом экстракте не вызывают пятна, которое мы наблюдаем в присутствии D11. Чтобы обеспечить специфичность D11 к IsoLG, мы предварительно инкубировали D11-AP с очищенным IsoLG перед окрашиванием предметных стекол. Мы наблюдали снижение развития, что указывает на то, что D11-AP был связан с белком IsoLG, тем самым исчерпывая количество свободного D11-AP для связывания с IsoLG, присутствующим в ткани. Наконец, чтобы убедиться, что D11-AP связывается с IsoLG, а не с белком MSA, с которым был связан IsoLG, мы предварительно инкубировали D11-AP только с MSA. Не было никаких изменений в развитии, указывающих на то, что D11-AP связывался не с MSA, а с белком IsoLG. Наконец, исследователи, разрабатывающие протокол окрашивания, были слепы к гипертоническому статусу кишечной ткани человека. Различия в окрашивании, наблюдаемые между пациентами с артериальной гипертензией и пациентами с нормотензией, не были обусловлены смещением и были описаны ранее22,23.
Хотя наш протокол обнаружения IsoLG-аддуктированных белков с использованием антитела D11, конъюгированного с щелочной фосфатазой вместо E-tag, является строгим и надежным и устраняет необходимость инкубации вторичных антител, он имеет некоторые ограничения. Одним из ограничений является то, что мы использовали D11, конъюгированный со щелочной фосфатазой, в периплазматическом экстракте, и могло быть ложное окрашивание эндогенной щелочной фосфатазы в периплазматическом экстракте или некоторых тканях, таких как кишечник24. Однако первый шаг к разработке этого протокола включал отключение эндогенной щелочной фосфатазы, которая может присутствовать в тканях25. Первоначально холодная уксусная кислота, BME и левамизол26 были проверены на эффективность. Ни один из них полностью не уменьшил присутствие активной эндогенной щелочной фосфатазы. Тепло использовалось для дезактивации щелочной фосфатазы27, поэтому мы протестировали тепловую дезактивацию щелочной фосфатазы в разных буферах. Мы обнаружили, что нагревательные и гидратированные предметные стекла в цитратном буфере устраняют большую часть эндогенной щелочной фосфатазы. Слайды были первоначально разработаны с использованием хемилюминесцентной / флуоресцентной подложки, но при изображении без этой подложки наблюдалось большое количество автофлуоресценции. VectorRed – это субстрат, который развивается в присутствии щелочной фосфатазы с образованием хромогена, который можно визуализировать в диапазоне каналов Texas Red / TRITC. Используя этот субстрат, мы смогли легче наблюдать сигнал над фоновой автофлуоресценцией. В процессе окрашивания следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму искусственное окрашивание. Сушка тканей на предметных стеклах после гидратации до визуализации привела к усиленному развитию. D11-AP следует аликвотировать и хранить при -20 °C. При работе с D11-AP следует избегать многократных циклов замораживания-оттаивания. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) также может влиять на ферментативную активность щелочной фосфатазы и не должен использоваться в качестве промывочного буфера28. Как и в случае с любым подходом, основанным на антителах, необходимо провести тщательное тестирование и оптимизацию, чтобы убедиться, что окрашивание является специфическим, и что сигнал не перегружен или недостаточно усилен.
В заключение, мы разработали мощный, строгий и надежный оптимизированный протокол для обнаружения IsoLG-аддуктированных белков с использованием антитела D11, конъюгированного со щелочной фосфатазой вместо E-tag. Этот протокол имеет несколько преимуществ: во-первых, использование D11 в качестве белка слияния щелочной фосфатазы дешевле. D11 был первоначально получен из библиотеки фаговых антител, которая не могла быть коммерциализирована и была дорогой для очистки. Хотя D11 в периплазматическом экстракте E. coli может обеспечить недорогую альтернативу, он был неэффективен в большинстве анализов. Во-вторых, подход к синтезу щелочной фосфатазы позволяет D11 scfv иметь полезный репортер15 (щелочная фосфатаза), слитый с ним, и его не нужно очищать для использования в иммунологических анализах, поскольку субстраты коммерчески доступны. В-третьих, щелочная фосфатаза E. coli образует димеры29. Таким образом, D11 при слиянии со щелочной фосфатазой также образует димеры, и это увеличивает авидность антитела и связывающую активность30. Наконец, D11, конъюгированный со щелочной фосфатазой в периплазматическом экстракте, можно легко очистить с помощью сибакроновой синей сефарозы. D11 имеет высокую изоэлектрическую точку (~9.2 pH). Таким образом, он положительно заряжен и может связываться с синим цибакроном посредством пикатионных взаимодействий. Большая часть примесей в периплазматическом экстракте E. coli может быть элюирована смолой. D11, конъюгированный щелочной фосфатазой, затем может быть элюирован с использованием высокого содержания соли (~ 1,5 М NaCl) в воде. Элюированный D11, конъюгированный щелочной фосфатазой, достаточно стабилен при 4-8 ° C в растворе с высоким содержанием соли. Таким образом, мы разработали протокол, который не только делает антитело D11 доступным по низкой цене, но и устраняет дополнительные этапы и необходимость инкубации вторичных антител. Этот протокол облегчает воспроизводимое измерение изоЛГ, которые накапливаются в тканях при множественных заболеваниях, где играет роль повышенный окислительный стресс.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 и R03HL155041 для А.К. Мы благодарим общий ресурс цифровой гистологии – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 за визуализацию и сканирование слайдов.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |