Summary
يمكن استخدام هذا البروتوكول الخاص بوضع العلامات المناعية لكل من بروتينات الفيروسات النباتية وبروتينات الحشرات الناقلة في أمعاء الحشرات المستأصلة لدراسة التفاعلات بين الحشرات الفيروسية والحشرات الناقلة ، ووظائف بروتين الحشرات والآليات الجزيئية الكامنة وراء انتقال الفيروس.
Abstract
تنتقل معظم فيروسات النباتات في الطبيعة من نبات إلى آخر عن طريق الحشرات النصفية. تلعب الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة ذات الكفاءة العالية في انتقال الفيروس دورا رئيسيا في أوبئة الفيروسات في الحقول. يمكن لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والحشرات أن تعزز فهمنا لانتقال الفيروس والأوبئة بهدف تصميم استراتيجيات جديدة للسيطرة على فيروسات النباتات وحشراتها الناقلة لها. تم استخدام وضع العلامات المناعية على نطاق واسع لتحليل التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيفين ويستخدم هنا في نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera) ، الذي ينقل بكفاءة فيروس القزم الأسود المخطط للأرز الجنوبي (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، لتحديد موقع الفيروسات وبروتينات الحشرات في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر ، درسنا الخصائص المورفولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، والتوطين الخلوي لبروتينات الحشرات ، والتمركز المشترك للفيروسات وبروتين الحشرات. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنشطة الفيروس في الحشرات ، ووظائف بروتينات الحشرات ، والتفاعلات بين الفيروس والحشرة الناقلة.
Introduction
تنتقل معظم فيروسات النباتات الموصوفة عن طريق الحشرات من رتبة Hemiptera التي تشمل حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس1،2. تخترق أجزاء الفم الماصة للحشرات النصفية الأنسجة النباتية لتغذية وإفراز اللعاب ، وفي نفس الوقت تنقل الفيروسبكفاءة 2. تم وصف آليات انتقال مختلفة للفيروسات النباتية بواسطة الحشرات الناقلة للأمراض. وتشمل هذه غير الثابتة وشبه الثابتة والمستمرة. النوع الثابت إما غير تكاثري أو تكاثري 3,4 ، ولكن بالنسبة لكلا النوعين ، يجب أن يتحرك الفيروس المنقول في جميع أنحاء جسم الحشرة. في وضع التكاثر المستمر ، تصيب الفيروسات في البداية وتتكاثر في الخلايا الظهارية لأمعاء الحشرة ، ثم تنتشر في أنسجة مختلفة ، وفي النهاية إلى الغدد اللعابية ، حيث يمكن بعد ذلك إدخالها في النبات من خلال اللعاب أثناء تغذية الحشرات 5,6. تنتقل الفيروسات المنقولة باستمرار عبر أعضاء مختلفة وتتكاثر في نواقل الحشرات ، الأمر الذي يتطلب تفاعلات محددة بين الفيروس ومكونات الناقل في مراحل مختلفة 7,8.
يجب أن تتفاعل البروتينات الفيروسية وبروتينات الحشرات لتسهيل العمليات الحرجة للتعرف على الفيروسات أو العدوى أو التكاثر أو الانتشار في الحشرات الناقلة 9,10. على الرغم من أنه يمكن استخدام الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل الخلوية في الحشرات ، إلا أنه لا يمكن أن يظهر توزيع virion أو التوطين الخلوي أو التمركز المشترك للبروتينات الفيروسية وبروتين الحشرات أو البنية التحتية لأنسجة وخلايا الحشرات. تم إجراء وضع العلامات المناعية لأول مرة بواسطة Coons et al. في الخلايا البلعمية للفأر عن طريق تسمية أجسام مضادة فلوريسئين محددة ، والآن يتم استخدامه على نطاق واسع11. تعد تقنية التألق المناعي ، والمعروفة أيضا باسم تقنية الأجسام المضادة الفلورية ، واحدة من أقدم تقنيات وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها وتستند إلى تفاعل الربط المحدد بين المستضد والجسم المضاد11,12. يتم تمييز الجسم المضاد المعروف أولا بالفلوريسئين ، والذي يستخدم كمسبار للكشف عن المستضدات المقابلة في الخلايا أو الأنسجة13,14. بعد أن يرتبط الجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين بالمستضد المقابل في الخلايا أو الأنسجة ، سيصدر المسبار مضانا ساطعا عند تشعيعه بأطوال موجية للإثارة وعرضه باستخدام مجهر مضان لتحديد موقع المستضد15.
معظم الحشرات الناقلة للفيروسات النباتية هي hemipterans. يمكن أن تؤدي الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة التي تتمتع بكفاءة انتقال عالية لفيروس النبات إلى أوبئة الفيروس5. انتشر فيروس قزم الأرز الجنوبي الأسود (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، أحد أخطر مسببات الأمراض للأرز ، بسرعة في جميع أنحاء مناطق زراعة الأرز في شرق وجنوب شرق آسيا ، وتسبب في خسائر فادحة في الغلة منذ عام 201016,17. ينقل البالغون والحوريات من نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera Horváth) SRBSDV إلى الأرز بطريقة إكثارية مستمرة بكفاءة عالية. أظهرت الدراسات الميدانية أن تفشي مرض القزم الأسود المستحث ب SRBSDV يتزامن عادة مع الهجرة الجماعية لمسافات طويلة من WBPHs ، وهو عامل حاسم في أوبئة SRBSDV7،8،18. البروتين الغشائي المرتبط بالحويصلة 7 (VAMP7) هو مستقبل بروتين ارتباط عامل حساس للذوبان N-ethylmaleimide (SNARE) ، والذي يمكنه التوسط في نقل المواد عبر اندماج الحويصلة. يتفاعل VAMP7 مع بروتين القفيصة الرئيسي الخارجي ل SRBSDV في المختبر ، مما يشير إلى أن VAMP7 قد يكون مرتبطا ارتباطا وثيقا بانتقال الفيروس16.
في البروتوكول المقدم هنا ، قمنا باستئصال القناة الهضمية من WBPH الخبيث كمثال لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى16. كموقع غزو أولي للفيروس ، تلعب ظهارة الأمعاء الوسطى أدوارا حيوية في الإصابة بالفيروس وتكاثره وانتقاله. أولا ، قمنا بتفصيل خطوات استئصال القناة الهضمية من الحوريات والبالغين من WBPHs. ثانيا ، استخدمنا أجساما مضادة محددة تحمل علامة الفلوريسئين لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية المعوية. ثم لاحظنا الخلايا الظهارية والموقع الخلوي للفيروسات و VAMP7 عبر مجهر المسح بالليزر. أظهرت النتائج أن فيروسات SRBSDV و VAMP7 يمكن أن تتمركز في سيتوبلازم الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، مما يشير إلى أن الوظيفة المحددة ل VAMP7 قد تكون مرتبطة بنشر الفيروسات من الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحشرات غير المميتة
- اجمع WBPHs من حقول الأرز والخلفية مع شتلات الأرز في أكواب زجاجية سعة 1 لتر مغطاة بشبكة مقاومة للحشرات في حاضنة عند 28 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة و 8 ساعات مظلمة. نظرا لأن SRBSDV لا ينتقل عن طريق البيض ، فإن الحوريات حديثة الفقس ليست خبيثة.
- باستخدام قلم فرشاة ، قم بتنظيف الحشرات برفق من الكأس التي تربي الحشرات في كأس جديد من شتلات الأرز الطازجة كل أسبوع حتى تفقس حوريات WBPH. استمر في تربية هذه الحوريات غير الخبيثة إلى 2 أو 3 بنين.
ملاحظة: نظف أسنانك بالفرشاة بعناية لتجنب تطاير WBPHs من الدورق أو إتلافها.
2. اكتساب الفيروسات وجمع الحشرات الخبيثة
- نقل الحشرات غير الخبيثة من الأكواب الزجاجية إلى نباتات الأرز الطازجة المصابة ب SRBSDV المغطاة بشبكة مقاومة للحشرات لفترة الوصول إلى اكتساب الفيروس 2 d (AAP) عن طريق التغذية على النباتات. ثم اجمع الحشرات في أكواب زجاجية تحتوي على شتلات أرز طازجة.
- بعد 2 د ، اجمع الحشرات من الأكواب الزجاجية باستخدام شفاط يدوي لتشريح واستئصال الأمعاء.
ملاحظة: الحد الأدنى من AAP ل SRBSDV هو 5 دقائق لكل من حوريات WBPH والبالغين ، ولكن يجب السماح للحشرات بالتغذية على نباتات الأرز الطازجة المصابة ب SRBSDV لمدة 2 د لتحقيق كفاءة اكتساب تصل إلى 80٪.
3. إعداد الكاشف
- قم بإذابة 8.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 3.5 جم من Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ، و 0.25 جم من NaH 2 PO4 في 1 مل من ddH2O لتحضير محلول 0.01 M منمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف 4 جم من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من PBS لتحضير 4٪ (m / v) بارافورمالدهيد في PBS.
- أضف 2 مل من Triton X-100 إلى 98 مل من PBS لتحضير 2٪ (v / v) Triton X-100.
4. تشريح البالغين واستئصال الشجاعة
- استخدم ماصة لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على مرحلة المجهر الضوئي.
- اجمع البالغين المصابين ب SRBSDV من أكواب زجاجية باستخدام شفاط يدوي وضعهم في أنابيب سعة 1.5 مل. ضع الأنابيب على الجليد لشل الحشرات ، ثم انقل شخصا بالغا مشلولا إلى 100 ميكرولتر من PBS على الشريحة مع رفع البطن.
ملاحظة: سوف تصاب الحشرات بالشلل التام بعد 5 دقائق على الجليد. - استخدم الملقط بيد واحدة لتثبيت الجسم ، ثم قم بإزالة الرأس بمجموعة أخرى من الملقط في اليد الأخرى.
- قم بتثبيت جانبي البطن بمجموعة واحدة من الملقط وقم بتثبيت ovipositor أو العضو التناسلي للذيل مع المجموعة الأخرى. ثم اسحب الغشاء البيني لجزء واحد من البطن بعناية وفضح الأمعاء ببطء في البطن.
- استمر في تمزيق الغشاء واسحب الأمعاء بالكامل تدريجيا من البطن. اسحب الذيل برفق ، المتصل بنهاية القناة الهضمية ، لإزالة القناة الهضمية الكاملة.
ملاحظة: اسحب بحذر شديد وإلا ستتلف القناة الهضمية. - ضع الأحشاء المستأصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب ، وتمتص المحلول برفق باستخدام ماصة لغسل الأحشاء جيدا.
5. تشريح الحوريات واستئصال الشجاعة
ملاحظة: أجسام الحوريات أكثر هشاشة من أجسام البالغين ، وتتلف الأمعاء بسهولة عند سحبها من الذيل. لذلك ، فإن الطريقة الأكثر موثوقية لاستئصال أمعاء الحورية هي عن طريق السحب من الرأس.
- استخدم ماصة لوضع 100 ميكرولتر من PBS على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على مرحلة المجهر الضوئي.
- اجمع الحوريات المصابة ب SRBSDV من أكواب زجاجية باستخدام شفاط يدوي وضعها في أنابيب سعة 1.5 مل. ضع الأنابيب على الثلج لشل الحشرات. بعد ذلك ، انقل حورية مشلولة إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت على الشريحة مع توجيه البطن لأعلى.
- استخدم الملقط لفصل ذيل الحورية. ثم قم بتثبيت جسم الحشرة لإصلاحه برفق واستخدم المجموعة الأخرى لتثبيت الرأس. اسحب الرأس برفق بعيدا عن الجسم مع الحفاظ على ارتباطه بالقناة الهضمية بحيث يتم فصل الرأس عن الجسم ، لكن القناة الهضمية لا تزال متصلة بالصدر والبطن.
ملاحظة: بعد فصل الرأس ، سوف يتدفق الجسم الشحمي للحورية ، مما يجعل PBS عكرا. قم بإزالة محلول PBS العكر وقم بتغييره باستخدام 100 ميكرولتر من PBS الطازج. - مع استمرار الملقط في تثبيت الجسم ، استخدم المجموعة الأخرى لتحريك الرأس بعناية ، واسحب القناة الهضمية تدريجيا.
- افصل القناة الهضمية برفق عن الرأس بملاقط ، وفي النهاية احصل على أمعاء سليمة دون الإضرار بجسم نطاط النبات.
- ضع الأحشاء المستأصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر ، وأضف 200 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب ، وتمتص المحلول برفق باستخدام ماصة لغسل الأحشاء جيدا.
ملاحظة: يجب تنظيف الأحشاء المستأصلة جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة أي أجسام دهنية ملوثة من تجويف البطن. يمكن أن تتداخل مع بروتوكول تلطيخ.
6. بروتوكولات وضع العلامات على فيروسات SRBSDV وبروتين الحشرات
- تحضير الأجسام المضادة ووسط التركيب المستخدم في هذا الفحص. الأجسام المضادة هي أجسام مضادة ل SRBSDV تحمل علامة Dylight 549 (أحمر) ضد فيروسات SRBSDV 18 ، وجسم مضاد مضاد ل VAMP7 يحمل علامة Dylight488 (أخضر) ضد بروتين الحشرات VAMP716,19 ، Dylight 633 phalloidin (أزرق) ، ووسط تركيب يحتوي على 4,6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI ، أزرق).
- ضع أحشاء WBPH المستأصلة حديثا والمغسولة ب PBS على الفور في 100 ميكرولتر من 4٪ (م / حجم) بارافورمالدهيد في أنبوب طرد مركزي سعة 200 ميكرولتر واحتفظ به لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: لا ينبغي نقع أحشاء WBPH التي تم استئصالها حديثا في برنامج تلفزيوني لفترة أطول ، وإلا ستتلف الخلايا الظهارية. - قم بإزالة 4٪ (m / v) paraformaldehyde باستخدام ماصة ، ثم أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 200 ميكرولتر. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة للتخلص من أي بارافورمالدهيد.
- كرر خطوة غسل PBS هذه مرتين.
- قم بإزالة PBS وإضافة 200 ميكرولتر من المنظفات غير الأيونية Triton X-100 (2٪ ، v / v). قم بنفاذ العينات في المنظف غير الأيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة 2٪ (v / v) Triton X-100 باستخدام ماصة ، ثم اغسل أي منظف متبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق مع 200 ميكرولتر من PBS (انظر الخطوتين 6.3 و 6.4).
- تمييع الجسم المضاد ل SRBSDV المسمى بواسطة Dylight 549 (أحمر) والجسم المضاد ل VAMP7 المسمى بواسطة Dylight 488 (أخضر) 1:50 مع 50 ميكرولتر من ألبومين مصل الثور (3٪ ، م / حجم).
- أضف الأجسام المضادة المخففة إلى الأنبوب واحتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة مخفف الجسم المضاد باستخدام ماصة ، ثم اغسل مخفف الجسم المضاد المتبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- تمييع 1 ميكرولتر من Dylight 633 phalloidin مع 50 ميكرولتر من PBS.
- أضف 50 ميكرولتر من القضيب المخفف إلى الأنبوب واحتضان العينات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة مخفف phalloidin باستخدام ماصة ، ثم اغسل القضيب المتبقي بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق مع 200 ميكرولتر من PBS.
ملاحظة: يعد الغسل الشامل أمرا بالغ الأهمية لتقليل الخلفية والربط غير المحدد. - ضع قطرة من وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على شريحة مجهر وانقل الشجاعة إلى الوسط.
ملاحظة: افتح كل أمعاء برفق باستخدام ملاقط وتجنب تكوين فقاعات. هناك حوالي 15 شجاعة لكل شريحة. - ضع غطاء زجاجي برفق على العينات دون إنشاء فقاعات.
ملاحظة: يجب تثبيت الشريحة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمنع التبريد الفلوري قبل الملاحظة باستخدام مجهر المسح بالليزر. - عرض جميع العينات باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر. التقط الصور باستخدام الضوء الأزرق واحفظ الملفات على جهاز كمبيوتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 جميع الخطوات في هذا البروتوكول: تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، واستئصال الأمعاء ، ووضع العلامات المناعية ، وصنع الشريحة.
تم تثبيت أحشاء WBPH المستأصلة من البالغين في 4٪ (م / حجم) بارافورمالدهيد ، وتخلل مع 2٪ (v / v) Triton X-100 ، ثم حضنت مع Dylight 633 phalloidin10،18. توضح الصورة المجهرية متحدة البؤر التي تمسح بالليزر في الشكل 2 الأجزاء الثلاثة للأمعاء المستأصلة بعد وضع العلامات عليها بالفالويدين ، وهي الأمعاء الأمامية والأمعاء الوسطى والأمعاء الخلفية على الترتيب. من بين هذه الأجزاء الثلاثة ، الأمعاء الوسطى هي موقع العدوى الأولي ل SRBSDV. يسهل هيكل الخلية الظهارية أحادية الطبقة للأمعاء دراسة التوطين الخلوي لبروتينات الحشرات والتوطين المشترك لبروتينات الفيروسات والحشرات.
قمنا أيضا باستئصال أحشاء WBPH وحضنها باستخدام Dylight 488 (أخضر) المسمى بالأجسام المضادة المضادة ل VAMP7 و SRBSDV virions مع Dylight 549 (أحمر) المسمى بالأجسام المضادة ل SRBSDV ، على التوالي17،18،19. يوضح الشكل 3 VAMP7 في سيتوبلازم الخلايا الطلائية في الأمعاء الوسطى WBPH. يظهر أن فيروسات VAMP7 و SRBSDV تتواجد في السيتوبلازم باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر ، مما يشير إلى أن VAMP7 قد يلعب دورا في انتقال الفيروس في الجسم الحي.
الشكل 1: نظرة عامة على خطوات تربية الحشرات واستئصال الأمعاء ووسم البروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مورفولوجيا الأمعاء WBPH. شوهد مضان من Dylight 633 phalloidin (أزرق ، وضع العلامات على الأكتين) باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. شريط مقياس ، 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وضع العلامات الفلورية لفيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية المتوسطة WBPH التي يتم عرضها باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. تم تحضين الأحشاء بجسم مضاد ل SRBSDV يحمل علامة Dylight 549 (أحمر) وجسم مضاد مضاد ل VAMP7 يحمل علامة Dylight 488 (أخضر). شريط مقياس ، 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحصول على أفضل النتائج ، ينبغي النظر في بعض النقاط الرئيسية. أولا ، من الضروري وجود نسبة عالية من الحشرات الخبيثة بين إجمالي السكان. على الرغم من أن الحد الأدنى من AAP ل SRBSDV بواسطة حوريات WBPH والبالغين هو 5 دقائق17 ، يجب السماح للحشرات بالتغذي على نباتات الأرز الطازجة المصابة ب SRBSDV لمدة 2 د لتحقيق كفاءة اكتساب تصل إلى 80٪. نظرا لأنه يمكن اكتشاف فيروسات SRBSDV في 80٪ من الأمعاء الوسطى18 ، فقد قمنا باستئصال الحشرات الخبيثة وتصنيفها عند 2 d بعد 2 d AAP في هذا البروتوكول. ثانيا ، ترتبط أحشاء البالغين والحوريات بالغدد اللعابية في الرأس وبالمبيض أو العضو التناسلي في الذيل. وبالتالي ، يمكن استئصال القناة الهضمية بعناية عن طريق السحب من الرأس أو الذيل. ومع ذلك ، يحتاج الفني إلى اختيار طريقة مناسبة للسحب بناء على حجم الحشرة. يمكن سحب الأمعاء البالغة في قطعة واحدة سليمة من الذيل بعد إزالة رأسها ، في حين أن أمعاء الحورية الأكثر هشاشة يمكن كسرها بسهولة عند سحبها من الذيل20. بشكل أكثر موثوقية ، يمكن إزالة أمعاء الحورية عن طريق سحب الرأس برفق بعد فصل القناة الهضمية عن ذيلها. باستخدام طرق التشريح / الاستئصال هذه ، يمكننا الحصول بسرعة على أحشاء سليمة والحفاظ على البنية التحتية الأصلية للخلايا الظهارية المعوية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتم تدمير الأعضاء الأخرى وهيكل الجسم الخارجي لنطاطات النبات ، وبالتالي الحفاظ على سلامة الأنسجة والأعضاء الأخرى مثل الغدد اللعابية والدملمف لاستكشاف أنشطة الفيروس وتفاعلاته21.
على الرغم من استخدام وضع العلامات المناعية على نطاق واسع ، إلا أنه قد يكون من الصعب الحصول على إشارات الفلورسنت القوية بدون بروتوكولات وضع العلامات المناسبة ، مما يؤدي إلى إهدار مكلف للمواد التجريبية والوقت22,23. قبل وضع العلامات ، يجب تنظيف الأحشاء المستأصلة جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني لاستبعاد الأجسام الدهنية الملوثة من تجويف البطن. يمكن للأجسام الدهنية الملوثة أن تمنع الأجسام المضادة من دخول الخلية وتجعل مجال الرؤية غير واضح عند ملاحظته باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. بعد هذا التنظيف ، يجب تثبيت الشجاعة على الفور للحفاظ على بنية الخلية. تأكد من أن وقت علاج النفاذية ليس طويلا جدا لمنع فيضان المستضد. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيف الأمعاء المتداخلة جيدا بعد الحضانة بأجسام مضادة مقترنة باللوسيفرين لتقليل الخلفية والربط غير المحدد. قبل الضغط على غطاء الزجاج ، افتح كل أمعاء برفق باستخدام ملاقط وحاول تجنب الفقاعات. عندما تكون الشريحة جاهزة ، يجب تخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية بدون ضوء لمنع التبريد الفلوري قبل الملاحظة باستخدام مجهر المسح بالليزر24,25.
يعد انتقال الفيروس عن طريق ناقل الحشرات خطوة حاسمة في وبائيات العديد من أمراض الفيروسات النباتية. وبالتالي فإن تعطيل هذا الانتقال هو استراتيجية فعالة ضد الأمراض الفيروسية 7,8 ، لذا فإن توضيح آلية انتقال هذه الفيروسات له أهمية نظرية وعملية كبيرة. وبالتالي فإن التألق المناعي مفيد جدا لتوطين فيروسات النبات المنقولة باستمرار ودراسة وظيفة بروتيناتها في الجسم الحي نحو فهم الخطوات المختلفة في انتقال الفيروس. في السنوات الأخيرة ، كان الفحص المجهري البؤري للمسح المناعي والمسح بالليزر من الأدوات الحاسمة المسؤولة عن الاختراقات في فهم تفاعلات الفيروس في الخلايا والأنسجة الناقلة أثناء انتقال فيروسات النبات. باستخدام البروتوكول الحالي ، تمكنا من توطين فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية للأمعاء الوسطى للبالغين والحوريات وتحديد أي تمركز. استخدم الفالويدين لتسمية الأكتين لعرض الخطوط العريضة لغشاء الخلية الظهارية في الأمعاء الوسطى، واستخدم DAPI لتسمية النواة. تتميز هياكل الخلايا الظهارية للأمعاء WBPH والأمعاء الوسطى عند عرضها باستخدام المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. هذا البروتوكول هو طريقة موثوقة لعرض تشريح الجهاز الهضمي للحشرات ، وتحديد موقع الفيروسات ، ومسببات الأمراض الأخرى وبروتينات الحشرات ، ودراسة أنشطة مسببات الأمراض في الحشرات ، ووظائف بروتين الحشرات ، والتفاعلات بين مسببات الأمراض وبروتينات الحشرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630058 إلى X.W. و 31772134 إلى WL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
