Summary
这种用于切除昆虫肠道中植物病毒蛋白和载体昆虫蛋白的免疫荧光标记的协议可用于研究病毒和载体昆虫之间的相互作用、昆虫蛋白功能和病毒传播的分子机制。
Abstract
自然界中的大多数植物病毒都是通过半翅目昆虫从一种植物传播到另一种植物的。在病毒传播方面效率高的媒介昆虫的高种群密度在田间病毒流行中起着关键作用。研究病毒-昆虫媒介相互作用可以促进我们对病毒传播和流行病的理解，目的是设计控制植物病毒及其媒介昆虫的新策略。免疫荧光标记已被广泛用于分析病原体和宿主之间的相互作用，并用于白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera），它有效地传播南方水稻黑条纹侏儒病毒（SRBSDV，斐济病毒属，呼肠孤科），以定位中肠上皮细胞中的病毒粒子和昆虫蛋白。使用激光扫描共聚焦显微镜，我们研究了中肠上皮细胞的形态特征，昆虫蛋白的细胞定位以及病毒粒子和昆虫蛋白的共定位。该协议可用于研究昆虫中的病毒活动，昆虫蛋白质的功能以及病毒与媒介昆虫之间的相互作用。
Introduction
大多数描述的植物病毒是由半翅目昆虫传播的，包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马1，2。半翅目昆虫的刺吸口器刺穿植物组织以进食和分泌唾液，同时有效地传播病毒2。已经描述了植物病毒通过媒介昆虫的不同传播机制。这些包括非持久性、半持久性和持久性。持久性类型要么是非繁殖型，要么是繁殖型3，4，但对于这两种类型，传播的病毒必须在昆虫的整个身体中移动。在持续繁殖模式下，病毒最初感染并在昆虫肠道的上皮细胞中复制，然后传播到不同的组织中，最终进入唾液腺，然后从那里它们可以在昆虫进食期间通过唾液引入植物5，6。持续传播的病毒通过不同的器官并在其昆虫载体中复制，这需要病毒和载体成分在不同阶段的特定相互作用7，8。
病毒蛋白和昆虫蛋白必须相互作用，以促进病毒识别、感染、复制或传播的关键过程在媒介昆虫中9，10。虽然光学显微镜可用于观察昆虫的细胞结构，但它不能显示病毒粒子分布，病毒蛋白和昆虫蛋白的细胞定位或共定位，或昆虫组织和细胞的超微结构。免疫荧光标记首先由Coons等人通过标记特定的荧光素抗体在小鼠的吞噬细胞中进行，现在被广泛使用11。免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是最早开发的免疫标记技术之一，是基于抗原与抗体之间的特异性结合反应11，12。已知抗体首先用荧光素标记，荧光素用作检测细胞或组织中相应抗原的探针13，14。荧光素标记的抗体与细胞或组织中的相应抗原结合后，探针在用激发波长照射并用荧光显微镜观察以定位抗原15时会发出明亮的荧光。
植物病毒的大多数媒介昆虫是半翅目。对植物病毒具有高传播效率的媒介昆虫种群密度较高，可导致病毒流行5。南方水稻黑纹矮病毒（SRBSDV，斐济病毒属，呼肠孤病毒科）是水稻最严重的病原菌之一，在东亚和东南亚的水稻种植区迅速蔓延，自2010年以来造成严重减产16，17。白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera Horváth）的成虫和若虫以持续繁殖的方式高效将SRBSDV传播给水稻。现场研究表明，SRBSDV诱发的水稻黑条纹侏儒病的暴发通常与WBPH的大规模长距离迁移同时发生，这是SRBSDV流行的关键因素7，8，18。囊泡相关膜蛋白7（VAMP7）是一种可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE），可通过囊泡融合介导物质的转运。VAMP7在体外与SRBSDV的外主要衣壳蛋白相互作用，这表明VAMP7可能与病毒传播密切相关16。
在这里介绍的方案中，我们从病毒性WBPH中切除肠道，作为标记中肠上皮细胞中SRBSDV病毒粒子和VAMP7的例子16。作为病毒的初始入侵部位，中肠上皮在病毒感染、复制和传播中起着至关重要的作用。首先，我们详细介绍了从若虫和WBPH成虫中切除肠道的步骤。其次，我们使用特定的荧光素标记抗体来标记肠道上皮细胞中的SRBSDV病毒粒子和VAMP7。然后，我们通过激光扫描共聚焦显微镜观察上皮细胞以及病毒粒子和VAMP7的细胞位置。结果表明，SRBSDV病毒粒子和VAMP7在中肠上皮细胞的细胞质中可共定位，提示VAMP7的特异性功能可能与中肠上皮细胞病毒粒子的传播有关。
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Protocol
1. 非病毒昆虫饲养
- 从稻田收集WBPH，并在28°C的培养箱中用防虫网覆盖的1L玻璃烧杯中收集WBPH，16小时光照和8小时黑暗。由于SRBSDV不通过卵传播，因此新孵化的若虫不会产生病毒性。
- 每周用毛笔轻轻地将烧杯中的昆虫刷入新鲜水稻幼苗的新烧杯中，直到WBPH若虫孵化。继续将这些孵化的非病毒若虫饲养到2或3龄。
注意：小心刷牙，以避免WBPH从烧杯中飞出或损坏它们。
2. 病毒获取和病毒性昆虫的采集
- 通过以植物为食，将玻璃烧杯中的非病毒性昆虫转移到覆盖有防虫网的新鲜SRBSDV感染的水稻植物上，以进行2 d病毒获取访问期（AAP）。然后，将昆虫收集在装有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。
- 2天后，用手动吸气器从玻璃烧杯中收集昆虫，用于解剖和切除肠道。
注意：对于WBPH若虫和成虫，SRBSDV的最小AAP均为5分钟，但应允许昆虫以新鲜感染SRBSDV的水稻植物为食2天，以达到高达80%的采集效率。
3. 试剂制备
- 将 8.5 g NaCl、3.5 g Na 2 HPO 4·12H 2 O 和 0.25 g NaH 2 PO4 溶解在 1 mLddH2O 中，制备0.01 M 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液。
- 将 4 g 多聚甲醛加入 100 mL PBS 中，在 PBS 中制备 4% （m/v） 多聚甲醛。
- 将 2 mL Triton X-100 加入 98 mL PBS 中，制备 2% （v/v） Triton X-100。
4. 成人解剖和内脏切除
- 使用移液器将 100 μL PBS 放在载玻片上。将载玻片放在光学显微镜的载物台上。
- 用手动吸引器从玻璃烧杯中收集感染 SRBSDV 的成人，并将其放入 1.5 mL 管中。将试管放在冰上以麻痹昆虫，然后将瘫痪的成虫转移到载玻片上的 100 μL PBS 中，腹部向上。
注意：昆虫在冰上5分钟后将彻底瘫痪。 - 一只手用镊子夹住身体，然后用另一只手用另一组镊子取下头部。
- 用一组镊子夹住腹部的两侧，用另一组镊子夹住产卵器或尾巴的交配器官。然后小心地拉开一个腹段的节间膜，慢慢暴露腹部的肠道。
- 继续撕开膜，逐渐从腹部拉出完整的肠道。轻轻拉下连接到肠道末端的尾巴，以去除整个肠道。
注意：非常小心地拉动，否则肠道会损坏。 - 将切除的内脏放入 200 μL 离心管中，向管中加入 200 μL PBS，然后用移液管轻轻吸出释放溶液以彻底清洗内脏。
5.若虫解剖和内脏切除
注意：若虫身体比成年身体更脆弱，从尾巴拉出时肠道很容易受损。因此，切除若虫肠道最可靠的方法是从头部拔出。
- 使用移液器将 100 μL PBS 放在载玻片上。将载玻片放在光学显微镜的载物台上。
- 用手动抽吸器从玻璃烧杯中收集感染 SRBSDV 的若虫，并将它们放入 1.5 mL 管中。将试管放在冰上以麻痹昆虫。然后，将瘫痪若虫转移到载玻片上的 100 μL 缓冲液中，腹部朝上。
- 用镊子拆下若虫的尾巴。然后夹住昆虫身体轻轻固定，用另一组夹住头部。轻轻地将头部从身体上拉开，同时仍然保持其与肠道的附着，使头部与身体分离，但肠道仍附着在胸部和腹部。
注意：头部分离后，若虫的脂肪体会流出，使PBS浑浊。取出浑浊的 PBS 溶液，用 100 μL 新鲜 PBS 更换。 - 在镊子仍然夹住身体的情况下，用另一组小心地移动头部，逐渐拉出肠道。
- 用镊子轻轻地将肠道从头部分离，最终在不损坏飞虱身体的情况下获得完整的肠道。
- 将切除的内脏放入 200 μL 离心管中，向管中加入 200 μL PBS，然后用移液管轻轻吸出释放溶液以彻底清洗内脏。
注意：切除的肠道应用PBS清洁干净，以清除腹腔中任何污染的脂肪体;它们会干扰染色方案。
6. SRBSDV病毒粒子和昆虫蛋白的标记方案
- 制备该测定中使用的抗体和封片剂。抗体是用 Dylight 549（红色）标记的抗 SRBSDV 抗体，针对 SRBSDV 病毒粒子 18，用 Dylight 488（绿色）标记的抗 VAMP7 抗体，针对昆虫蛋白VAMP7 16，19、Dylight 633 鬼笔环肽（蓝色）标记，以及含有 4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的封片剂。
- 立即将新鲜切除和PBS洗涤的WBPH肠放入200μL离心管中的100μL4%（m / v）多聚甲醛中，并在室温下保持2小时。
注意：新鲜切除的WBPH肠道不应长时间浸泡在PBS中，否则上皮细胞会受损。 - 用移液器去除 4% （m/v） 多聚甲醛，然后将 200 μL PBS 加入 200 μL 离心管中。10分钟后，使用移液器去除PBS以消除任何多聚甲醛。
- 重复此PBS洗涤步骤两次。
- 取出 PBS 并加入 200 μL 非离子洗涤剂 Triton X-100 （2%， v/v）。在室温下将样品在非离子洗涤剂中透化30分钟。
- 用移液器取出 2% （v/v） Triton X-100，然后用 200 μL PBS 洗涤三次 10 分钟洗去任何剩余的洗涤剂（参见步骤 6.3 和 6.4）。
- 用 50 μL 公牛血清白蛋白 （3%， m/v） 稀释 Dylight 549（红色）标记的抗 SRBSDV 抗体和 Dylight 488（绿色）标记的抗 VAMP7 抗体。
- 将稀释的抗体加入管中，并将样品在4°C孵育过夜。
- 用移液器除去抗体稀释剂，然后用200μL PBS洗涤三次10分钟洗去剩余的抗体稀释剂。
- 用 50 μL PBS 稀释 1 μL Dylight 633 鬼笔环肽。
- 向管中加入 50 μL 稀释的鬼笔环肽，并在室温下孵育样品 2 小时。
- 用移液器除去鬼笔环肽稀释剂，然后用200μLPBS洗涤三次10分钟洗去剩余的鬼笔环肽。
注意：彻底清洗对于减少背景和非特异性结合至关重要。 - 将一滴含有DAPI的封片剂放在显微镜载玻片上，并将内脏转移到培养基上。
注意：用镊子轻轻展开每个肠道，避免产生气泡。每张幻灯片大约有 15 个胆量。 - 轻轻地将盖玻片放在样品上，不要产生气泡。
注意：在用激光扫描共聚焦显微镜观察之前，载玻片应在黑暗中保持在4°C以抑制荧光猝灭。 - 使用激光扫描共聚焦显微镜查看所有样品。使用蓝光捕获图像并将文件保存在计算机上。
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Representative Results
图1说明了该协议中的所有步骤：昆虫饲养，病毒获取，肠道切除，免疫荧光标记和制作载玻片。
从成人中切除的WBPH内脏固定在4%（m / v）多聚甲醛中，用2%（v / v）Triton X-100透化，然后与Dylight 633鬼笔环肽10，18一起孵育。 图2 中的激光扫描共聚焦显微照片显示了用鬼笔环肽标记后切除的肠道的三个部分，它们分别是前肠，中肠和后肠。在这三个部分中，中肠是SRBSDV的初始感染部位。肠道的单层上皮细胞结构有助于研究昆虫蛋白的细胞定位以及病毒和昆虫蛋白的共定位。
我们还切除了WBPH内脏，并将它们与Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体和SRBSDV病毒粒子与Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体一起孵育，分别为17，18，19。图3显示了WBPH中肠上皮细胞细胞质中的VAMP7。VAMP7和SRBSDV病毒粒子与激光扫描共聚焦显微镜在细胞质中共定位，表明VAMP7可能在体内病毒传播中发挥作用。
图 1：饲养昆虫、切除肠道和标记蛋白质的步骤概述。 请点击此处查看此图的大图。
图2：WBPH肠道的形态。 用激光扫描共聚焦显微镜观察来自Dylight 633鬼笔环肽（蓝色，标记肌动蛋白）的荧光。比例尺，200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用激光扫描共聚焦显微镜观察 WBPH 中肠上皮细胞中 SRBSDV 病毒粒子和 VAMP7 的荧光标记。 将胆量与用Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体和用Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体一起孵育。比例尺，20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
为了获得最佳结果，应考虑几个关键点。首先，病毒性昆虫在总种群中的高比例是必要的。虽然WBPH若虫和成虫对SRBSDV的最低AAP为5分17秒，但应允许昆虫以新鲜SRBSDV感染的水稻植物为食2天，以实现高达80%的采集效率。由于可以在80%的中肠18中检测到SRBSDV病毒粒子，因此我们在本协议中2 d AAP后2 d切除并标记了病毒性昆虫。其次，成虫和若虫的肠道与头部的唾液腺和尾巴的产卵器或交配器官相连。因此，可以通过从头部或尾部拉动来小心地切除肠道。但是，技术人员需要根据昆虫的大小选择合适的拉动方法。成年若虫的肠道在头部被移除后可以从尾巴上拉成一块完整的部分，而更脆弱的若虫的肠道在从尾巴上拉出时很容易断裂20.更可靠的是，若虫肠道从尾巴上分离后，可以通过轻轻拉动头部来去除。使用这些解剖/切除方法，我们可以快速获得完整的肠道并保留肠道上皮细胞的天然超微结构。此外，飞虱的其他器官和外壳不被破坏，从而保持其他组织和器官如唾液腺和血淋巴的完整性，以探索病毒的活动和相互作用21。
尽管免疫荧光标记被广泛使用，但如果没有适当的标记方案，可能难以获得强荧光信号，从而导致实验材料和时间的昂贵浪费22，23。在贴标签之前，应用PBS充分清洁切除的肠道，以排除腹腔中污染的脂肪体。当用激光扫描共聚焦显微镜观察时，污染的脂肪体可以阻止抗体进入细胞并使视野不清晰。清洁后，应立即固定内脏以保持细胞结构。确保透化处理时间不要太长，以防止抗原溢出。此外，透化的肠在与荧光素偶联抗体孵育后应彻底清洁，以减少背景和非特异性结合。在按下盖玻片之前，用镊子轻轻展开每个肠道，并尽量避免气泡。当载玻片准备好时，应将其储存在4°C无光以抑制荧光猝灭，然后再用激光扫描共聚焦显微镜24，25观察。
通过昆虫媒介传播病毒是许多植物病毒病流行病学的关键步骤。因此，阻断这种传播是对抗病毒病的有效策略7，8，因此阐明这些病毒的传播机制具有重要的理论和实践意义。因此，免疫荧光对于定位持续传播的植物病毒和研究其蛋白质在体内的功能以了解病毒传播的各个步骤非常有用。近年来，免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜一直是在了解植物病毒传播过程中载体细胞和组织中病毒相互作用方面取得突破的关键工具。使用本协议，我们能够定位成人和若虫中肠上皮细胞中的SRBSDV病毒粒子和VAMP7，并确定任何共定位。鬼笔环肽用于标记肌动蛋白以查看中肠上皮细胞膜的轮廓，DAPI用于标记细胞核。当用激光扫描共聚焦显微镜观察时，WBPH肠道和中肠上皮细胞的结构是不同的。该协议是查看昆虫消化道解剖结构，定位病毒粒子，其他病原体和昆虫蛋白以及研究昆虫中的病原体活性，昆虫蛋白功能以及病原体与昆虫蛋白之间相互作用的可靠方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（31630058 X.W.和31772134 W.L.）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
