Summary
Denne protokollen for immunfluorescerende merking av både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i utskåret insekttarm kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus- og vektorinsekter, insektproteinfunksjoner og molekylære mekanismer som ligger til grunn for virusoverføring.
Abstract
De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en annen av hemipteran insekter. En høy befolkningstetthet av vektorinsekter som er svært effektive ved virusoverføring, spiller en nøkkelrolle i virusepidemier i felt. Studier av virus-insektvektorinteraksjoner kan fremme vår forståelse av virusoverføring og epidemier med sikte på å designe nye strategier for å kontrollere plantevirus og deres vektorinsekter. Immunfluorescensmerking har blitt mye brukt til å analysere interaksjoner mellom patogener og verter og brukes her i hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører det sørlige risstripete dvergviruset (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), for å lokalisere virionene og insektproteinene i midttarmepitelcellene. Ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi studerte vi de morfologiske egenskapene til midttarmepitelceller, cellulær lokalisering av insektproteiner og samlokalisering av virioner og et insektprotein. Denne protokollen kan brukes til å studere virusaktiviteter hos insekter, funksjoner av insektproteiner og interaksjoner mellom virus og vektorinsekt.
Introduction
De fleste beskrevne plantevirus overføres av insekter fra ordenen Hemiptera som inkluderer bladlus, hvitefugler, bladhoppere, plantehoppere og trips 1,2. De piercing-sugende munndelene av hemipteraninsekter gjennomsyrer plantevevet for fôring og utskillelse av spytt, samtidig som viruset overføres effektivt2. Ulike overføringsmekanismer av plantevirus av vektorinsekter er beskrevet. Disse inkluderer ikke-vedvarende, semipersistent og vedvarende. Den vedvarende typen er enten ikke-propagativ eller propagativ3,4, men for begge disse typene må det overførte viruset bevege seg gjennom hele insektets kropp. I vedvarende-propagativ modus infiserer virus først og replikerer i epitelceller i insektets tarm, forplanter seg deretter i forskjellige vev, og til slutt inn i spyttkjertlene, hvorfra de deretter kan innføres i en plante gjennom spytt under insektfôring 5,6. Vedvarende overførte virus beveger seg gjennom forskjellige organer og replikerer i insektvektorene, noe som krever spesifikke interaksjoner mellom virus- og vektorkomponenter i forskjellige stadier 7,8.
Virale proteiner og insektproteiner må samhandle for å lette kritiske prosesser for virusgjenkjenning, infeksjon, replikasjon eller spredning i vektorinsekter 9,10. Selv om optisk mikroskopi kan brukes til å observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller kolokalisering av virale proteiner og insektprotein, eller ultrastruktur av insektvev og celler. Immunfluorescensmerking ble først utført av Coons et al. i fagocytiske celler i musen ved å merke spesifikke fluoresceinantistoffer, og nå brukes den mye11. Immunfluorescensteknikken, også kjent som fluorescensantistoffteknikken, er en av de tidligste immunologiske merkingsteknikkene som er utviklet og er basert på den spesifikke bindingsreaksjonen mellom antigenet og antistoffet11,12. Det kjente antistoffet er først merket med fluorescein, som brukes som en sonde for å oppdage de tilsvarende antigenene i cellene eller vevene13,14. Etter at det fluoresceinmerkede antistoffet binder seg til det tilsvarende antigenet i celler eller vev, vil sonden avgi lys fluorescens når den bestråles med eksitasjonsbølgelengder og ses med et fluorescensmikroskop for å lokalisere antigenet15.
De fleste vektorinsekter av plantevirus er hemipteraner. En høyere befolkningstetthet av vektorinsekter som har høy overføringseffektivitet for planteviruset kan føre til virusepidemier5. Sørlig ris svart stripete dvergvirus (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), en av de mest alvorlige patogener av ris, har raskt spredt seg gjennom risvoksende områder i Øst- og Sørøst-Asia, og forårsaket alvorlige avkastningstap siden 201016,17. Voksne og nymfer av hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende propagativ måte med høy effektivitet. Feltstudier har vist at utbrudd av SRBSDV-indusert ris svart stripete dvergsykdom vanligvis sammenfaller med masse langdistansemigrasjon av WBPHs, en avgjørende faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikkelassosiert membranprotein 7 (VAMP7) er en løselig N-etylmaleimidsensitiv faktorfesteproteinreseptor (SNARE), som kan formidle transport av stoffer via vesikkelfusjon. VAMP7 interagerer med det ytre store kapsidproteinet til SRBSDV in vitro, noe som indikerer at VAMP7 kan være nært forbundet med virusoverføring16.
I protokollen som presenteres her, fjernet vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midttarmepitelceller16. Som det første invasjonsstedet for virus, spiller midttarmepitelet viktige roller i virusinfeksjon, replikasjon og overføring. Først detaljerte vi trinnene for å skille tarmen fra nymfer og voksne av WBPHs. For det andre brukte vi spesifikke fluoresceinmerkede antistoffer for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Deretter observerte vi epitelceller og den cellulære plasseringen av virionene og VAMP7 via et laserskanning konfokalmikroskop. Resultatene viste at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne samlokaliseres i cytoplasmaet til midttarmepitelcellene, noe som tyder på at den spesifikke funksjonen til VAMP7 kan være relatert til spredning av virioner fra midttarmepitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ikke-viruliferous insektoppdrett
- Samle WBPHs fra rismarker og bak med risplanter i 1 L glassbeger dekket med insektsikkert nett i en inkubator ved 28 ° C med 16 t lys og 8 h mørk. Fordi SRBSDV ikke overføres via egg, er nyklekte nymfer ikke viruliferous.
- Med en penselpenn børster du forsiktig insekter fra begeroppdrettsinsektene i et nytt beger med ferske risplanter hver uke til WBPH-nymfene har klekket. Fortsett oppdrett disse klekkede nonviruliferous nymfer til 2- eller 3-instar.
NOTAT: Børst forsiktig for å unngå at WBPH-er flyr fra begeret eller skader dem.
2. Virusoppkjøp og innsamling av viruliferous insekter
- Overfør ikke-viruliferøse insekter fra glassbegeret til friske SRBSDV-infiserte risplanter dekket med et insektsikkert nett for en 2 d virusoppkjøpstilgangsperiode (AAP) ved å mate på planter. Deretter samler insekter i glassbeger som inneholder friske risplanter.
- Etter 2 d, samle insekter fra glassbeger med en manuell aspirator for disseksjon og utskjæring av tarmen.
MERK: Minimum AAP for SRBSDV er 5 min for både WBPH-nymfer og voksne, men insektene bør få lov til å mate på friske SRBSDV-infiserte risplanter i 2 d for å oppnå oppkjøpseffektiviteten på opptil 80%.
3. Forberedelse av reagens
- Løs opp 8,5 g NaCl, 3,5 g Na2 HPO4·12H2O og 0,25 gNaH2PO4i 1 mlddH2Ofor å fremstille 0,01 M oppløsning av fosfatbufret saltvann(PBS).
- Tilsett 4 g paraformaldehyd til 100 ml PBS for å fremstille 4 % (m/v) paraformaldehyd i PBS.
- Tilsett 2 ml Triton X-100 i 98 ml PBS for å forberede 2% (v/v) Triton X-100.
4. Disseksjon av voksne og eksisjon av tarm
- Bruk en pipettor til å plassere 100 μL PBS på et glassglass. Plasser lysbildet på scenen i et optisk mikroskop.
- Samle SRBSDV-infiserte voksne fra glassbeger med en manuell aspirator og legg dem i 1,5 ml rør. Plasser rørene på is for å lamme insekter, og overfør deretter en lammet voksen til 100 μL PBS på lysbildet med magen opp.
MERK: Insektene vil bli grundig lammet etter 5 min på is. - Bruk pinsett i den ene hånden for å klemme kroppen, og fjern deretter hodet med et annet sett pinsett i den andre hånden.
- Klem sidene av magen med ett sett pinsett og klem ovipositoren eller det kopulerende organet i halen med det andre settet. Trekk deretter den intersegmentale membranen i det ene buksegmentet forsiktig og sakte ut tarmen i magen.
- Fortsett å rive bort membranen og trekk gradvis ut hele tarmen fra magen. Trekk forsiktig av halen, som er koblet til enden av tarmen, for å fjerne hele tarmen.
MERK: Trekk veldig forsiktig eller tarmen vil bli skadet. - Plasser utskåret tarm i et 200 μL sentrifugerør, tilsett 200 μL PBS til røret, og sug forsiktig løsningen med en pipette for å vaske tarmene grundig.
5. Disseksjon av nymfer og eksisjon av tarm
MERK: Nymfelegemer er mer skjøre enn voksne kropper, og tarmen blir lett skadet når den trekkes fra halen. Derfor er den mest pålitelige metoden for å skjære ut nymfetarmen ved å trekke fra hodet.
- Bruk en pipettor til å plassere 100 μL PBS på et glassglass. Plasser lysbildet på scenen i et optisk mikroskop.
- Samle SRBSDV-infiserte nymfer fra glassbegere med en manuell aspirator og legg dem i 1,5 ml rør. Legg rørene på is for å lamme insekter. Deretter overfører du en lammet nymfe til 100 μL buffer på lysbildet med magen vendt oppover.
- Bruk pinsett til å løsne halen på nymfen. Klem deretter insektslegemet for å fikse forsiktig og bruk det andre settet til å klemme hodet. Trekk hodet forsiktig bort fra kroppen mens du fortsatt opprettholder vedlegget til tarmen slik at hodet løsnes fra kroppen, men tarmen er fortsatt festet til brystkassen og magen.
MERK: Etter at hodet er løsrevet, vil corpus adiposum av nymfen strømme ut, noe som gjør PBS uklar. Fjern den uklare PBS-løsningen og bytt med 100 μL fersk PBS. - Med pinsetten fortsatt klemmer kroppen, bruk det andre settet til å bevege hodet forsiktig, og trekk gradvis ut tarmen.
- Løsne tarmen forsiktig fra hodet med pinsett, og til slutt få en intakt tarm uten å skade planthopperens kropp.
- Plasser utskåret tarm i et 200 μL sentrifugerør, tilsett 200 μL PBS til røret, og sug forsiktig løsningen med en pipette for å vaske tarmene grundig.
MERK: Den utskårne tarmen skal rengjøres godt med PBS for å fjerne eventuelle forurensende fettlegemer fra bukhulen; De kan forstyrre fargeprotokollen.
6. Merkingsprotokoller for SRBSDV-virioner og et insektprotein
- Forbered antistoffene og monteringsmediet som brukes i denne analysen. Antistoffer er anti-SRBSDV antistoff merket med Dylight 549 (rød) mot SRBSDV virioner 18, anti-VAMP7 antistoff merket med Dylight 488 (grønn) mot insektproteinet VAMP716,19, Dylight 633 phalloidin (blå), og monteringsmedium inneholdende 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå).
- Plasser den nyvaskede og PBS-vaskede WBPH-tarmen umiddelbart i 100 μL 4% (m / v) paraformaldehyd i et 200 μL sentrifugerør og hold i 2 timer ved romtemperatur.
MERK: Den nyskårne WBPH-tarmen bør ikke bløtlegges i PBS i lengre tid, ellers vil epitelcellene bli skadet. - Fjern 4 % (m/v) paraformaldehyd med en pipettor, og tilsett deretter 200 μL PBS i sentrifugerøret på 200 μL. Etter 10 minutter, fjern PBS med en pipettor for å eliminere paraformaldehyd.
- Gjenta dette PBS-vasketrinnet to ganger.
- Fjern PBS og tilsett 200 μL ikke-ionisk vaskemiddel Triton X-100 (2%, v / v). Permeabiliser prøvene i det ikke-ioniske vaskemiddelet i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern 2 % (v/v) Triton X-100 med en pipettor, og vask deretter bort gjenværende vaskemiddel med tre 10 min vask med 200 mikroliter PBS (se trinn 6.3 og 6.4).
- Fortynnet anti-SRBSDV antistoff merket av Dylight 549 (rød) og anti-VAMP7 antistoff merket med Dylight 488 (grønn) 1:50 med 50 μL bull serum albumin (3%, m / v).
- Tilsett de fortynnede antistoffene i tuben og inkuber prøvene over natten ved 4 °C.
- Fjern antistofffortynningsvæsken med en pipettor, og vask deretter bort det gjenværende antistofffortynningsmiddelet med tre 10 minutters vask med 200 mikrol PBS.
- Fortynn 1 μL Dylight 633 phalloidin med 50 μL PBS.
- Tilsett 50 μl fortynnet phalloidin til røret og inkuber prøver i 2 timer ved romtemperatur.
- Fjern phalloidin fortynningsvæsken med en pipettor, og vask deretter bort det resterende phalloidin med tre 10 min vasker med 200 μL PBS.
MERK: Grundig vask er avgjørende for å redusere bakgrunnen og uspesifikk binding. - Plasser en dråpe monteringsmedium som inneholder DAPI på et mikroskopglass og overfør tarmen til mediet.
NOTAT: Brett forsiktig ut hver tarm med pinsett og unngå å skape bobler. Det er omtrent 15 guts per lysbilde. - Legg forsiktig et dekkglass over prøvene uten å skape bobler.
MERK: Lysbildet bør holdes ved 4 °C i mørket for å hemme fluorescensslukking før observasjon med et laserskanning konfokalmikroskop. - Se alle prøver med et laserskanning konfokalmikroskop. Ta bildene med blått lys og lagre filene på en datamaskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer alle trinnene i denne protokollen: insektoppdrett, virusoppkjøp, eksisjon av tarmen, immunfluorescerende merking og fremstilling av lysbildet.
Utskåret WBPH-tarm fra voksne ble fiksert i 4% (m / v) paraformaldehyd, permeabilisert med 2% (v / v) Triton X-100, og deretter inkubert med Dylight 633 phalloidin10,18. Laserskanningens konfokalmikrograf i figur 2 viser de tre delene av den utskårne tarmen etter merking med falloidin, og de er henholdsvis fortarmen, midttarmen og baktarmen. Blant disse tre delene er midttarmen det første infeksjonsstedet for SRBSDV. Den monolags epitelcellestrukturen i tarmen letter studiet av cellulær lokalisering av insektproteiner og samlokalisering av virus og insektproteiner.
Vi har også skåret WBPH tarmer og inkubert dem med Dylight 488 (grønn) merket anti-VAMP7 antistoff og SRBSDV virioner med Dylight 549 (rød) merket anti-SRBSDV antistoff, henholdsvis17,18,19. Figur 3 viser VAMP7 i cytoplasma av WBPH midgut epitelceller. VAMP7 og SRBSDV virioner er vist å samlokalisere i cytoplasma med et laserskanning konfokalmikroskop, noe som tyder på at VAMP7 kan spille en rolle i virusoverføring in vivo.
Figur 1: Oversikt over trinn i oppdrett av insekter, utskjæring av tarm og merking av protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologi av WBPH-tarm. Fluorescens fra Dylight 633 phalloidin (blå, merking aktin) ble sett med et laserskanning konfokalmikroskop. Skala bar, 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensmerking av SRBSDV-virioner og VAMP7 i WBPH midgut epitelceller sett med et laserskanning konfokalmikroskop. Guts ble inkubert med anti-SRBSDV antistoff merket med Dylight 549 (rød) og anti-VAMP7 antistoff merket med Dylight 488 (grønn). Skala bar, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For best resultat, bør noen viktige punkter vurderes. For det første er et høyt forhold av viruliferous insekter blant den totale befolkningen nødvendig. Selv om minimum AAP for SRBSDV av WBPH-nymfer og voksne er 5 min17, bør insektene få lov til å mate på friske SRBSDV-infiserte risplanter i 2 d for å oppnå en oppkjøpseffektivitet på opptil 80%. Siden SRBSDV-virionene kan påvises i 80% av midguts18, fjernet og merket vi viruliferous insekter ved 2 d etter en 2 d AAP i denne protokollen. For det andre er tarmen til voksne og nymfer forbundet med spyttkjertlene i hodet og til ovipositor eller kopulerende organ i halen. Dermed kan tarmen forsiktig skåret ut ved å trekke fra hodet eller halen. Imidlertid må teknikeren velge en passende metode for å trekke basert på insektets størrelse. Den voksne tarmen kan trekkes i ett intakt stykke fra halen etter at hodet er fjernet, mens tarmen til den mer skjøre nymfen lett brytes når den trekkes fra halen20. Mer pålitelig kan nymfetarmen fjernes ved å forsiktig trekke hodet etter å ha løsnet tarmen fra halen. Ved hjelp av disse disseksjons-/eksisjonsmetodene kan vi raskt få intakt tarm og bevare den opprinnelige ultrastrukturen til tarmepitelcellene. I tillegg blir ikke andre organer og det ytre kroppsskallet til plantehoppere ødelagt, og opprettholder dermed integriteten til andre vev og organer som spyttkjertler og hemolymfe for å utforske virusaktiviteter og interaksjoner21.
Selv om immunfluorescensmerking er mye brukt, kan sterke fluorescerende signaler være vanskelig å oppnå uten riktige merkingsprotokoller, noe som resulterer i kostbart sløsing med eksperimentelle materialer og tid22,23. Før merking bør den utskårne tarmen rengjøres godt med PBS for å utelukke forurensende fettlegemer fra bukhulen. De forurensende fettlegemene kan forhindre antistoffer i å komme inn i cellen og gjøre synsfeltet uklart når det observeres med laserskanning konfokalmikroskop. Etter denne rengjøringen bør tarmen festes umiddelbart for å bevare cellestrukturen. Sørg for at permeabiliseringsbehandlingstiden ikke er for lang for å forhindre antigenoverløp. I tillegg bør permeabilisert tarm rengjøres grundig etter inkubering med luciferin-konjugerte antistoffer for å redusere bakgrunnen og ikke-spesifikk binding. Før glasset trykkes, brett forsiktig ut hver tarm med pinsett og prøv å unngå bobler. Når lysbildet er klart, bør det oppbevares ved 4 °C uten lys for å hemme fluorescensslukking før observasjon med laserskanning konfokalmikroskop24,25.
Virusoverføring av insektvektoren er et avgjørende skritt i epidemiologien til mange plantevirussykdommer. Å forstyrre denne overføringen er dermed en effektiv strategi mot virussykdommer7,8, så å belyse overføringsmekanismen til disse virusene er av stor teoretisk og praktisk betydning. Immunfluorescens er derfor svært nyttig for å lokalisere vedvarende overførte plantevirus og studere funksjonen til deres proteiner in vivo mot å forstå de ulike trinnene i virusoverføring. I de senere år har immunfluorescens og laserskanning konfokalmikroskopi vært kritiske verktøy som er ansvarlige for gjennombrudd for å forstå virusinteraksjoner i vektorceller og vev under overføring av plantevirus. Ved hjelp av den nåværende protokollen var vi i stand til å lokalisere SRBSDV-virioner og VAMP7 i epitelceller i midguts hos voksne og nymfer og bestemme eventuell samlokalisering. Phalloidin ble brukt til å merke aktin for å se omrisset av midttarmepitelcellemembranen, og DAPI ble brukt til å merke kjernen. Strukturene i WBPH-tarm- og midttarmepitelceller er forskjellige når de ses med laserskanning konfokalmikroskopi. Denne protokollen er en pålitelig metode for å se fordøyelseskanalens anatomi av insekter, lokalisere virioner, andre patogener og insektproteiner, og studere patogenaktiviteter i insekter, insektproteinfunksjoner og interaksjoner mellom patogener og insektproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (31630058 til X.W. og 31772134 til W.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
