Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة

Published: September 14, 2021 doi: 10.3791/62608
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 2International Max-Planck Research School for Biology and Computation

Summary

هنا، نضع بروتوكولا لتصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في وقت واحد باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) في الخلايا البطانية المعرضة لظروف إجهاد القص المرضي والفسيولوجي.

Abstract

تحويل عامل النمو β (TGFа) / العظام Morphogenetic البروتين (BMP) الإشارات هو تنظيم محكم ومتوازنة أثناء تطوير وتوازن الأوعية الدموية النظام وبالتالي، إلغاء الضوابط التنظيمية في هذا المسار الإشارات يؤدي إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشريان الرئوي، وtelangiectasia النزفية الوراثية، وتصلب الشرايين. تتعرض الخلايا البطانية (ECs)، باعتبارها الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية، باستمرار لإجهاد القص السائل (SS). وقد ثبت أنماط غير طبيعية من السائل SS لتعزيز إشارات TGFβ / BMP، والتي، جنبا إلى جنب مع غيرها من المحفزات، والحث على تكوين الشرايين. وفيما يتعلق بهذا, atheroprone, تم العثور على انخفاض صفح SS لتعزيز TGFβ/ BMP الإشارات في حين atheroprotective, ارتفاع صفح SS, يقلل من هذه الإشارات. لتحليل كفاءة تفعيل هذه المسارات، قمنا بتصميم سير العمل للتحقيق في تشكيل مجمعات عامل النسخ تحت SS صفح منخفضة وظروف SS صفح عالية باستخدام نظام مضخة هوائية متاحة تجاريا وقربها اختبار الربط (جيش التحرير الشعبى الصينى).

يتطلب إشارات TGFβ/BMP النشطة تكوين مجمعات SMAD ثلاثية الأطراف تتكون من اثنين من الأنظمة SMAD (R-SMAD)؛ SMAD2/3 و SMAD1/5/8 للإشارات TGFβ وBMP، على التوالي) مع وسيط مشترك SMAD (شارك SMAD؛ SMAD4). باستخدام PLA استهداف وحدات فرعية مختلفة من مجمع SMAD ثلاثية، أي R-SMAD/co-SMAD أو R-SMAD/R-SMAD، يمكن قياس تشكيل مجمعات عامل النسخ SMAD النشطة كميا ومكانيا باستخدام المجهر الفلوري.

استخدام الشرائح تدفق مع 6 قنوات متوازية صغيرة، التي يمكن توصيلها في سلسلة، ويسمح للتحقيق في تشكيل عامل النسخ المعقدة وإدراج الضوابط اللازمة.

يمكن تكييف سير العمل الموضح هنا بسهولة للدراسات التي تستهدف قرب SMADs من عوامل النسخ الأخرى أو مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs ، في ظروف SS السوائل المختلفة. يظهر سير العمل المعروض هنا طريقة سريعة وفعالة لدراسة إشارات TGFβ/BMP المستحثة SS السائلة في ECs ، كميا ومكانيا.

Introduction

بروتينات عوامل النمو التحويلية بيتا (TGFа) superfamily هي السيتوكينات ذات الجليوتروبيك مع مجموعة متنوعة من الأعضاء، بما في ذلك TGFβs، والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)، وActivins1،2. ملزمة ليغاند يحفز تشكيل أوليغومرات مستقبلات مما يؤدي إلى الفوسفور، وبالتالي، تفعيل SMAD التنظيمية الخلوية (R-SMAD). اعتمادا على العائلة الفرعية من ligands، يتم تنشيط R-SMADs مختلفة1،2. في حين أن TGFβs وActivins تحفز أساسا الفوسفور من SMAD2/3، BMPs حث SMAD1/5/8 الفوسفور. ومع ذلك، هناك أدلة متراكمة على أن BMPs و TGFβs/Activins ينشطون أيضا R-SMADs من الأسرة الفرعية الأخرى المعنية، في عملية تسمى "الإشارات الجانبية" 3،4،5،6،7،8 وأن هناك مجمعات SMAD مختلطة تتكون من كليهما، SMAD1/5 و SMAD2/3، Members3,9 . اثنين من تنشيط R-SMADs شكل مجمعات ثلاثية في وقت لاحق مع SMAD4 الوسيط المشترك. ثم تكون مجمعات عوامل النسخ هذه قادرة على الانتقال إلى النواة وتنظيم نسخ الجينات المستهدفة. يمكن أن تتفاعل SMADs مع مجموعة متنوعة من المنشطات المشاركة النسخية المختلفة والمقمعات المشتركة ، مما يؤدي إلى تنويع إمكانيات تنظيم الجينات المستهدفة10. ولإلغاء القيود التنظيمية على إشارات الأمراض التي تسببها الأمراض الحادة آثار خطيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض. وتمشيا مع هذا، قد يؤدي إشارات TGFβ/BMP غير المتوازنة إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، أو التهاب الأوعية الدموية النزفي الوراثي، أو تصلب الشرايين3،11،12،13،14.

تشكل الخلايا البطانية (ECs) الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية ، وبالتالي ، فهي معرضة لإجهاد القص (SS) ، وهي قوة احتكاك يمارسها التدفق اللزج للدم. ومن المثير للاهتمام، يتم الاحتفاظ ECs المقيمين في أجزاء من الأوعية الدموية، والتي تتعرض لمستويات عالية من موحدة، صفح SS، في حالة الهوستاتيكية والكئيب. وعلى النقيض من ذلك، فإن المركبات ECs التي تعاني من انخفاض مستوى SS غير الموحد، على سبيل المثال، عند التشعبات أو الانحناء الأقل للقوس الأبهري، تنتشر وتفعيل المسارات الالتهابية15. وفي المقابل، فإن مواقع المركبات الإلكترونية المختلة معرضة للإصابة بالتصلب الشرايين. ومن المثير للاهتمام، أن المركبات الإلكترونية في هذه المناطق من أثيروبرون تعرض مستويات عالية بشكل شاذ من SMAD2/3 المنشط وSMAD1/516,17,18. وفي هذا السياق، تبين أن الإشارات المعززة TGFβ/BMP حدث مبكر في تطور الآفات تصلب الشرايين19 ووجد أن التداخل مع إشارات BMP يقلل بشكل ملحوظ من التهاب الأوعية الدموية، وتكوين الورم الحراري، والتكلس المرتبط به20.

القرب ربط المقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو تقنية بيوكيميائية لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الموقع21،22. وهو يعتمد على خصوصية الأجسام المضادة من مختلف الأنواع التي يمكن أن تربط البروتينات المستهدفة ذات الاهتمام، مما يسمح بالكشف بشكل محدد للغاية عن تفاعلات البروتين الذاتية على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، يجب على الأجسام المضادة الأولية أن ترتبط ب epitope الهدف على مسافة أقل من 40 نانومتر للسماح بالكشف23. لذلك ، فإن جيش التحرير الشعبي مفيد إلى حد كبير على النهج التقليدية للمناعة المشتركة ، حيث هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا للكشف عن التفاعلات البروتينية الذاتية. في جيش التحرير الشعبي، تربط الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع، المرتبطة بشكل متناقض بشظايا الحمض النووي (التي يطلق عليها مسابير Plus و Minus)، الأجسام المضادة الأولية وإذا تفاعلت البروتينات ذات الاهتمام، فإن مسابير Plus و Minus تأتي على مقربة. يتم ربط الحمض النووي في الخطوة التالية ويتم تكبير الدائرة المتداول للحمض النووي الدائري. أثناء التضخيم ، ترتبط أوليغونوكليوتيدات الفلورسنتات التكميلية بالحمض النووي المركب ، مما يسمح بتصور هذه التفاعلات البروتينية عن طريق المجهر الفلوري التقليدي.

البروتوكول الموصوف هنا يمكن العلماء من مقارنة عدد مجمعات نسخ SMAD النشطة كميا في ظروف SS atheroprotective و atheroprone في المختبر باستخدام PLA. يتم إنشاء SS عن طريق نظام مضخة هوائية قابلة للبرمجة التي هي قادرة على توليد تدفق صفح أحادي الاتجاه من مستويات محددة ويسمح زيادات تدريجية من معدلات التدفق. تسمح هذه الطريقة للكشف عن التفاعلات بين SMAD1/5 أو SMAD2/3 مع SMAD4، وكذلك المجمعات المختلطة R-SMAD. يمكن توسيعه بسهولة لتحليل تفاعلات SMADs مع المنظمين المشاركين النسخي أو إلى مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs. ويبين الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول المعروضة أدناه.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول الموصوف. (أ) تتعرض الخلايا المصنفة في شرائح من 6 قنوات لإجهاد القص باستخدام نظام مضخة هوائية. (ب) تستخدم الخلايا الثابتة لتجربة جيش التحرير الشعبي أو لظروف التحكم. (ج) يتم الحصول على صور لتجارب جيش التحرير الشعبي مع المجهر الفلوري ويتم تحليلها باستخدام برنامج تحليل ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية الثقافة والتعرض الإجهاد القص السوائل

ملاحظة: استخدمت مركبات ECs الوريدية السرية البشرية (HUVECs) كمثال لدراسة التفاعل المستحث من SS لل SMADs. يمكن تطبيق البروتوكول الموضح أدناه على كل نوع خلية استجابة SS.

  1. معطف 6 قناة الشريحة مع 0.1٪ هلام الجلد porcine في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  2. البذور HUVECs في الشرائح 6 قنوات المغلفة مسبقا في كثافة 2.5 × 106 خلايا لكل مل في 30 ميكرولتر من M199 المتوسطة الكاملة.
    ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية seed الخلايا في الشريحة flow، راجع reference24.
  3. السماح للخلايا الانضمام ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب.
  4. إضافة 60 ميكرولتر من M199 قبل الحارة المتوسطة الكاملة إلى كل من الخزانات.
  5. الثقافة لمدة يومين، مع تبادل متوسط لطيف مرة واحدة في اليوم، في 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة.
    1. يستنشق الخزانات تماما، إضافة 120 ميكرولتر من M199 قبل الحارة المتوسطة الكاملة في أحد الخزانات، وتنشق من الجانب الآخر.
    2. أضف 60 ميكرولتر من M199 المدفأة مسبقا إلى كلا الخزانين.
  6. تجميع وبدء تدفق انشاء كما هو مفصل في reference25.
    1. جبل أنابيب على وحدات السوائل. هنا، يتم استخدام أنابيب السيليكون التي يبلغ قطرها 0.8 ملم و 1.6 ملم لتطبيق إجهاد القص من 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2، على التوالي.
      ملاحظة: يجب أن تظل المادة وطول الأنبوب ثابتين، حيث يمكن أن تؤثر التغييرات على إجهاد القص الناتج. بشكل عام، يمكن استخدام تركيبات أخرى من أنظمة المضخة والأنابيب، طالما أن إجهاد القص الناتج معروف، وتخلق المضخة تدفقا ثابتا للجزم.
    2. ملء الخزانات مع كمية مناسبة من M199 مدفأة مسبقا المتوسطة الكاملة (الحد الأدنى 10 مل).
    3. قم بتوصيل وحدات سائلة مع الأنابيب بنظام المضخة وإجراء تشغيل مسبق بدون خلايا لتوازن الوسط وإزالة أي هواء متبقي25.
    4. قم بتوصيل القنوات المفردة على الشريحة 6 قنوات ببعضها البعض باستخدام أنابيب الاتصال التسلسلي. سيتم توصيل القناة الأولى والأخيرة على الشريحة بالأنابيب المجمعة في 1.6.1 (انظر الشكل 1A للحصول على مخطط). يجب الحرص على عدم إدخال أي هواء في النظام لأن هذا يمكن أن يضر بشدة الخلايا. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الاتصال التسلسلي في reference26.
    5. بالنسبة لتعرض الخلايا لمستويات عالية من إجهاد القص (>20 dyn/cm2)، استخدم مرحلة منحدر، أي زيادة إجهاد القص تدريجيا مع مراحل التكيف. يمكن تعيين الخطوات بزيادات قدرها 5 دين/سم2 لكل 30 دقيقة.

2. التثبيت

  1. فصل الشرائح من المضخات بعد التعرض SS السوائل. استخدام المشابك على الأنابيب عند فصل، لتجنب تسرب المتوسطة في الحاضنة.
  2. نقل الشرائح تدفق على الجليد على الفور، في حين يتم فصل الأنابيب المتبقية بشكل تسلسلي. عند إزالة الأنابيب من الخزانات، يجب أن يبقى الخزان على الجانب الآخر مغلقا بإصبع لتجنب محاصرة فقاعات الهواء في القناة. قد يتعارض ذلك مع خطوات التثبيت.
  3. الحفاظ على الخلايا على الجليد، يستنشق المتوسط بعناية من الخزانات ولكن ليس من القناة التي تتواجد فيها الخلايا. بعد ذلك، غسل العينات مع برنامج تلفزيوني معقم الباردة (4 درجة مئوية) مع ثلاثة أضعاف حجم القناة (90 ميكرولتر). إضافة برنامج تلفزيوني في خزان واحد و يستنشق بعناية من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة في كل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
    ملاحظة: لجميع خطوات الغسيل والحضانة تتم إضافة الحل المعني في أحد الخزانات مما يؤدي إلى تبادل الحلول في القناة. للسماح باستبدال الحلول بالكامل في القناة ، يتم بعد ذلك يستنشق الحل الزائد من الخزان الآخر. لا تتم إزالة الحل في الجزء العلوي من الخلايا في القناة. يجب أن لا تجف الخلايا في أي وقت. لذلك، من المهم أن تغسل بعناية دون أي إدراج فقاعة الهواء في الشرائح.
  4. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من محلول PFA 4٪ المخزنة مؤقتا في نفس الخزان حيث تمت إضافة برنامج تلفزيوني مسبقا وبالمثل يستنشق السائل من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة في كل قناة في كل شريحة. بعد إضافة محلول PFA، نقل العينات من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه: PFA سامة وينبغي التعامل معها بعناية. استخدام قفازات والعمل تحت غطاء الدخان.
  5. غسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني (RT) عن طريق إضافته في خزان واحد و سبيريتينغ بعناية من الخزان الآخر. إفراغ الخزانات فقط، وضمان عدم تجفيف القناة. كرر هذه الخطوة لكل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
  6. إخماد تثبيت PFA بإضافة 90 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم المحيط 50 mM في برنامج تلفزيوني في أحد الخزانات. يستنشق الحل الزائد من الخزان الآخر. كرر لكل قناة في الشريحة. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT.
  7. غسل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، قد يتم تخزين العينات عند درجة حرارة 4 مئوية بين عشية وضحاها، أو يمكن مواصلة البروتوكول فورا مع حظر واحتضان الأجسام المضادة الأولية (انظر الخطوة 3).

3. منع واحتضان الأجسام المضادة الأولية

  1. ل permeabilize الخلايا، إضافة 90 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني في خزان أفرغت، واستبخاء من الخزان الآخر لكل قناة. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
  2. غسل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  3. إضافة 90 ميكرولتر من محلول منع PLA العقيم في خزان واحد من قناة و أسبيرات من الجانب الآخر. كرر هذه الخطوة لكل قناة. كتلة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
    1. لجعل غرفة رطبة، استخدم طبق 10 سم مع الأنسجة الرطبة مختومة مع فيلم الشمع ووضع الطبق في الحاضنة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام صيغ غرفة الرطوبة الأخرى التي توفر جو رطب.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام حل الحظر الذاتي الصنع (على سبيل المثال، 3٪ (ث / v) BSA في PBS، معقمة تصفيتها).
  4. إعداد الأجسام المضادة الأولية (1:100) في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبي العزلة. إعداد 30 ميكرولتر من الحل لكل قناة. إضافة كل من الأجسام المضادة الأولية في وقت واحد ودوامة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام ثنائي الأجسام المضادة الذاتي الصنع (على سبيل المثال، 1٪ (ث / 5) BSA في PBS). الأجسام المضادة المستخدمة هنا هي مجموعات من SMAD1-SMAD2/3، SMAD2/3-SMAD4 وفوسفو-SMAD1/5-SMAD4. يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة في جدول المواد.
  5. قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية ، يستنشق محلول الحجب من الخزانات ، وكذلك ، بعناية من القناة. ماصة 30 ميكرولتر من الحل الأساسي للأجسام المضادة فورا في قناة فارغة عن طريق إمالة القناة مع إضافة الحل.
    ملاحظة: تنفيذ إزالة الحل حظر وإضافة الأجسام المضادة حل قناة قناة قناة لضمان عدم جفاف الخلايا في ما بين.
  6. احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في الغرف الرطبة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، إذا كنت ترغب في الاستمرار في الخطوات التالية في نفس اليوم.

4. PLA التحقيق الحضانة

ملاحظة: بالنسبة لكافة الخطوات في القسم 4.1-7.3، يتم تخزين المخزنين المؤقتين للغسيل A وB عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ويجب تسخينهما إلى RT قبل الاستخدام.

  1. تمييع PLA-تحقيقات (+)-الماوس و (-)-أرنب إلى 1:5 في PLA الأجسام المضادة مخفف (أو 1٪ BSA) الحل. إعداد 30 ميكرولتر لكل قناة.
  2. غسل عينات 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT عن طريق إضافته في أحد الخزانات و سبيراتينغ بعناية من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة لكل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
  3. يستنشق المخزن المؤقت للغسيل A بعناية وإضافة 30 ميكرولتر من محلول مسبار PLA (تم إعداده في الخطوة 4.1) ، على غرار إضافة الأجسام المضادة الأولية في الخطوة 3.5.
  4. احتضان عينات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

5. الربط

  1. غسل عينات 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT، كما هو موضح في 4.2.
  2. إعداد تخفيف 1:5 من العازلة ربط في الماء deionized. استخدم هذا العازل لتمييع إنزيم الليغاز إلى 1:40 (على الجليد). استخدم 30 ميكرولتر لكل قناة.
  3. يستنشق المخزن المؤقت غسل A تماما وإضافة محلول الربط كما هو موضح في 3.5.
  4. احتضان عينات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

6. التضخيم

  1. غسل عينات 2x لمدة 2 دقيقة باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT، كما هو موضح في 4.2.
  2. إعداد العازلة تضخيم عن طريق تخفيفه 1:5 في الماء deionized واستخدامه لتمييع انزيم البوليميراز إلى 1:80 (على الجليد). حماية من الضوء. إعداد 30 ميكرولتر لكل قناة.
  3. أسبيرات المخزن المؤقت غسل A تماما وعلى الفور إضافة حل تضخيم المعدة في القناة الفارغة، كما هو موضح في 3.5. احتضان عينات لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

7. تصاعد

  1. غسل عينات 2x لمدة 10 دقيقة باستخدام 90 ميكرولتر من غسل العازلة B في RT كما هو موضح في 4.2. إضافة DAPI (1:500) من محلول مخزون 1 ملغم /مل (في الماء المتأين) في أول غسل للنوى وصمة عار. لا تجف القناة.
  2. تمييع العازلة غسل B في الماء deionized (1:10) وغسل 1x مع 90 ميكرولتر من 0.1x العازلة B الحل كما هو موضح في 4.2.
  3. يستنشق العازلة غسل B تماما وعلى الفور إضافة 2-3 قطرات من السائل تصاعد المتوسطة في خزان واحد. توزيعه في القناة عن طريق إمالة الشريحة. تخزين العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في بيئة رطبة حتى التصوير.

8. الحصول على صورة

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلوري. تأكد من توفر المرشحات المعنية التي تناسب مسابير PLA الفلورية.
    ملاحظة: من المفيد الاستفادة من المجهر confocal، إذا كان ذلك ممكنا، كما تم الحصول على بقع جيش التحرير الشعبي هي أكثر تحديدا. وهذا يدعم أيضا المزيد من معالجة الصور وتحليل البيانات.

9. تحليل الصورة وتحديد كميتها باستخدام ImageJ / فيجي

  1. معالجة الصور المصدرة (.tiff) باستخدام برنامج معالجة الصور، مثل ImageJ27.
    ملاحظة: يمكن العثور على جميع البرامج النصية المستخدمة في هذه الدراسة واللازمة للعد التلقائي للأحداث الخلوية والنووية وجميع أحداث جيش التحرير الشعبي (لكل خلية) في مستودع GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أي برنامج مناسب أو أداة مناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد استخدمنا سابقا جيش التحرير الشعبي للكشف عن التفاعلات من البروتينات SMAD مختلفة3 وتحليل الإجهاد القص الناجمة عن التغيرات في SMAD الفوسفور28.

هنا، تم دمج كلا الأسلوبين مع البروتوكول المذكور أعلاه. تعرضت HUVECs لإجهاد القص من 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2 وتم تحليلها لتفاعلات عوامل النسخ SMAD. نظهر أنه بالمقارنة مع إجهاد القص العالي (30 dyn/cm2) ، فإن إجهاد القص المنخفض (1 dyn/cm2) يؤدي إلى زيادة كبيرة في تفاعلات SMAD1-SMAD2/3 ، وما يسمى بمجمعات SMAD المختلطة في كل من السيتوسول ونوى الخلايا المحللة (الشكل 2A ، اللوحة السفلية). أحداث جيش التحرير الشعبي مرئية ورقع متميزة في كلتا العينتين، ويمكن للمرء أن يميز بين الأحداث الخلوية والنووية مع الإشارة إلى تلطيخ DAPI (الشكل 2A، لوحة العلوي). وعلى النقيض من ذلك، أظهرت ضوابط الأجسام المضادة، حيث تم احتضان واحد فقط من كلا الجسمين المضادين الأساسيين ولكن لا يزال كلا المسبارين التابعين لجيش التحرير الشعبي، أعدادا لا تذكر من إشارات جيش التحرير الشعبي (الشكل 2B). وهكذا، يمكن استنتاج أن التجربة كانت ناجحة.

Figure 2
الشكل 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA مقارنة تركيزات الأجسام المضادة المختلفة. (أ) صور الفلورسينس Confocal والتحديد الكمي لSMAD2/3-SMAD1-PLA في HUVECs المعرضة ل24 ساعة من مستويات SS المشار إليها. نسبة تمييع الأجسام المضادة: 1:100. (ب) صور كونفوكوكال لضوابط الأجسام المضادة واحدة لجيش التحرير الشعبى الصينى في A. (C) صور الفلورسنس Confocal وتكميم SMAD2/3-SMAD1-PLA في HUVECs يتعرض ل 24 ساعة من مستويات SS المشار إليها. نسبة تمييع الأجسام المضادة: 1:50. أشرطة المقياس ل A-C: 20 ميكرومتر و 10 ميكرومتر في التكبير. داين يساوي dyn / cm2. وكانت الأجسام المضادة المستخدمة هي الأرانب المضادة للSMAD2/3 والفأر المضادة SMAD1 (انظر جدول المواد). لكل شرط تم استخدام 5 مناطق عشوائية على طول وسط قناة التدفق للحصول على الصورة. N = 1 تكرار البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لإظهار كيفية تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة تغيير نتائج جيش التحرير الشعبى الصينى، تم إجراء نفس التجربة مع 1:50 بدلا من تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة. في ظل هذه الظروف، ينتج عن ضعف كمية الأجسام المضادة إشارات PLA أعلى بأربعة أضعاف لكل خلية (قارن الشكل 2A والشكل 2C). الفرق في الإشارات بين 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2 ينخفض عند استخدام تركيز أعلى للأجسام المضادة وفقدان الأهمية الإحصائية لأحداث جيش التحرير الشعبي الكلي والسيتوسوليك (الشكل 2A، لوحة أقل؛ الشكل 2C، لوحة سفية). وقد يرجع ذلك إلى تجمع الإشارات ومشاكل التمييز بين أحداث جيش التحرير الشعبي. إذا حدث هذا التراكم من الإشارات، يجب تقليل تركيزات الأجسام المضادة.

وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن المخازن المؤقتة ذاتية الصنع للحجب وتخفيف الأجسام المضادة يمكن استخدامها كبديل للمخازن المؤقتة التجارية المدرجة في مجموعات جيش التحرير الشعبي الموقعي. تمت مقارنة أحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية لSMAD1-SMAD2/3 (الشكل 3A مقابل الشكل 3D)، SMAD2/3-SMAD4 (الشكل 3B مقابل الشكل 3E) وpSMAD1/5-SMA مجمعاتD4 (الشكل 3C مقابل الشكل 3F) تحت 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2 باستخدام إما حلول تجارية (الشكل 3A-C) أو حلول ذاتية الصنع تستند إلى BSA/PBS (الشكل 3D-F ). وتبين الكميات لكل من الحلول التجارية والحلية ذاتية الصنع/الحجب نفس الاتجاه لإشارات جيش التحرير الشعبي في المناطق الخلوية والنووية. ومع ذلك، فإن العدد الإجمالي لأحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية أعلى عند استخدام الحلول التجارية (الشكل 3A-C، لوحات أقل مقابل الشكل 3D-F، لوحات أقل).

Figure 3
الشكل 3: تجربة جيش التحرير الشعبي التي تقارن بين مخازن الأجسام المضادة التجارية والذاتية الصنع. صور Confocal (الجزء العلوي من كل لوحة) والتحديد الكمي (الجزء السفلي من كل لوحة) من مختلف PLAs SMAD-SMAD في HUVECs يتعرض ل 24 ساعة من مستويات الإجهاد القص المشار إليها. (A-C) المخازن التجارية (انظر جدول المواد). (مد واو) المخازن المؤقتة عصامي (3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمنع، 1 ٪ BSA في برنامج تلفزيوني لتخفيف الأجسام المضادة). تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية 1:100. شريط المقياس، 20 ميكرومتر (10 ميكرومتر للتكبير). تم حساب الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار t على الوجهين. ns - غير مهم، *P<0.05، **P<0.01، ***P<0.001. يتم تصوير القيم على أنها متوسط + SEM. Dyne يساوي dyn/cm2. وكانت الأجسام المضادة المستخدمة أرنب المضادة SMAD2/3، الفأر المضادة SMAD1، أرنب المضادة للفوسفو SMAD1/5 والفأر المضادة SMAD4 (انظر جدول المواد). لكل شرط تم استخدام 5 مناطق عشوائية على طول وسط قناة التدفق للحصول على الصورة. N = 1 تكرار البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كما أدرجنا مثالا لتجربة فاشلة لجيش التحرير الشعبي. هنا، تم استخدام مزيج من الأجسام المضادة SMAD2/3-SMAD4 حيث لم يكن الجسم المضاد SMAD4 مناسبا لإجراء تجارب الفلورة المناعية. عند مقارنتها بضوابط الأجسام المضادة المفردة، لم تلاحظ أي زيادة في البقع في عينات 1 dyn/cm2 أو 30 dyn/cm2 (الشكل 4A مقابل الشكل 4B). وبما أن تشكيل مجمعات SMAD2/3-SMAD4 ناجم عن إجهاد القص (انظر الشكل 3B،E)، يمكن استنتاج أن تجربة جيش التحرير الشعبي هذه لم تنجح. وهذا يسلط الضوء على أهمية اختيار تركيبات الأجسام المضادة الصحيحة للكشف عن أحداث جيش التحرير الشعبي، حيث أن اتجاه ومسافة الأجسام المضادة المقيدة قد يكونان حاسمين لنجاح تحنيم مسابير أوليغونوكليوتيد.

Figure 4
الشكل 4: مثال على فشل تجربة جيش التحرير الشعبي. صور Confocal، شريط مقياس: 20 ميكرومتر و 10 ميكرومتر في التكبير. (أ) SMAD2/3-SMAD4 جيش التحرير الشعبي. (ب) ضوابط الأجسام المضادة واحد. وكانت الأجسام المضادة المستخدمة الماوس المضادة SMAD2/3 والأرنب المضادة SMAD4 (انظر جدول المواد). داين يساوي dyn / cm2. لكل شرط تم استخدام 5 مناطق عشوائية على طول وسط قناة التدفق للحصول على الصورة. N = 1 تكرار البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر البروتوكول القائم على جيش التحرير الشعبي الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد القرب من بروتينين (على سبيل المثال، تفاعلهما المباشر) في البلدان النامية المعرضة لضغوط القص بدقة كمية ومكانية. باستخدام الشرائح تدفق مع قنوات متوازية متعددة، يمكن فحص العديد من التفاعلات البروتين مختلفة في نفس الوقت في الخلايا في ظل ظروف ميكانيكية متطابقة. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما تستخدم أنظمة غرفة التدفق المخصصة البنية قناة واحدة مبنية حول غطاء زجاجي، مما يسمح بتجربة PLA واحدة فقط دون الضوابط اللازمة لكل شريحة ومضخة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على الكشف عن التفاعلات SMAD، فإنه يمكن تكييفها للكشف عن أي تفاعلات البروتين الأخرى. ومع ذلك ، يجب إجراء تحليل النتائج بعناية لأن اثنين من البروتينات قد يتواجدان أيضا على مقربة من بعضهما البعض دون تشكيل مجمعات. إذا كان من المرغوب فيه بيانات محددة عن تفاعلات البروتينات، ينبغي استكمال تجارب جيش التحرير الشعبي بأساليب إضافية مثل الإفراط في المناعة. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للكشف عن التفاعل البروتين البروتين في الخلايا الحية منذ عينات تحتاج إلى إصلاح لربط الأجسام المضادة اللاحقة وخطوات تضخيم الحمض النووي.

للكشف الناجح عن تفاعلات البروتين من قبل جيش التحرير الشعبي، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي اختيار مزيج من الأجسام المضادة الأولية التي تفي بعدة معايير: (1) يجب أن يتم إنشاء الأجسام المضادة التي تكشف عن الشركاء البروتين الفردية في أنواع مختلفة (مثل الماوس أو الأرنب) كما الأجسام المضادة الثانوية هي الأنواع الخاصة؛ (2) الأجسام المضادة للبروتينات. من الناحية المثالية ، تم اختبار الأجسام المضادة بنجاح بالفعل عن طريق المجهر المناعي التقليدي ؛ (2) ينبغي أن تكون المسافة بين الأجسام المضادة ملزمة epitope <40 nm23؛ (3) كما قد تختلف تقارب لربط الأجسام المضادة epitope، يجب تعديل التركيز النهائي للأجسام المضادة المستخدمة لكل إعداد تجريبي، كما هو مبين هنا (الشكل 2A، لوحة أقل مقابل الشكل 2C، لوحة أقل). لذلك ، إذا تم الكشف عن عدد قليل جدا من أحداث جيش التحرير الشعبي ولكن محددة ، قد يكون من المفيد زيادة كمية الأجسام المضادة المستخدمة. ومع ذلك ، يجب أن يكون هذا titrated بعناية لتجنب الإفراط في التشبع والأحداث الملزمة غير محدد. أيضا، يجب أن تركيز الأجسام المضادة المستخدمة في عينات التحكم تطابق التركيز المستخدم في عينات جيش التحرير الشعبي.

أما بالنسبة لأية م المقايسة الكيميائية الحيوية الأخرى ، والضوابط المناسبة لا غنى عنها في جيش التحرير الشعبى الصينى. فعلى سبيل المثال، قد يؤدي الربط غير المحدد للأجسام المضادة المستخدمة إلى إشارات جيش التحرير الشعبي التي تنشأ من جسم مضاد أساسي واحد فقط. لذلك ، يجب أن تشمل ضوابط الأجسام المضادة الأساسية لتجارب جيش التحرير الشعبي إضافة واحد فقط من الجسمين المضادين الأساسيين ولكن كلا من تحقيقات جيش التحرير الشعبي (زائد وناقص). وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام عناصر التحكم التي لا توجد أجسام مضادة مضافة لتحديد الربط غير المحدد لمسابير جيش التحرير الشعبي للعينة. وعموما، ينبغي أن لا تسفر هذه الضوابط التقنية عن إشارات قليلة جدا لجيش التحرير الشعبي. إذا لوحظت عدة إشارات، ينبغي إعادة النظر في تركيز الأجسام المضادة الأولية، وخصوصية لها. وبالإضافة إلى ذلك، من المفيد إدراج مكافحة بيولوجية إيجابية، إن أمكن. في البروتوكول المذكور أعلاه ، يمكن أن يكون هذا التحفيز مع ليغاند BMP المعروف بالحث على الفوسفور من SMADs ، وبالتالي ، تشكيل معقد ثلاثي الأطراف مع SMAD4.

بالنسبة لتجارب جيش التحرير الشعبي ، يوصى عادة باستخدام الخلايا التي تالتقاء بنسبة 50-70 ٪ ، لأن هذا يبسط اختراق الكواشف. ومع ذلك ، عند إجراء تجارب مع ECs ، فإننا نجادل بشكل صارم ضد هذا ، إلا إذا كان شبه التقاء هو جزء من الإعداد التجريبي. في الجسم الحي تشكل ECs أحاديات الطبقات مع تقاطعات ضيقة من خلية إلى خلية ، وهي ضرورية لداء التوازن في EC و mechano-transduction29. ولذلك، فإن التجارب على البلدان النامية غير الملتق يمكن أن تؤدي إلى نتائج خاطئة. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا غير الملتقة أكثر عرضة للانفصال عن شرائح قنوات التدفق إذا تم استخدام مستويات عالية من إجهاد القص أثناء التجربة. ننصح بزرع الخلايا (2-2.5 × 106 خلايا / مل ، انظر البروتوكول الخطوة 1.2) قبل يومين إلى ثلاثة أيام من البدء التجريبي حيث تحتاج الطبقات الأحادية في EC إلى وقت لتشكيل وتطوير تقاطعات ناضجة. لذلك، فإننا لا نوصي بزرع عدد أكبر من الخلايا (>2.5 × 106 خلايا / مل) في قنوات التدفق قبل يوم واحد فقط من التجربة لتحقيق طبقة أحادية التقاء.

على الرغم من وجود وسائط تركيب سائلة مختلفة تحتوي على DAPI ، فمن الجدير تضمين خطوة تلطيخ DAPI منفصلة وتركيب الخلايا مع وسيط تركيب سائل بدون DAPI ، على الأقل إذا تم استخدام شرائح التدفق المستندة إلى البوليمر. وهذا يمنع إشارات الخلفية الثقيلة أثناء الحصول على الصورة. يجب الحصول على الصور من مواقع في مركز القناة بدلا من الحواف لأن إجهاد القص غير متجانس عند جدران القناة. نوصي بأخذ ما لا يقل عن 5-10 صور لكل تكرار بيولوجي وحالة المناطق العشوائية على طول منطقة الوسط. 3 أو أكثر من التكرارات البيولوجية تستخدم عادة للحصول على أهمية إحصائية. لتحليل الصورة ننصح باستخدام ImageJ / فيجي وظيفة الماكرو. في البروتوكول أعلاه ، ذكرنا ماكرو ImageJ مناسب لحساب أحداث جيش التحرير الشعبي الخلوي والنووية على أساس تلطيخ DAPI. يجب أن يدرك المستخدمون أن المعلمات مثل حجم الجسيمات تحتاج إلى تعديل اعتمادا على الحجم النووي أو نقاط جيش التحرير الشعبي أكبر / أصغر. الماكرو يحفظ الصور عتبة جيش التحرير الشعبى الصينى والأقنعة التي ينبغي مقارنتها إلى الصور الخام لتقييم خصوصية الكشف عن إشارة جيش التحرير الشعبي.

في الختام، فإن الطريقة المعروضة هنا تسمح بسرعة وكفاءة التحليل المكاني والكمي لتشكيل عامل النسخ المعقدة في ظروف SS atheroprotective و atheroprone. وسوف تسمح للعلماء لمزيد من فك تأثير تشكيل مجمع SMAD في تكوين الشرايين وأمراض الأوعية الدموية بشكل عام. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها للتحقيق في عواقب القرب من البروتينات المختلفة في تلك الأمراض الوعائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة ماريا رايشنباخ والدكتور كريستيان هيبن على دعمهما لنظام التدفق، وإليانور فوكس ويونيون شياو على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل P-L.M من قبل مدرسة ماكس بلانك الدولية للأبحاث IMPRS-البيولوجيا والحساب (IMPRS-BAC). تلقى PK التمويل من قبل DFG-SFB1444. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide VI 0.4 ibidi 80606 6-channel slide
Ammonium Chloride Carl Roth K298.1 Quenching
Bovine Serum Albumin Carl Roth 8076.4 Blocking
DAPI Sigma Aldrich/ Merck D9542 Stain DNA/Nuclei
DPBS PAN Biotech P04-53500 PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green Sigma Aldrich/ Merck DUO92014 PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92004 MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma Aldrich/ Merck DUO92002 PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma Aldrich/ Merck DUO82049 PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement Corning supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum supplement for medium
FIJI Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered KLINIPATH/VWR VWRK4186.BO1 PFA
Full medium M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A Sigma Aldrich G2500 Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7 GarphPad Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma Aldrich H4784-250MG supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium ibidi 50001 Liquid mounting medium
ibidi Pump System ibidi 10902 pneumatic pump
Leica TCS SP8 Leica confocal microscope
L-Glutamin 200mM PAN Biotech P04-80100 supplement for medium (L-Glu)
Medium 199 Sigma Aldrich M2154 Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody Abcam ab53745 Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody BD Bioscience 610843 Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody Sanata Cruz Biotechnology sc-7966 Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml PAN Biotech P06-07100 supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE ibidi 10963 Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN ibidi 10964 Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody Cell Signaling Technologies 9516 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody Cell Signaling Technologies 8685 Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody Cell Signaling Technologies 9515 Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides ibidi 10830 serial connection tubes
Triton X-100 Carl Roth 6683.1 Permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 175، إجهاد القص السائل، فحص ربط القرب، الخلايا البطانية، SMADs، BMP، TGFа، تصلب الشرايين، التدفق
التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mendez, P. L., Obendorf, L., Knaus,… More

Mendez, P. L., Obendorf, L., Knaus, P. Visualization and Quantification of TGFβ/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay. J. Vis. Exp. (175), e62608, doi:10.3791/62608 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter