Summary
Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.
Abstract
Nöromüsküler kavşak (NMJ), motor sinir ve iskelet kası arasında özel bir temas noktasıdır. Bu periferik sinaps yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite sergiler. Çok sayıda sinir sistemi bozukluğunda, NMJ nörotransmisyon yetmezliği, halsizlik, atrofi ve hatta kas lifi ölümü ile sonuçlanan erken patolojik bir hedeftir. İlgisi nedeniyle, NMJ bileşenleri arasındaki ilişkinin belirli yönlerini nicel olarak değerlendirme imkanı, montajı/sökülmesi ile ilişkili süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Kaslarla çalışırken ilk engel, liflerine zarar vermeden hızlı bir şekilde tanımlamak ve parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. İkinci zorluk, nicel analiz yapmak için kullanılabilecek NMJ görüntülerini elde etmek için yüksek kaliteli algılama yöntemlerini kullanmaktır. Bu makalede, sıçanlardan ekstansor digitorum longus ve soleus kaslarının diseksiyonu için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, immünofluoresansın tüm montajlı NMJ'lerin pre ve postsinaptik unsurlarını görselleştirmek için kullanımını açıklar. Elde edilen sonuçlar, bu tekniğin sinapsın mikroskobik anatomisini oluşturmak ve fizyolojik veya patolojik koşullar altında bazı bileşenlerinin durumundaki ince değişiklikleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Memeli nöromüsküler kavşak (NMJ), motor nöron sinir uçlarından, iskelet kas lifi üzerindeki postsinaptik zardan ve terminal Schwann hücrelerinden oluşan büyük bir kolinerjik üçlüsinapstır. Bu sinaps, NMJ'lerin dinamik yapısal değişikliklere uğrayabildiği yetişkinlik döneminde bile yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite4,5,6,7,8sergiler. Örneğin, bazı araştırmacılar motor sinir uçlarının mikrometre ölçeğinde şekillerini sürekli olarak değiştirdiğini göstermiştir9. Ayrıca, NMJ'nin morfolojisinin fonksiyonel gereksinimlere, değiştirilmiş kullanıma, yaşlanmaya, egzersize veya lokomotor aktivite4, 10 , 11,12,13,14,15varyasyonlarına yanıt verdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, eğitim ve kullanım eksikliği, NMJ'nin boyutu, uzunluğu, sinaptik veziküllerin ve reseptörlerin dağılımı ve ayrıca sinir terminalidallanma 14 , 16 , 17 ,18,19,20gibi bazı özelliklerini değiştirmek için gerekli uyaranı temsil eder.
Ayrıca, bu hayati bağlantının herhangi bir yapısal değişiminin veya dejenerasyonun motor nöron hücre ölümü ve kas atrofisi21ile sonuçlanabileceği gösterilmiştir. Ayrıca, sinirler ve kaslar arasındaki değişen iletişimin fizyolojik yaşa bağlı NMJ değişikliklerinden ve muhtemelen patolojik durumlardaki yıkımından sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Nöromüsküler kavşak sökümü, bozulmuş kas-sinir etkileşiminin en iyi örneklerinden birini oluşturan nörodejeneratif bir hastalık olan Amyotrofik Lateral Sklerozun (ALS) başlangıcında çok önemli bir rol oynar3. Motor nöron disfonksiyonu üzerinde yapılan çok sayıda çalışmaya rağmen, ALS'de gözlenen bozulmanın motor nörona doğrudan zarar ve daha sonra kortiko-spinal projeksiyonlara kadar uzanıp uzanmadığı hala tartışılır22; veya sinir uçlarında dejenerasyonun başladığı ve motor nöron somas23,24'edoğru ilerlediği distal bir aksonopati olarak düşünülmelidir. ALS patolojisinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bağımsız süreçlerin bir karışımının meydana geldiğini düşünmek mantıklıdır. NMJ, kas ve sinir arasındaki fizyopatolojik etkileşimin merkezi oyuncusu olduğundan, istikrarsızlaşması, hastalığın kökeninde analiz edilmesi gereken önemli bir noktayı temsil eder.
Memeli nöromüsküler sistemi, işlevsel olarak bir motor nörondan ve sinir terminali tarafından özel olarak içselleştirilen kas liflerinden oluşan ayrı motor birimler halinde düzenlenir. Her motor ünitesi benzer veya özdeş yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip liflere sahiptir25. Motor nöron seçici işe alım fonksiyonel taleplere kas yanıtını optimize etmeyi sağlar. Şimdi memeli iskelet kaslarının dört farklı lif türünden oluştuğu açıktır. Bazı kaslar en bol lif tiplerinin özelliklerine göre adlandırılır. Örneğin, soleus (vücut duruşunun korunmasında rol oynayan arka uzvun arka kası) yavaş seğirme birimlerinin (tip 1) çoğunluğunu taşır ve yavaş bir kas olarak kabul edilir. Bunun yerine, ekstansör digitorum longus (EDL) esasen benzer hızlı seğirme özelliklerine (tip 2 lifler) sahip ünitelerden oluşur ve hareketlilik için gerekli olan fazik hareketler için uzmanlaşmış hızlı bir kas olarak bilinir. Başka bir deyişle, yetişkin kasları hormonal ve sinirsel etkiler nedeniyle doğada plastik olmasına rağmen, lif bileşimi, sürekli düşük yoğunluklu aktivite ve daha hızlı bir tek seğirme sergileyen EDL yaşayan soleusta görüldüğü gibi farklı aktiviteler gerçekleştirme kapasitesini belirler. Farklı kas lifleri arasında değişken olan diğer özellikler yapıları (mitokondriyal içerik, sarkoplazmik retikülün uzantısı, Z hattının kalınlığı), miyozin ATPase içeriği ve miyozin ağır zincir bileşimi26 , 27,28,29ileilgilidir.
Kemirgen NMJ'leri için, kaslar arasında önemli farklılıklar vardır28,29. Sıçanlardan soleus ve EDL'de yapılan morfometrik analizler, sinaptik alan ile lif çapı arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koydu (yani, soleus yavaş liflerdeki sinaptik alan EDL hızlı liflerden daha büyüktür) ancak NMJ alanı ile lif büyüklüğü arasındaki oran her iki kasta da benzerdir30,31. Ayrıca, sinir terminalleri ile ilgili olarak, tip 1 liflerdeki uç mutlak alanlar tip 2 liflere göre daha düşükken, lif çapı ile normalleşme, tip 1 liflerdeki sinir terminallerinin alanlarını en büyük32yaptı.
Bununla birlikte, çok az çalışma, bazı NMJ bileşenlerindeki değişikliklerin kanıtlarını göstermek için morfometrik analize odaklanmaktadır33,34. Bu nedenle, morfolojisi ve fizyolojisi çeşitli patolojilerde değişen organizmanın işlevinde NMJ'nin ilgisi nedeniyle, farklı kas türlerinin diseksiyon protokollerini tüm NMJ yapısının görselleştirilmesine izin sağlayacak kalitede optimize etmek önemlidir. Yaşlanma veya egzersiz 35 , 36,37,38gibi farklı deneysel durumlarda veya koşullarda pre veya postynaptik değişikliklerin oluşumunu değerlendirmek de gereklidir. Ek olarak, ALS39'dabildirildiği gibi terminal sinir uçlarında değiştirilmiş nörofilament fosforilasyon gibi NMJ bileşenlerinde daha ince değişikliklere kanıt sağlamak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Deneysel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Bakımı için Ulusal N° 18611 Sayılı Yasa'nın yönergelerine göre gerçek gerçekleştirildi. Protokol Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (CEUA IIBCE, Protokol Numarası 004/09/2015).
1. Kas diseksiyonu (Gün 1)
NOT: Başlamadan önce Dulbecco fosfat salininde (DPBS) %0,5 paraformaldehit (PFA), pH 7,4 olmak üzere 40 mL yapın. İsteğe bağlı olarak, %4 PFA'nın 20 mL'sini yapın. 5 mL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de dondurun. Diseksiyon gününde% 4 aliquot çözün ve% 0.5 PFA'nın 40 mL'sini elde etmek için 35 mL DPBS ekleyin.
-
EDL izolasyonu (hızlı seğirme kası)
- Bir sıçanı ötenaziye tabi edin. Hayvanı karın yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ayak uçları arasında arka ekvuca doğru cerrahi bir bıçak kullanarak ilk kesiyi yapın.
NOT: Bu durumda, sıçanı ötenazi yapmak için 90:10 mg/Kg ketamin:ksilazine intraperitoneal enjeksiyon yapıldı, ancak diğer anestezi seçeneklerine de izin verilir. - Sıçan dizi açığa çıkarana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun.
- EDL'yi bulmak için ayak tendonlarını annular ligamente kadar takip edin. Bu bağ iki tendonu çevreler. İki tendon arasındaki bağı uniband makas (veya benzeri) ile kesin. Her ikisini de kaldırarak EDL tendonu tanımlayın ve tokmakların yukarı doğru hareket etmesini sağlayan tendonu seçin.
- Tendonu uniband makasla kesin. Daha sonra, tendonu ince biyolojik cımbızla tutarken, EDL kasını tibialis ön, peroneus brevis ve peroneus longus40'tan yavaşça ayırmaya başlar (bkz. Şekil 1A).
NOT: Kasın herhangi bir hasar görmeden ayrıldığından emin olun. Bunu, EDL kasını tutarken ve kaldırırken aralarında bir yol açmak için yanal kasların geri kalanını keserek yapın (EDL yüzeysel bir konuma sahip değildir). - Kası tamamen izole etmek için, sıçan dizine bağlı tendonu uniband makasla kesin.
- Parçalanmış kası % 0,5 PFA'nın 5 mL'sinde batırın ve 4 °C'de 24 saat bekletin. İsteğe bağlı olarak, kası bir karton parçasına zımbalayın ve kas aşağı bakacak şekilde çevirin. Daha sonra tamamen sabit çözeltinin 8 mL'sinde batırın. Bu adım, fiksasyon işlemi sırasında uzatılan kasın korunmasına yardımcı olur.
- Bir sıçanı ötenaziye tabi edin. Hayvanı karın yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ayak uçları arasında arka ekvuca doğru cerrahi bir bıçak kullanarak ilk kesiyi yapın.
-
Soleus izolasyonu (yavaş seğirme kası)
- Hayvanı çevirin (karın şimdi aşağı bakıyor). Deriden, cerrahi bir bıçak kullanarak kalkal tendonu kesin.
- Biyolojik cımbız ve uniband makas yardımıyla, gastrocnemius kasını kemiklerden ayırarak bir "kas kapağı" oluşturur. Soleus kas kapağının iç tarafında olacaktır. Kırmızı renkli olduğu ve düz bir morfolojiye sahip olduğu için tanımlanabilir.
- Bir çift biyolojik cımbızla, gastrocnemius'un üzerinde yatan soleus tendona ulaşın ve kaldırın (bkz. Şekil 1B).
- Tendonu uniband makasla kesin. Zayıf bağlanma noktalarının bazılarını (yani nörovasküler elemanları) keserken tüm kası kaldırın. Son olarak, soleus kasını tamamen serbest etmek için, kalkaneal tendonu oluşturan soleus fasikülini uniband makasla kesin.
- Parçalanmış soleus kasını düzeltmek için 1.1.6 adımlarını tekrarlayın.
2. Alaylı lif hazırlığı (Gün 2)
- 24 saat fiksasyondan sonra, kas liflerini izole etmeden önce kasları her biri 10 dakika boyunca 6 mL DPBS çözeltisi 3x ile durulayın.
- Lifleri izole etmek için mikroskop kaydırasına bir kas koyun. Stereomikroskop kullanarak, tendonlardan birini bir çift biyolojik cımbızla hafifçe tutun. Daha sonra, diğer biyolojik cımbızla, kas liflerini ayırmak için tendonu yavaşça sıkıştırmaya başlar. Bundan sonra yavaşça sıkışan dokuyu yukarı doğru karşı kas tendonuna doğru çekin. Birden fazla küçük, yalıtılmış demet elde edene kadar bu eylemi birkaç kez tekrarlamak gerekecektir.
- Önceden işlenmiş bir slayda (silanized) dikkatlice yerleştirin. Tüm lifleri üst üste binmeyecek şekilde düzenli tutmak gerekir. Bu noktada, lifleri 24 saat boyunca havayla kurulayın.
3. İmmünoresans
-
Primer antikor inkübasyonu (Gün 3)
NOT: Aksi belirtilmediyse, tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Lifleri slayttan ayırmadan farklı çözeltileri çıkarmanın en etkili yolu bir insülin şırınnası kullanmaktır.- İmmün yetme işlemine başlamak için, su geçirmez bir bariyer oluşturmak için kurutulmuş izole kas liflerini bir pap kalemle çevreleyin.
- Kas liflerini nemlendirmek için, 5 dakika boyunca 200 μL damıtılmış su ekleyin ve ardından sonraki 5 dakikalık inkübasyon için suyu 200 μL DPBS'ye değiştirin. Bu noktada immünoresans etiketlemeye başlayın.
- 30 dakika boyunca 50 mM glisinin, %1 BSA'nın ve %1 Triton X-100'ün bulunduğu 300 μL blokaj tamponu (BB) ile fiberleri kuluçkaya yatırın.
- BB'yi üreticiler tarafından önerilen konsantrasyonda birincil antikorla değiştirin. Antikorun seyrelti için BB kullanın. Bu deneyde, NMJ presinyaptik bileşenini tespit etmek için 1/800 seyreltmede fosforilasyonlu olmayan (Nf) veya fosforilasyonlu (Fos-Nf) nörofilament H'yi tanıyan 400 μL SMI 32 veya SMI 31 kullanıldı.
NOT: Nörofilament fosforilasyonu değerlendirmek yerine tüm presinaptik elementi tanımaya karar verirken, daha önce başarıyla kullanılan sinapsin, sinaptofiz veya SV2a'ya karşı antikorları seçin. - Lifleri birincil antikor seyreltmesi ile bir gecede 4 °C'de kuluçkaya bırakın (isteğe bağlı olarak, 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapılabilir). Her iki durumda da, inkübasyonun nemli bir oda kullanarak gerçekleştirilmesi önemli olacaktır.
-
İmmünofluoresans: sekonder antikor inkübasyonu (Gün 4)
- Birincil antikoru çıkarın ve lifleri 500 μL DPBS ve son kez BB ile 10 dakika boyunca 3x durulayın.
- Bu son yıkamayı çıkarın ve BB'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikoru ekleyin. Bu deney için BB'de 1/1000 seyreltmede 500 μL keçi anti-fare Alexa Fluor 488 kullanıldı. NMJ'lerin postsinaptik elemanını görüntülemek için, ikincil antikor seyreltimine 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotin-XX konjugesi eklendi.
NOT: Btx-biotin XX'in eklenmesi, sinyali yükselten streptavidin ile algılandıktan sonra daha iyi sinyalden gürültüye görüntüler sağlar. Ek olarak, farklı floroforlara streptavidin konjugasyonu, ortak etiketleme tahlillerinde renk kombinasyonlarını artırdı. Alternatif olarak, floresan etiketli Btx, benzer kalitede görüntüler elde etmeyi sağlar. - İkincil antikor ve Btx'i oda sıcaklığında 2 saat veya ışıktan korunan 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- İkincil antikoru ve Btx'i çıkarın, her biri 10 dakika boyunca 500 μL DPBS ve bb ile son durulama ile 3x yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat bb ile 1/1000 seyreltmede 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 ile kuluçkaya yatırın. Bu noktada, istenirse, 1 μg / mL'lik son konsantrasyonda diaminophenylindole gibi çekirdeklere karşı koymak için bir prob ekleyin.
- Kuluçka çözeltisini çıkarın ve lifleri 500 μL DPBS ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın. Ardından, lifleri monte edin.
-
Montaj
- Mikroskop kaydırağının üzerine bir karenin köşeleriymiş gibi 4 nokta şeffaf oje yerleştirin. 1-2 dk kurusunlar. Bunlar, kapak örtülerin dinlenecekleri noktalar olacak ve doku ezilmesini önlemeye yardımcı olacaktır.
- Son DPBS yıkamasını çıkarın ve lifleri kapsayacak kadar montaj ortamı (~ 200 μL) ekleyin; kurumaktan kaçının.
NOT: Montaj ortamı karışımının 10 mL'lik kısmını hazırlamak için Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: gliserol'ü 4:1 (v:v) olarak kullanın. - Montaj medyasını liflerin üzerine dikkatlice yaymak için 200 μL pipet ucu kullanın ve hepsinin tamamen daldırılmasını sağlayın. Kapak camını yerleştirmeden önce hava kabarcıklarını çıkarın.
- Kapak kapağını, hava kabarcıklarının üretilmesini önlemeye çalışan numunelerin üzerine yerleştirin. Bu hareket, kümeslerin yardımıyla yapılabilir.
4. Mikroskopi ve morfometrik analiz
- Lazer konfokal mikroskopi kullanarak alay edilen lif preparatlarını görüntüleyin.
- Tek mikrometre aralığı kullanarak sinapsların tamamında bir dizi optik bölüm (30 μm Z yığını) alın. Yığını ayarlamak için Btx sinyalini kullanın. Görüntü 2048 px x 2048 px çözünürlüğe sahip her kas durumu için en az 15-20 NMJs. Bu yöntem, morfometrik analiz için yeterli optik kalite ve çözünürlüğe sahip görüntüler elde etmek için seçildi.
- Ölçümleri gerçekleştirmek için, herhangi bir analiz yazılımıyla yığınların projeksiyon görüntülerini kullanın.
NOT: Açıklanan morfometrik analiz manuel olarak yapılmış olmasına rağmen, pre ve postynaptik NMJ morfolojisinin birçok farklı yönünü incelemek için yakın zamanda geliştirilen iki Image J tabanlı araç vardır33,34. - Toplam NMJ alan değerlerini elde etmek için Photoshop Manyetik kement aracını kullanarak arka plakanın dış kenarlığını (lekeli alanın dış anahattı, bkz. Şekil 2)seçin ve Histogram penceresinde seçilen piksel sayısını belirleyin. Daha sonra, piksel alanları konfokal yazılım tarafından belirtilen ölçek kullanılarak kare mikrometrelere dönüştürülebilir.
- Aynı kement aracıyla, iç kenarlığı seçin (son plakadaki lekeli alanın anahatları, bkz. Şekil 2)ve yukarıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tüm yapıdaki (veya boş alandaki) lekesiz alanı belirleyin (adım 4.4.). Postsynaptic Area değerleri, toplam alanı her NMJ'nin boş alanından çıkardıktan sonra elde edilecektir.
- Anti-nörofilament immünofluoresanslı alan olarak tanımlanan Presynaptik Alanı, Total NMJ alanına benzer şekilde elde edin.
NOT: Tüm bu parametreler Post-Synaptic Density indeksini (Postynaptik Alan/Toplam Alan) ve NMJ Kapsamını (Presynaptik Alan/Postynaptik Alan) belirlemek için kullanılmıştır. Daha yüksek bir Postynaptik Yoğunluk indeksi daha yoğun veya daha kompakt bir uç plaka anlamına gelirken, daha küçük bir NMJ Kapsamı sinir terminali ve uç plaka (her ikisi de bir denervasyon işlemiyle uyumlu) arasındaki çok daha zayıf bir etkileşimi yansıtır. Burada gösterilen olguda sinir terminali düzeyinde fosforilasyonlu ve fosforilasyonsuz nörofilament formları tespit edildiğinden fosforilasyonlu/fosforilasyonsuz presynaptik sinyal oranı ve fosforillü/fosforilasyonsuz kapsama oranı hesaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, kas liflerini iki farklı kas türünden izole etmek ve immünostain etmek için basit bir yöntem sunar (hızlı ve yavaş seğiren kaslar, bkz. Şekil 1). Doğru belirteçler ve / veya problar kullanılarak, NMJ bileşenleri, hastalığın ilerlemesi veya belirli bir ilaç tedavisinin sonucu olarak ortaya çıkabilecek bazı morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için nicel bir bakış açısıyla tespit edilebilir ve değerlendirilebilir. Bu çalışmada, NMJ'nin presinyaptik ve postsinaptik bileşenleri sırasıyla anti-Nf veya anti-Phos-Nf antikorları ve Btx kullanılarak floresan olarak etiketlenmiştir(Şekil 2, üst paneller). Şekil 2'ninalt panellerinde açıklanan parametreleri uygulayan Protokol bölümünde (Tablo 1) belirtilen morfometrik ölçümleri ve dizinleri belirlemek için immünostainlemeden sonra elde edilen bir NMJ'nin her yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüsü.
Bu tüm montajlı NMJ preparatının sinaps mimarisini mükemmel bir şekilde koruduğunu göstermek için, üzerinde ilerleyici bir sinir sistemi hastalığı olan etkinin görselleştirilmesine izin veren, insan geni SOD1G93A'yı (bir ALS modeli) ifade eden transgenik sıçanların alaylı lifleri protokol kullanılarak immünostain edildi (Şekil 3). Pre ve postynaptik sinyallerin DAPI ile lekelenmiş çekirdeklerle birleştirilmesi, NMJ'ler arasında transgenik ve transgenik olmayan yaşla eşleşen hayvanlar arasındaki farklılıkların açıkça görülebildiği ve literatürün beklediği sonuçlarla uyumlu olduğunu göstermiştir.
Buna ek olarak, görüntülerin kalitesi morfometrik analiz yapılarak gözlemlenen değişikliklerin ölçülmesini mümkün kıldı. Örneğin, Şekil 4, transgenik hayvanlarda postynaptik sinyalin, esas olarak NMJ toplam alanının azalması nedeniyle daha kompakt (yaklaşık% 20) göründüğüne dair kanıtlar göstermektedir.
Öte yandan, Şekil 5, transgenik hayvanlarda NMJ'lerin presynaptik alanının da azaldığını göstermektedir. Bu tüm montajlı NMJ preparatının kalitesi, sinir terminali geri çekilmesinin boyutunu analiz ederek ve nörofilament fosforilasyon durumlarla ilgili değişiklikleri tespit ederek kanıtlandı. Bu gerçek, kullanılan modelde ALS hastalığı ile ilgili NMJ sökme süreci hakkında derin bir fikir edinmek için önemli olacaktır. Tespit edilen en küçük presynaptik alan anti-fosforilasyonlu nörofilament ile etiketlenmiş olandı(Şekil 5B, E, C, F).
Kapsam indeksinin kullanımı (Şekil 6) transgenik NMJ'lerin kısmen denervated olduğunu tespit etmeyi mümkün kıldı. Ayrıca, fosforilasyonlu nörofilamentin kapsama indekslerinin fosforilasyonsuz nörofilament ile elde edilenden daha düşük olduğunu belirleyebilir. Bu sonuçlar, tüm mount NMJ'nin durumuyla ilgili olduğunu ve bu tüm montajlı NMJ preparatını kullanarak nörofilament fosforilasyon durumunun (filament plastisitesinin ve stabilitesinin önemli bir belirleyicisi) çalışmasının tanıtılmasının yararlı olabileceğini göstermektedir.
Son olarak, bu çalışmada sunulan yöntemler, NMJ'deki ince değişiklikleri bir bütün olarak veya bileşenlerinden birinde tanımlamak, değerlendirmek ve değerlendirmek için en yüksek NMJ kalitesini sunar.
Şekil 1: EDL ve soleus anatomik simge yapıları. Görüntü vurgusu (A) EDL ve (B) sıçan alt arka uzvun diğer kasları arasında soleus konumu. İç kısımlar EDL (kırmızı) ve soleus (yeşil) kaslarına yakın arka uzuv kaslarının şemalarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EDL kas liflerinin tüm montajlı nöromüsküler kavşağı. (A) NMJ'nin postsinabikli bileşeni, özellikle asetilkolin reseptörlerine (AChR) bağlanan bir prob olan alfa-bungarotoxin (Btx, macenta) kullanılarak tespit edildi. (B) Motor terminali anti-nörofilamentler (anti-Nf, yeşil) kullanılarak tespit edildi. (C,D) Sinaptik bileşenler, protokolde ayrıntılı olarak açıklanan morfometrik analiz için kullanılan ölçümleri (Toplam Alan, Presynaptik ve Postynaptik Alan) tanımlayan parametreleri (dış ve iç kenarlıklar) göstermek için şematize edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Als modelinin NMJ'lerinde gözlenen pre ve postynaptik değişiklikler. Transgenik olmayan (-/-) veya transgenik (hSOD1G93A/-) sıçanlardan nörofilamentleri (yeşil), AChR 'yi (macenta) ve çekirdeği (mavi) tespit etmek için boyanmış EDL kas liflerinden preparatlarda elde edilen tam montajlı NMJ'lerden elde edilen temsili konfokal görüntüler. (A,C) Transgenik olmayan sıçanlar, motor ucu anti-Phos-Nf (A) veya anti-Nf (C)kullanılarak görselleştirildiğinde normal NMJ morfolojisine (kraker şekli) sahiptir. (B,D) Transgenik sıçanlar, nörofilament fosforilasyon sinyalinde bir azalma ile daha kompakt postsinamiptik alan ve daha küçük presinyaptik terminaller sunar. Ölçek çubuğu = 50 μm.
Şekil 4: 180 günlük erkek hSOD1G93A sıçanlarından EDL kaslarındaki NMJ postynaptik elemanının morfometrik değerlendirilmesi. (A,D) transgenik olmayan ve (B,E) transgenik hayvanlardaki postynaptik bileşenlerin temsili konfokal görüntüleri. Transgenik olmayan (katı sütunlar) ve transgenik (çizgili sütunlar) hayvanların NMJ'lerinde(C)postinaptik alan ve(F)posttiranptik yoğunluk indeksinin değerlendirilmesi. Transgenik hayvanlarda postinaptik alan biraz azalırken, postinaptik indeks, Tablo 1'degösterildiği gibi transgenik hayvanlarda azaltılmış toplam alan ile belirtilen NMJ sıkıştırma derecesini vurgulayarak daha büyük oranda artmıştır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Temsil edilen veriler, sırasıyla ± SEM. (*) ve (***) belirtilen p<0.05 ve p<0.001'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 180 günlük erkek hSOD1G93A sıçanlarından EDL kaslarında NMJ presynaptik elemanının morfometrik değerlendirilmesi. ALS hastalığında NMJ sökümunun önemi göz önüne alındığında, preparatın kalitesi, sadece sinir terminali geri çekilmesinin kapsamı değil, aynı zamanda NMJ presinaptik elemanının fosforilasyonundaki değişiklikleri tespit etme olasılığı da analiz ederek değerlendirildi. (A,D) transgenik olmayan ve (B,E) transgenik olmayan hayvanlardaki presynaptik bileşenin temsili konfokal görüntüleri (A,B) anti-Phos-Nf veya (D,E) anti-Nf antikorları kullanılarak tespit edildi. Transgenik olmayan (katı sütunlar) ve transgenik (çizgili sütunlar) hayvanların NMJ'lerinde (C) fosforilasyonlu ve(F) fosforilasyonsuz nörofilamentler tarafından sınırlandırılmış Presynaptik Alanın değerlendirilmesi. Bu alanların transgenik olmayan hayvanlarda çok benzer olduğunu, transgenik hayvanların NMJ'lerinde önemli bir azalma sunduklarını unutmayın. Ölçek çubuğu = 50 μm. Temsil edilen veriler, SEM. (*) belirtilen <0.0001 ± ortalamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: EDL hSOD1G93A liflerinin tam montajlı NMJ'lerinde innervasyon durumunun değerlendirilmesi. Kapsam indeksi, innervasyon durumunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. "Tamamen iç içe geçmiş" NMJ'lerin %50 kapsama endeksi 
sunduğu, "kısmen iç içe" olanların %20 ile %≥ ≤50 arasında kapsama alanına sahip olduğu ve boş olanların ise "denervated" olarak kabul edildiği düşünülmektedir. Motor terminalini gözlemlemek için (A,B) anti-Phos-Nf veya (D,E) anti-Nf antikorları kullanılarak tespit edilen presynaptik ve postynaptik elementleri gösteren (A,D) transgenik olmayan ve (B,E) transgenik NMJ'lerin temsili konfokal görüntüleri. Transgenik olmayan (katı sütunlar) ve transgenik (çizgili sütunlar) hayvanların NMJ'lerinde(C) fosforilasyonlu ve(F)fosforilasyonsuz nörofilamentler kullanılarak kapsamın değerlendirilmesi. Görüntüler ve grafikler, transgenik hayvanlardan gelen NMJ'lerin transgenik olmayanlara göre daha düşük bir kapsama indeksi sunduğuna dair kanıtlar göstermektedir. Ek olarak, transgenik hayvanlarda fosforilasyonlu nörofilamentlerin kapsama indeksleri fosforilasyonsuz form (%25) tespit edildiğinde elde edilenden daha düşüktür (%18). Bu gerçek, Tablo 1'de gösterildiği gibi her iki dizin arasındaki ilişki ile doğrulanmıştır. Hazırlıkların kalitesinin, "tamamen içselleştirilmiş" olarak beklenen NMJ'ler için öngörülen kapsama endeksinin% 50'sini elde etmeyi sağladığını unutmayın. Ölçek çubuğu = 50 μm. Temsil edilen veriler, sırasıyla ± SEM. (***) ve (**) belirtilen p<0.001 ve p<0.0001'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. Transgenik olmayan ve transgenik olmayan EDL liflerinin tam montajlı NMJ'lerinden elde edilen morfometrik parametreler ve oranlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, NMJ değişikliklerinin yanı sıra montaj/sökme süreçlerini nicel olarak değerlendirmek için iki sıçan iskelet kasının (biri yavaş seğirme ve diğeri hızlı seğirme), fiber kas izolasyonu ve pre ve postynaptik belirteçlerin immünofluoresans tespiti için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu tür bir protokol kemirgen modellerinde yararlı olabilir41,42 fizyolojik veya patolojik süreçler sırasında NMJ'yi değerlendirmek için als hSOD1G93A sıçanlarında bulunan gibi bir motor nöron dejenerasyonu modelinde örneklendirilir.
Başarı ve faydalı sonuçlar elde etmek için bazı ipuçlarını akılda tutmak gerekir. Örneğin, açıklanan protokol, parçalanmış kasların hemen kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, kası daha uzun süre korumak için gerektiğinde% 0.05 sodyum azid artı 4 ° C depolama ile DPBS kullanımı, mükemmel kas korumasını 4 haftaya kadar uzatmaya izin verir. Bu seçeneği kullanırken, boyama işlemine başlamadan önce DPBS ile kapsamlı yıkamalar yapılmalıdır (her biri 5x, 10 dk). Kaliteli görüntüler elde etmek için başka bir yararlı seçenek, kas otofluoresansını azalttığı için PFA konsantrasyonu% 0.5'te düşürülmesini içerir. Buna 4 °C'de 24 saate kadar daha uzun fiksasyon eşlik etmelidir.
Lif izolasyonu ile ilgili olarak, daha küçük lif grupları daha iyi immünodeteksiyon nitelikleri üretir. Silanize slaytlarda kurutulan lifler 2 ila 3 gün içinde kullanılmalıdır. Bu süreden sonra, immünodetections iyi kalitede değildir.
Silanize slaytlardaki kurutulmuş liflere bir alternatif, lif uçlarından birinde tendon dokusu tarafından bir arada tutulan bir dizi kısmen izole lif üretmek (kas liflerinin bir "tutamı") ve mikrosantrifüj tüplerinde "serbest yüzen" yöntemle kuluçkalar gerçekleştirmektir. Bu seçeneğin kullanılması, antikor inkübasyon sürelerini birkaç saat (24-48 saat) ve yıkama sayısını (her biri 10 dakikadan en az 6) artırmak için gereklidir.
Lif izolasyonu ile ilgili olarak, lif ayrımını sağlamak için tendonun yavaşça ters yönlere çekildiği uçları çıkararak "alay" yapmak gerekir.
İmmündeteksiyonu iyileştirmek için bir diğer kritik adım, BB'ye% 1 Triton X-100 ve 50 mM glisinin eklenmesidir. Bu, homojen lekelenme ve biraz arka plana sahip preparatlar elde etmek için önemlidir. Ayrıca, lekesiz liflerin görüntülenebilmesi gerektiğinde biraz arka plana sahip olmanın faydalı olabileceğini belirtmek gerekir. Lif çapının NMJ alanından uzakta ölçülebilir olması iyidir, çünkü bu seviyede artırılabilir. Bu nedenle, fiber çapını bir NMJ profilinin değerine eşit bir mesafede belirleyin.
Sunulan prosedürü kullanarak fizyolojik koşullar altında NMJ bileşenlerinin tanımlanması ve nicel hale alınması mümkündür. Ayrıca, ALS patogenezinde açıklandığı gibi NMJ sökümü24 ve terminal uçlarında fosforilasyonlu nörofilament kaybı39 olarak erken anahtar patolojik olayların incelenmesine izin verir. Bu nedenle, açıklanan protokol, NMJ yeniden modellemesini daha iyi anlamaya yardımcı olmak için alternatif ve basit bir yaklaşım sunarak, görselleştirilen morfolojik özelliklerin NMJ'lerin dejenere durumunu teşhis etmek veya farklı terapötik yaklaşımları değerlendirmek için yararlı araçlar olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca Charcot-Marie-Tooth41 ve spinal müsküler atrofi42 gibi NMJ bozulmasına neden olan diğer hastalık modelleri için de geçerlidir.
Buna ek olarak, bu çalışmada açıklanan yaklaşımlar, bu üçlü sinapsı entegre eden Schwann hücrelerini tanımlamak ve sonunda NMJ yeniden şekillendirme43sırasındaki bazı rollerini değerlendirmek için kullanılabilir. Çalışmalar yenidoğanlarda yetişkinlere kadar, fizyolojik koşullar altında veya nöromüsküler sistemi etkileyen farklı tedavilere yanıt olarak yapılabilir.
Son olarak, manuel ölçümler yapmak için tüketilen zamanla birlikte numuneleri parçalamak ve etiketlemek için gereken mükemmel işleme rağmen, burada sunulan metodoloji, antikorların ve probların kolay penetrasyonu nedeniyle farklı NMJ bileşenlerinin optimum bir şekilde etiketilmesini sağlar. Kesitli kas preparatlarında daha iyi penetrasyon elde edilebilse de, alay etmek kas bölümlerinde kaybedilebilen tüm sinaptik bileşenlerin 3D morfolojik bütünlüğünü korur. Ayrıca, kas parçasının dahil edilmesi ve uygulanabilir tanıma elde etmek için daha fazla antijen alımı gibi bölümleri yapmak için gereken tüm hazırlıklardan kaçınır. Ayrıca, tüm innervasyon kalıplarını koruyan tüm montaj preparatları ile karşılaştırıldığında, alay etmek izole liflerin incelenmesini sağlar. Bu, patolojik koşullarda bildirilen lif heterojenliğini değerlendirmek için gerektiğinde önemli bir avantaj olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu işe verilen mali destek için CSIC ve PEDECIBA'ya çok teşekkürler; el yazması düzeltmeleri için Natalia Rosano'ya; Marcelo Casacuberta'ya videoyu çekene ve Nicolás Bolatto'ya sesini ödünç verdiği için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
