Summary
La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.
Abstract
La unión neuromuscular (NMJ) es un punto de contacto especializado entre el nervio motor y el músculo esquelético. Esta sinapsis periférica exhibe alta plasticidad morfológica y funcional. En desordenes numerosos del sistema nervioso, NMJ es una blanco patológica temprana dando por resultado falta de la neurotransmisión, debilidad, atrofia, e incluso en muerte de la fibra de músculo. Debido a su relevancia, la posibilidad de evaluar cuantitativamente ciertos aspectos de la relación entre los componentes nmj puede ayudar a comprender los procesos asociados con su montaje / desmontaje. El primer obstáculo cuando se trabaja con los músculos es obtener la experiencia técnica para identificar y diseccionar rápidamente sin dañar sus fibras. El segundo desafío es utilizar métodos de detección de alta calidad para obtener imágenes NMJ que se pueden utilizar para realizar análisis cuantitativos. Este artículo presenta un protocolo paso a paso para diseccionar los músculos del longus del digitorum del extensor y del sóseo de ratas. También se explica el uso de la inmunofluorescencia para visualizar elementos pre y postsinápticos de NMJ de montaje completo. Los resultados obtenidos demuestran que esta técnica puede utilizarse para establecer la anatomía microscópica de la sinapsis e identificar cambios sutiles en el estado de algunos de sus componentes en condiciones fisiológicas o patológicas.
Introduction
La unión neuromuscular de mamíferos (NMJ) es una gran sinapsis tripartita colinérgica compuesta por la terminación nerviosa de la neurona motora, la membrana postsináptica en la fibra muscular esquelética y las células terminales de Schwann1,2,3. Esta sinapsis exhibe una alta plasticidad morfológica y funcional4,5,6,7,8,incluso durante la edad adulta cuando los NMJ pueden sufrir modificaciones estructurales dinámicas. Por ejemplo, algunos investigadores han demostrado que las terminaciones nerviosas motoras cambian continuamente su forma a la escala micrómetro9. También se ha divulgado que la morfología del NMJ responde a los requisitos funcionales, al uso alterado, al envejecimiento, al ejercicio, o a las variaciones en actividad locomotriz4,10,11,12,13,14,15. Así, el entrenamiento y la falta de uso representan estímulos esenciales para modificar algunas características del NMJ, como su tamaño, longitud, dispersión de vesículas y receptores sinápticos, así como la ramificación terminal nerviosa14,16,17,18,19,20.
Además, se ha demostrado que cualquier cambio estructural o degeneración de esta unión vital podría resultar en la muerte celular de la neurona motora y la atrofia muscular21. También se piensa que la comunicación alterada entre los nervios y los músculos podría ser responsable de los cambios fisiológicos relativos a la edad NMJ y posiblemente de su destrucción en estados patológicos. El desmantelamiento de la unión neuromuscular juega un papel crucial en la aparición de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), una enfermedad neurodegenerativa que constituye uno de los mejores ejemplos de alteración de la interacción músculo-nervio3. A pesar de los numerosos estudios realizados sobre la disfunción de la neurona motora, todavía se debate si el deterioro observado en la ELA se produce debido al daño directo en la neurona motora y luego se extiende a las proyecciones cortico-espinales22; o si debe considerarse como una axonopatía distal donde la degeneración comienza en las terminaciones nerviosas y progresa hacia la neurona motora somas23,24. Dada la complejidad de la patología de la ELA, es lógico considerar que se produce una mezcla de procesos independientes. Como nmj es el jugador central de la interacción fisiopatológica entre el músculo y el nervio, su desestabilización representa un punto crucial en el origen de la enfermedad que es relevante para ser analizado.
El sistema neuromuscular de los mamíferos está organizado funcionalmente en unidades motoras discretas, que consisten en una neurona motora y las fibras musculares que son inervadas exclusivamente por su terminal nervioso. Cada unidad motora tiene fibras con propiedades estructurales y funcionales similares o idénticas25. El reclutamiento selectivo de la neurona motora permite optimizar la respuesta muscular a las demandas funcionales. Ahora está claro que los músculos esqueléticos de los mamíferos se componen de cuatro tipos diferentes de fibras. Algunos músculos son nombrados según las características de su tipo de fibra más abundante. Por ejemplo, el sóleo (un músculo posterior de la extremidad posterior involucrado en el mantenimiento de la postura corporal) lleva una mayoría de unidades de contracción lenta (tipo 1) y se reconoce como un músculo lento. En cambio, el extensor digitorum longus (EDL) se compone esencialmente de unidades con propiedades similares de contracción rápida (fibras tipo 2) y se conoce como un músculo rápido especializado para los movimientos fásicos necesarios para la locomoción. En otras palabras, aunque los músculos adultos son de naturaleza plástica debido a las influencias hormonales y neuronales, su composición de fibras determina la capacidad de realizar diferentes actividades, como se ve en el sóseo que experimenta una actividad continua de baja intensidad y EDL que exhibe una contracción única más rápida. Otras características que son variables entre los diferentes tipos de fibras musculares están relacionadas con su estructura (contenido mitocondrial, extensión del retículo sarcopásmico, grosor de la línea Z), contenido de miosina ATPasa, y composición de la cadena pesada de miosina26,27,28,29.
Para los NMJ de roedores, hay diferencias significativas entre los músculos28,29. Los análisis morfométricos realizados en sóleo y EDL de ratas revelaron una correlación positiva entre el área sináptica y el diámetro de la fibra (es decir, el área sináptica en las fibras lentas del sóleo es mayor que en las fibras rápidas de EDL) pero la relación entre el área de NMJ y el tamaño de la fibra es similar en ambos músculos30,31. Además, en relación a los terminales nerviosos, las áreas absolutas de endplate en las fibras tipo 1 fueron menores que en las fibras tipo 2, mientras que la normalización por diámetro de la fibra hizo que las áreas de los terminales nerviosos en las fibras tipo 1 fueran las más grandes32.
Sin embargo, muy pocos estudios se centran en el análisis morfométrico para mostrar la evidencia de cambios en algunos de los componentes del NMJ33,34. Así, debido a la relevancia del NMJ en la función del organismo, cuya morfología y fisiología se ven alteradas en diversas patologías, es importante optimizar los protocolos de disección de diferentes tipos de músculos con la calidad suficiente para permitir la visualización de toda la estructura nmj. También es necesario evaluar la ocurrencia de cambios pre o postsinápticos en diferentes situaciones o condiciones experimentales como el envejecimiento o el ejercicio35,36,37,38. Además, puede ser útil evidenciar alteraciones más sutiles en los componentes de NMJ, como la fosforilación alterada del neurofilamento en las terminaciones nerviosas terminales, como se informa en la ELA39.
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Protocol
Todos los procedimientos animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos de la Ley Nacional N° 18611 para el Cuidado de animales utilizados con fines experimentales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo Número 004/09/2015).
1. Disección muscular (Día 1)
NOTA: Antes de comenzar, haga 40 mL de paraformadehído al 0,5% (PFA), pH 7,4 en solución salina de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Opcionalmente, haga 20 mL de 4% PFA. Preparar alícuotas de 5 mL y congelar a -20 °C. El día de la disección, descongelar una alícuota al 4% y añadir 35 mL de DPBS para obtener 40 mL de PFA al 0,5%.
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Aislamiento de EDL (músculo de contracción rápida)
- Eutanasiar a una rata. Coloque al animal con el abdomen hacia arriba. Haga una incisión inicial usando una cuchilla quirúrgica entre los dedos de los dedos hacia la extremidad posterior.
NOTA: En este caso, una inyección intraperitoneal de 90:10 mg/Kg de ketamina: la xilazina fue dada para euthanize la rata, pero otras opciones de la anestesia también se permiten. - Desprenda la piel, tirando de ella hacia arriba hasta que la rodilla de la rata esté expuesta.
- Para encontrar el EDL, siga los tendones del pie hasta el ligamento anular. Este ligamento rodea dos tendones. Corte el ligamento entre los dos tendones con tijeras unibandas (o similares). Identifique el tendón EDL levantando ambos y elija el que hace que los dedos de los dedos se muevan hacia arriba.
- Cortar el tendón con tijeras unibandas. Luego, mientras sostiene el tendón con pinzas biológicas finas, comience a separar lentamente el músculo EDL del tibial anterior, el peroneus brevis y el peroneus longus40 (ver Figura 1A).
NOTA: Asegúrese de que el músculo esté separado sin ningún daño. Haga esto cortando el resto de los músculos laterales para abrir un camino entre ellos (el EDL no tiene una ubicación superficial) mientras sostiene y levanta el músculo EDL. - Para aislar completamente el músculo, corte el tendón unido a la rodilla de la rata con tijeras unibandas.
- Sumergir el músculo diseccionado en 5 mL de PFA al 0,5% y dejar durante 24 h a 4 ºC. Opcionalmente, grapa el músculo en un pedazo de cartón y gire con el músculo hacia abajo. A continuación, sumergirlo completamente en 8 mL de la solución fijadora. Este paso ayuda a mantener el músculo alargado durante el proceso de fijación.
- Eutanasiar a una rata. Coloque al animal con el abdomen hacia arriba. Haga una incisión inicial usando una cuchilla quirúrgica entre los dedos de los dedos hacia la extremidad posterior.
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Aislamiento del sóleo (músculo de contracción lenta)
- Voltee al animal (el abdomen ahora está mirando hacia abajo). A través de la piel, corte el tendón calcáneo usando una cuchilla quirúrgica.
- Con la ayuda de las pinzas biológicas y las tijeras unibanda, separe el músculo gastrocnemio de los huesos, creando una "tapa muscular". El sóleo estará en el lado interno de la tapa muscular. Se puede identificar porque es de color rojo y tiene una morfología plana.
- Con un par de pinzas biológicas, alcanzar y levantar el tendón del sóleo que se encuentra por encima del gastrocnemio (ver Figura 1B).
- Cortar el tendón con tijeras unibandas. Levante todo el músculo mientras corta algunos de los puntos de unión débiles (es decir, elementos neurovasculares). Finalmente, para liberar completamente el músculo sóseo, corte el fascículo del sóseo que forma el tendón calcáneo con tijeras unibanda.
- Repetir el paso 1.1.6 para reparar el músculo sóseo diseccionado.
2. Preparación de fibra burlada (Día 2)
- Después de 24 h de fijación, enjuague los músculos con 6 mL de solución dpbs 3x durante 10 min cada uno antes de aislar las fibras musculares.
- Para aislar las fibras, coloque un músculo en un portaobjetos al microscopio. Usando un estereomicroscopio, sostenga suavemente uno de los tendones con un par de pinzas biológicas. Luego, con las otras pinzas biológicas, comience a pellizcar el tendón lentamente para separar las fibras musculares. Después de eso, tire lentamente del tejido pellizcado hacia arriba hacia el tendón muscular opuesto. Será necesario repetir esta acción varias veces hasta obtener múltiples haces pequeños y aislados.
- Colócales cuidadosamente en un portaobjetos pre-tratado (silanizado). Es necesario mantener todas las fibras en orden para que no se superpongan. En este punto, secar al aire las fibras durante 24 h.
3. Inmunofluorescencia
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Incubación primaria de anticuerpos (Día 3)
NOTA: Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente, excepto si se indica lo contrario. La forma más eficiente de eliminar las diferentes soluciones sin separar las fibras del portaobjetos es usar una jeringa de insulina.- Para comenzar el proceso de inmunotenstenimiento, rodee las fibras musculares aisladas secas con una pluma de Papanicolaou para crear una barrera impermeable.
- Para hidratar las fibras musculares, agregue 200 μL de agua destilada durante 5 min, y luego cambie el agua a 200 μL de DPBS para la siguiente incubación de 5 min. En este punto, inicie el etiquetado de inmunofluorescencia.
- Incubar fibras con 300 μL de un tampón de bloqueo (BB) que contenga 50 mM de glicina, 1% de BSA y 1% de Tritón X-100 durante 30 min.
- Reemplace BB con el anticuerpo primario a una concentración sugerida por los fabricantes. Utilice el BB para diluir el anticuerpo. Este experimento utilizó 400 μL de SMI 32 o SMI 31 que reconocieron el neurofilamento H no fosforilado (Nf) o fosforilado (Fosfos-Nf) a la dilución de 1/800 para detectar el componente presináptico NMJ.
NOTA: Al decidir reconocer todo el elemento presináptico en lugar de evaluar la fosforilación del neurofilamento, elija anticuerpos contra la sinapsina, la sinaptofisina o sv2a que se emplearon previamente con éxito. - Incubar las fibras con la dilución primaria de anticuerpos a 4 °C durante la noche (opcionalmente, la incubación se puede realizar a 37 °C durante 1 h). En ambos casos, será importante realizar la incubación utilizando una cámara húmeda.
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Inmunofluorescencia: Incubación secundaria de anticuerpos (Día 4)
- Retire el anticuerpo primario y enjuague las fibras 3x durante 10 min cada una con 500 μL de DPBS y la última vez con BB.
- Retiramos este último lavado y añadimos el anticuerpo secundario marcado fluorescentemente diluido en BB. Para este experimento, se utilizaron 500 μL de anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 a 1/1000 de dilución en BB. Para ver el elemento postsináptico de los NMJ, se añadieron 1:300 α-Bungarotoxina (Btx) biotina-XX conjugada a la dilución secundaria de anticuerpos.
NOTA: La adición de Btx-biotina XX permite mejores imágenes de señal a ruido una vez detectadas con estreptavidina que amplifica la señal. Además, la conjugación de la estreptavidina a diversos fluoróforos aumentó combinaciones del color en análisis del co-etiquetado. Alternativamente, btx marcado fluorescentemente permite obtener imágenes de calidad similar. - Incubar el anticuerpo secundario y el Btx durante 2 h a temperatura ambiente o 1 h a 37 °C protegidos de la luz.
- Retire el anticuerpo secundario y el Btx. Lavar 3x durante 10 min cada uno con 500 μL de DPBS y el último enjuague con BB.
- Incubar con 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 de dilución con BB durante 1 h a temperatura ambiente. En este punto, si se desea, añadir una sonda para contratener los núcleos, como diaminofenilindol a una concentración final de 1 μg/mL.
- Retire la solución de incubación y lave las fibras 3x durante 10 min cada una con 500 μL de DPBS. Luego, monte las fibras.
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Montura
- Coloque 4 puntos de esmalte de uñas transparente en el portaobjetos del microscopio como si fueran los vértices de un cuadrado. Déjalos secar 1-2 min. Estos serán los puntos donde descansarán las cubiertas, ayudando a evitar el aplastamiento de tejidos.
- Retire el último lavado DPBS y agregue suficientes medios de montaje (~ 200 μL) para cubrir las fibras; evitar el secado.
NOTA: Para preparar 10 mL de la mezcla de medios de montaje, utilice Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol en un 4:1 (v:v). - Utilice una punta de pipeta de 200 μL para extender cuidadosamente el medio de montaje sobre las fibras para garantizar una inmersión completa de todas ellas. Antes de colocar el vidrio de la cubierta, retire las burbujas de aire.
- Coloque el cubrebocas sobre las muestras tratando de evitar la generación de burbujas de aire. Este movimiento se puede hacer con la ayuda de los pórceps.
4. Microscopía y análisis morfométrico
- Imagen de las preparaciones de fibra burlada usando microscopía confocal láser.
- Tome una serie de secciones ópticas (pilas Z de 30 μm) a través de toda la sinapsis utilizando un intervalo de un micrómetro. Para establecer la pila, utilice la señal Btx. Imagen de al menos 15-20 NMJ para cada condición muscular con una resolución de 2048 px x 2048 px. Este método fue elegido para obtener imágenes con suficiente calidad óptica y resolución para el análisis morfométrico.
- Para realizar las mediciones, utilice las imágenes de proyección de las pilas con cualquier software de análisis.
NOTA: Aunque el análisis morfométrico explicado se realizó manualmente, existen dos herramientas basadas en Image J desarrolladas recientemente para estudiar muchos aspectos diferentes de la morfología NMJ pre y postsináptica33,34. - Para obtener los valores del área NMJ total, seleccione el borde externo (contorno externo del área teñida, consulte la Figura 2) del módulo con la herramienta lazo magnético de Photoshop y determine el número de píxeles seleccionados en la ventana Histograma. Luego, las áreas de píxeles se pueden convertir en micrómetros cuadrados utilizando la escala especificada por el software confocal.
- Con la misma herramienta de lazo, seleccione el borde interior (contornos del área teñida dentro del endplate, véase la figura 2)y determine el área no teñida en toda la estructura (o área vacía) como se detalla anteriormente (paso 4.4.). Los valores del Área Postsináptica se obtendrán después de restar el área total del área vacía de cada NMJ.
- Obtener el Área Presináptica, que se define como el área con inmunofluorescencia anti-neurofilamento, de manera similar a la zona NMJ Total.
NOTA: Todos estos parámetros fueron utilizados para determinar el índice de densidad post-sináptica (área postsináptica/área total) y la cobertura NMJ (área presináptica/área postsináptica). Un índice de densidad postsináptica más alto implica un endplate más denso -o más compacto-, mientras que una cobertura nmj más pequeña refleja una interacción mucho más pobre entre el terminal nervioso y el endplate (ambos compatibles con un proceso de la denervación). En el caso aquí mostrado, puesto que las formas fosforiladas y no-fosforiladas de neurofilamentos fueron detectadas en el nivel terminal del nervio, el ratio presináptico fosforilado/no-fosforilado de la señal y el ratio fosforilado/no-fosforilado de la cobertura fueron calculados.
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Representative Results
Este protocolo ofrece un método sencillo para aislar e inmunotener las fibras musculares de dos tipos diferentes de músculos (músculos de contracción rápida y lenta, ver Figura 1). Utilizando los marcadores y/o sondas correctos, los componentes de NMJ pueden ser detectados y evaluados desde un punto de vista cuantitativo para valorar algunos de los cambios morfológicos que pueden ocurrir como consecuencia de la progresión de la enfermedad o de un tratamiento farmacológico específico. En el presente estudio, los componentes presinápticos y postsinápticos del NMJ fueron etiquetados fluorescentemente utilizando anticuerpos anti-Nf o anti-Phos-Nf y Btx respectivamente(Figura 2,paneles superiores). Cada imagen confocal de alta resolución de un NMJ obtenida después de la inmunotensión se utilizó para determinar las mediciones morfométricas y los índices especificados en la sección Protocolo(Tabla 1)aplicando los parámetros descritos en los paneles inferiores de la Figura 2.
Para demostrar que esta preparación de NMJ de montaje completo retuvo perfectamente la arquitectura de la sinapsis, permitiendo la visualización del efecto que tiene una enfermedad progresiva del sistema nervioso sobre ella, se inmunotenían fibras de ratas transgénicas que expresan el gen humano SOD1G93A (un modelo de ELA) utilizando el protocolo(Figura 3). Las imágenes de fusión de señales pre y postsinápticas con los núcleos teñidos con DAPI mostraron que las diferencias entre los NMJ entre animales transgénicos y no transgénicos de edad comparable son claramente visibles y compatibles con los resultados esperados por la literatura.
Además, la calidad de las imágenes permite cuantificar los cambios observados mediante la realización del análisis morfométrico. Por ejemplo, la Figura 4 muestra evidencia de que la señal postsináptica en animales transgénicos parece ser más compacta (aproximadamente 20%), principalmente debido a la reducción del área total de NMJ.
Por otro lado, la Figura 5 muestra que el área presináptica de los NMJ en animales transgénicos también se reduce. La calidad de esta preparación de NMJ de montaje completo se evidenció mediante el análisis de la extensión de la retracción del terminal nervioso y mediante la detección de cambios relacionados con los estados de fosforilación de neurofilamento. Este hecho será importante para obtener una visión profunda del proceso de desmontaje de NMJ relacionado con la enfermedad del ALS en el modelo empleado. El área presináptica más pequeña detectada fue la etiquetada con neurofilamento antifosforilado(Figura 5B, E, C, F).
El uso del índice de cobertura (Figura 6) hizo posible establecer que los NMJ transgénicos estaban parcialmente desnervados. Asimismo, se podría determinar que los índices de cobertura del neurofilamento fosforilado son inferiores a los obtenidos con el neurofilamento no fosforilado. Estos resultados muestran el relativo al estado de NMJ de montaje completo y que podría ser útil introducir el estudio del estado de fosforilación del neurofilamento (un determinante importante de la plasticidad y estabilidad del filamento) utilizando esta preparación de NMJ de montaje completo.
Finalmente, los métodos presentados en este trabajo ofrecen la mayor calidad de NMJ para identificar, evaluar y evaluar incluso cambios sutiles en NMJ en su conjunto o en uno de sus componentes.
Figura 1:EDL y puntos de referencia anatómicos de sóseo. Imagen destacada(A)EDL y(B)ubicación del sóleo entre los otros músculos de la extremidad trasera inferior de la rata. Las inserciones muestran esquemas de los músculos de las extremidades posteriores cerca de los músculos EDL (rojo) y sóleo(verde). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Unión neuromuscular de montaje completo de las fibras musculares de EDL. (A)Componente postsináptico de NMJ detectado utilizando alfa-bungarotoxina (Btx, magenta), una sonda que se une específicamente a los receptores de acetilcolina (AChR). (B)Terminal motora detectado mediante anti-neurofilamentos (anti-Nf, verde). c,d) Los componentes sinápticos se esquematizan para ilustrar los parámetros (fronteras externas e internas) que definieron las mediciones (Área Total, Área Presináptica y Área Postsináptica) utilizadas para el análisis morfométrico detallado en el protocolo. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Alteraciones pre y postsinápticas observadas en NMJ de un modelo de ELA. Imágenes confocales representativas obtenidas de NMJs de montaje completo obtenidas en preparaciones de fibras musculares EDL teñidas para detectar neurofilamentos (verde), AChR (magenta) y núcleo (azul) de ratas no transgénicas (-/-) o transgénicas (hSOD1G93A/-). (A , C) Las ratas no transgénicas tienen morfología NMJ normal (forma de pretzel) tanto cuando el extremo motor se visualiza usando anti-Phos-Nf(A)o anti-Nf(C). b) Las ratas transgénicas presentan un área postsináptica más compacta y terminales presinápticas más pequeñas con una reducción en la señal de fosforilación del neurofilamento. Barra de escala = 50 μm.
Figura 4: Evaluación morfométrica del elemento postsináptico NMJ en músculos EDL de ratas machos hSOD1G93A de 180 días de edad. Imágenes confocales representativas de componentes postsinápticos en animales(A,D)no transgénicos y(B,E)transgénicos. Evaluación del área postsináptica(C)y(F)del índice de densidad postsináptica en NMJ de animales no transgénicos (columnas sólidas) y transgénicos (columnas rayadas). Mientras que el área postsináptica se redujo ligeramente en animales transgénicos, el índice postsináptico aumentó en mayor proporción destacando el grado de compactación de NMJ como lo indica la reducción del área total en animales transgénicos como se muestra en la Tabla 1. Barra de escala = 50 μm. Los datos representados son ± sem. (*) y (***) indicados p<0,05 y p<0,001, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Evaluación morfométrica del elemento presináptico NMJ en músculos EDL de ratas macho de 180 días de edad hSOD1G93A. Dada la importancia del desmontaje de NMJ en la enfermedad de ALS, se evaluó la calidad de la preparación mediante el análisis, no sólo de la extensión de la retracción del terminal nervioso, sino también de la posibilidad de detectar cambios en la fosforilación del elemento presináptico NMJ. Imágenes confocales representativas del componente presináptico en animales(A,D)no transgénicos y(B,E)transgénicos detectados utilizando(A,B)anticuerpos anti-Fos-Nf o(D,E)anti-Nf. Evaluación del Área Presináptica delimitada por(C)neurofilamentos fosforilados y(F)no fosforilados en NMJ de animales no transgénicos (columnas sólidas) y transgénicos (columnas rayadas). Nótese que estas áreas son muy similares en animales no transgénicos mientras que presentan una reducción significativa en los NMJ de animales transgénicos. Barra de escala = 50 μm. Los datos representados son ± sem. (****) indicado p<0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 6:Evaluación del estado de inervación en NMJ de montaje completo de fibras EDL hSOD1G93A. El índice de cobertura es ampliamente utilizado para evaluar el estado de inervación. Se considera que los NMJ "totalmente inervados" presentan un índice de cobertura 
del 50%, mientras que los "parcialmente inervados" tienen coberturas entre ≥20% y ≤50% y los que están vacantes se consideran "denervados". Imágenes confocales representativas de(A,D)NMJ no transgénicos y(B,E)transgénicos que muestran elementos presinápticos y postsinápticos detectados utilizando(A,B)anticuerpos anti-Fosfo-Nf o(D,E)anti-Nf para observar el terminal motor. Evaluación de la cobertura utilizando(C)neurofilamentos fosforilados y(F)no fosforilados en NMJ de animales no transgénicos (columnas sólidas) y transgénicos (columnas rayadas). Las imágenes y los gráficos muestran evidencia de que los NMJ de animales transgénicos presentan un índice de cobertura más bajo que los no transgénicos. Además, en animales transgénicos, los índices de cobertura de neurofilamentos fosforilados son inferiores (18%) a los obtenidos cuando se detecta la forma no fosforilada (25%. Este hecho se corrobora con la relación entre ambos índices como se muestra en la Tabla 1. Cabe destacar que la calidad de los preparados permite obtener el 50% del índice de cobertura estipulado para los NMJ esperados como "totalmente inervados". Barra de escala = 50 μm. Los datos representados son la media ± SEM. (***) y (****) indicados p<0,001 y p<0,0001, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Tabla 1. Parámetros morfométricos y relaciones obtenidas de NMJ de montaje completo de fibras EDL no transgénicas y transgénicas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para la disección de dos músculos esqueléticos de la rata (uno lento-contracción y el otro rápido-contracción contracción), aislamiento del músculo de la fibra y detección de la inmunofluorescencia de marcadores pre y postsinápticos para evaluar cuantitativo cambios de NMJ así como procesos del montaje/del desmontaje. Este tipo de protocolo puede ser útil en los modelos de roedores41,42 para evaluar nmj durante procesos fisiológicos o patológicos como se ejemplifica aquí en un modelo de degeneración de la neurona motora como se encuentra en el ALS hSOD1G93A ratas.
Para obtener éxito y resultados beneficiosos, es necesario tener en cuenta algunos consejos. Por ejemplo, el protocolo descrito permite el uso inmediato de músculos disecados. Sin embargo, cuando es necesario para preservar el músculo por más tiempo el uso de DPBS con azida de sodio al 0,05% más almacenamiento de 4 °C permite prolongar la excelente preservación muscular hasta 4 semanas. Cuando se utiliza esta opción, se deben realizar lavados extensos con DPBS (5x, 10 min cada uno) antes de iniciar el proceso de tinción. Otra opción útil para obtener imágenes de buena calidad incluye bajar la concentración de PFA al 0,5% porque redujo la autofluorescencia muscular. Esto debe ir acompañado de una fijación más larga de hasta 24 h a 4 °C.
En cuanto al aislamiento de fibras, grupos más pequeños de fibras producen mejores cualidades de inmunodetección. Las fibras secas en portaobjetos silanizados deben usarse dentro de 2 a 3 días. Después de este tiempo, las inmunodetección no son de buena calidad.
Una alternativa a las fibras secas en portaobjetos silanizados es generar un conjunto de fibras parcialmente aisladas que se mantienen unidas por el tejido tendinoso en una de las fibras finales (un "penacho" de fibras musculares) y llevar a cabo incubaciones en tubos de microcentrífuga por el método de "flotación libre". El uso de esta opción es necesario aumentar los tiempos de incubación de anticuerpos en varias horas (24-48 h), así como el número de lavados (al menos 6 de 10 min cada uno).
En relación con el aislamiento de la fibra sin daños, es necesario realizar la "tomadura de aceite" mediante la eliminación de los extremos donde el tendón se tira suavemente en direcciones opuestas para lograr la separación de la fibra.
Otro paso crítico para mejorar la inmunodetección es la adición de 1% de Tritón X-100 y 50 mM de glicina en el BB. Esto es importante para obtener preparaciones que tengan tinción homogénea y un poco de fondo. También vale la pena mencionar que tener un poco de fondo puede ser beneficioso cuando las fibras no manchadas necesitan ser foto fotovidas. El diámetro de la fibra es bueno para ser medido lejos del campo NMJ ya que se describe que puede ser aumentado a este nivel. Por lo tanto, determine el diámetro de la fibra a una distancia igual al valor de un perfil NMJ.
Utilizando el procedimiento presentado es posible identificar y cuantificar los componentes de NMJ en condiciones fisiológicas. También permite estudiar eventos patológicos clave tempranos como el desmantelamiento de NMJ24 y la pérdida de neurofilamento fosforilado en terminaciones terminales39 como se describe en la patogénesis de la ELA. Por esta razón, el protocolo descrito ofrece un enfoque alternativo y simple para ayudar a obtener una mejor comprensión de la remodelación de NMJ, lo que sugiere que las características morfológicas visualizadas pueden ser herramientas útiles para diagnosticar el estado degeneración de NMJ o para evaluar diferentes enfoques terapéuticos. También es aplicable a otros modelos de enfermedades como los de Charcot-Marie-Tooth41 y la atrofia muscular espinal42 que presentan alteración nmj.
Además, los enfoques descritos en este trabajo pueden ser empleados para identificar las células de Schwann que integran esta sinapsis tripartita y eventualmente para evaluar algunos de sus roles durante la remodelación del NMJ43. Los estudios se pueden hacer en neonatos hasta adultos, en condiciones fisiológicas o como respuesta a diferentes tratamientos que impactan en el sistema neuromuscular.
Finalmente, a pesar del excelente manejo necesario para diseccionar y etiquetar muestras junto con el tiempo consumido para realizar mediciones manuales, la metodología aquí presentada permite un etiquetado óptimo de los diferentes componentes nmj debido a la penetración facilitada de anticuerpos y sondas. Aunque se puede obtener una mejor penetración en las preparaciones musculares seccionados, las burlas preservan la integridad morfológica 3D de todos los componentes sinápticos que se pueden perder en las secciones musculares. También evita toda la preparación necesaria para hacer secciones como la inclusión de la pieza muscular y la recuperación adicional de antígenos para obtener un reconocimiento factible. Además, en comparación con las preparaciones de montaje completo que preservan los patrones de inervación completa, las burlas permiten el estudio de fibras aisladas. Esto puede ser una ventaja significativa cuando es necesario evaluar la heterogeneidad de la fibra divulgada en condiciones patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Muchas gracias al CSIC y al PEDECIBA por el apoyo financiero prestado a este trabajo; a Natalia Rosano por sus correcciones manuscritas; a Marcelo Casacuberta que hace el video y a Nicolás Bolatto por prestar su voz para ello.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
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