Denne protokollen beskriver ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra Escherichia coli etter behandling med en protetoksisk antimikrobiell. Etter denne prosedyren tillater en kvalitativ sammenligning av protein aggregert formasjon in vivo i ulike bakteriestammer og / eller mellom behandlinger.
Eksponeringen av levende organismer for miljømessige og cellulære påkjenninger forårsaker ofte forstyrrelser i protein homeostase og kan resultere i proteinaggregering. Akkumuleringen av proteinaggregater i bakterieceller kan føre til betydelige endringer i cellulær fenotypisk oppførsel, inkludert en reduksjon i vekstrater, stressmotstand og virulens. Det finnes flere eksperimentelle prosedyrer for undersøkelse av disse stressormediert fenotyper. Dette dokumentet beskriver en optimalisert analyse for ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med en sølv-rutheniumholdig antimikrobiell. Denne forbindelsen er kjent for å generere reaktive oksygenarter og forårsaker utbredt proteinaggregering.
Metoden kombinerer en sentrifugeringsbasert separasjon av proteinaggregater og oppløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med påfølgende separasjon og visualisering ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie-farging. Denne tilnærmingen er enkel, rask og tillater en kvalitativ sammenligning av proteinaggregatdannelse i forskjellige E. coli-stammer. Metodikken har et bredt spekter av applikasjoner, inkludert muligheten til å undersøke virkningen av andre proteotoksiske antimikrobielle midler på in vivo proteinaggregering i et bredt spekter av bakterier. Videre kan protokollen brukes til å identifisere gener som bidrar til økt motstand mot proteotokse stoffer. Gelbånd kan brukes til etterfølgende identifisering av proteiner som er spesielt utsatt for aggregering.
Bakterier er uunngåelig utsatt for et utall miljøspenninger, inkludert lav pH (f.eks. i pattedyrets mage)1,2, reaktive oksygen- og klorarter (ROS/RCS) (f.eks. under oksidativt utbrudd i fagocytter)3,4,5, forhøyede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmesjokk)6,7og flere potente antimikrobielle midler (f.eks. AGXX brukt i denne protokollen)8. Proteiner er spesielt sårbare for noen av disse stressorene, og eksponering kan provosere protein un-/misfolding som deretter frø aggregering. Alle organismer bruker beskyttende systemer som gjør at de kan takle proteinfeilfolding9. Imidlertid kan alvorlig stress overvelde proteinkvalitetskontrollmaskineriet og forstyrre den sekundære og / eller tertiære strukturen av proteiner, som til slutt inaktiverer proteiner. Som en konsekvens kan proteinaggregater sterkt svekke kritiske cellulære funksjoner som kreves for bakteriell vekst og overlevelse, stressmotstand og virulens10. Derfor er forskning med fokus på proteinaggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant tema på grunn av dens potensielle innvirkning på smittsom sykdomskontroll.
Varmeindusert protein utfolder seg og aggregering er ofte reversibel7. I motsetning kan andre protetoksiske påkjenninger, som oksidativt stress, forårsake irreversible proteinmodifikasjoner gjennom oksidasjon av spesifikke aminosyresidekjeder som resulterer i protein un-/misfolding og til slutt proteinaggregering4. Stressindusert dannelse av uoppløselige proteinaggregater har blitt grundig studert i sammenheng med molekylære anstander og deres beskyttende funksjoner i gjær og bakterier11,12,13. Flere protokoller har blitt publisert som bruker en rekke biokjemiske teknikker for isolering og analyse av uoppløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokollene har hovedsakelig blitt brukt til å studere bakteriell proteinaggregering ved varmesjokk og/eller identifisering av molekylære anstander. Selv om disse protokollene absolutt har vært et fremskritt for feltet, er det noen store ulemper i de eksperimentelle prosedyrene fordi de krever (i) et stort bakteriekulturvolum på opptil 10 L14,17, (ii) kompliserte fysiske forstyrrelsesprosesser, inkludert bruk av celleforstyrrelser, fransk presse og / eller sonikering14,15,17eller (iii) tidkrevende gjentatt vaske- og inkubasjonstrinn15,16,17.
Dette dokumentet beskriver en modifisert protokoll som tar sikte på å adressere begrensningene i de tidligere tilnærmingene og tillater analyse av mengden proteinaggregater dannet i to forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med et protetoksisk antimikrobielt overflatebelegg. Belegget består av metall-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-betinget med askorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet oppnås ved generering av reaktive oksygenarter8,18. Herein er en detaljert beskrivelse av fremstillingen av bakteriekulturen etter behandling med den antimikrobielle forbindelsen og en sammenligning av proteinaggregeringsstatus ved eksponering av to E. coli-stammer med tydelige følsomhetsprofiler for å øke konsentrasjonen av antimikrobielle. Den beskrevne metoden er billig, rask og reproduserbar og kan brukes til å studere proteinaggregering i nærvær av andre protetoksiske forbindelser. I tillegg kan protokollen modifiseres for å analysere hvilken innvirkning spesifikke genslettinger har på proteinaggregering i en rekke forskjellige bakterier.
Denne protokollen beskriver en optimalisert metodikk for analyse av proteinaggregatdannelse etter behandling av forskjellige E. coli-stammer med en protetoksisk antimikrobiell. Protokollen tillater samtidig utvinning av uoppløselige og oppløselige proteinfraksjoner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for protein aggregert isolasjon fra cellene14,15,16,<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Illinois State University School of Biological Sciences oppstartsfond, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID-stipendet R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. ble støttet av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K. P. H. ble støttet av et RISE-stipend levert av den tyske akademiske utvekslingstjenesten (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for å ha levert AGXX-pulveret. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 ble generert med Biorender.
Chemicals/Reagents | |||
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
Material/Equipment | |||
Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |