Summary

Ekstraksjon og visualisering av proteinaggregater etter behandling av Escherichia coli med en protetoksisk stressor

Published: June 29, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra Escherichia coli etter behandling med en protetoksisk antimikrobiell. Etter denne prosedyren tillater en kvalitativ sammenligning av protein aggregert formasjon in vivo i ulike bakteriestammer og / eller mellom behandlinger.

Abstract

Eksponeringen av levende organismer for miljømessige og cellulære påkjenninger forårsaker ofte forstyrrelser i protein homeostase og kan resultere i proteinaggregering. Akkumuleringen av proteinaggregater i bakterieceller kan føre til betydelige endringer i cellulær fenotypisk oppførsel, inkludert en reduksjon i vekstrater, stressmotstand og virulens. Det finnes flere eksperimentelle prosedyrer for undersøkelse av disse stressormediert fenotyper. Dette dokumentet beskriver en optimalisert analyse for ekstraksjon og visualisering av aggregerte og oppløselige proteiner fra forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med en sølv-rutheniumholdig antimikrobiell. Denne forbindelsen er kjent for å generere reaktive oksygenarter og forårsaker utbredt proteinaggregering.

Metoden kombinerer en sentrifugeringsbasert separasjon av proteinaggregater og oppløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med påfølgende separasjon og visualisering ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie-farging. Denne tilnærmingen er enkel, rask og tillater en kvalitativ sammenligning av proteinaggregatdannelse i forskjellige E. coli-stammer. Metodikken har et bredt spekter av applikasjoner, inkludert muligheten til å undersøke virkningen av andre proteotoksiske antimikrobielle midler på in vivo proteinaggregering i et bredt spekter av bakterier. Videre kan protokollen brukes til å identifisere gener som bidrar til økt motstand mot proteotokse stoffer. Gelbånd kan brukes til etterfølgende identifisering av proteiner som er spesielt utsatt for aggregering.

Introduction

Bakterier er uunngåelig utsatt for et utall miljøspenninger, inkludert lav pH (f.eks. i pattedyrets mage)1,2, reaktive oksygen- og klorarter (ROS/RCS) (f.eks. under oksidativt utbrudd i fagocytter)3,4,5, forhøyede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmesjokk)6,7og flere potente antimikrobielle midler (f.eks. AGXX brukt i denne protokollen)8. Proteiner er spesielt sårbare for noen av disse stressorene, og eksponering kan provosere protein un-/misfolding som deretter frø aggregering. Alle organismer bruker beskyttende systemer som gjør at de kan takle proteinfeilfolding9. Imidlertid kan alvorlig stress overvelde proteinkvalitetskontrollmaskineriet og forstyrre den sekundære og / eller tertiære strukturen av proteiner, som til slutt inaktiverer proteiner. Som en konsekvens kan proteinaggregater sterkt svekke kritiske cellulære funksjoner som kreves for bakteriell vekst og overlevelse, stressmotstand og virulens10. Derfor er forskning med fokus på proteinaggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant tema på grunn av dens potensielle innvirkning på smittsom sykdomskontroll.

Varmeindusert protein utfolder seg og aggregering er ofte reversibel7. I motsetning kan andre protetoksiske påkjenninger, som oksidativt stress, forårsake irreversible proteinmodifikasjoner gjennom oksidasjon av spesifikke aminosyresidekjeder som resulterer i protein un-/misfolding og til slutt proteinaggregering4. Stressindusert dannelse av uoppløselige proteinaggregater har blitt grundig studert i sammenheng med molekylære anstander og deres beskyttende funksjoner i gjær og bakterier11,12,13. Flere protokoller har blitt publisert som bruker en rekke biokjemiske teknikker for isolering og analyse av uoppløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokollene har hovedsakelig blitt brukt til å studere bakteriell proteinaggregering ved varmesjokk og/eller identifisering av molekylære anstander. Selv om disse protokollene absolutt har vært et fremskritt for feltet, er det noen store ulemper i de eksperimentelle prosedyrene fordi de krever (i) et stort bakteriekulturvolum på opptil 10 L14,17, (ii) kompliserte fysiske forstyrrelsesprosesser, inkludert bruk av celleforstyrrelser, fransk presse og / eller sonikering14,15,17eller (iii) tidkrevende gjentatt vaske- og inkubasjonstrinn15,16,17.

Dette dokumentet beskriver en modifisert protokoll som tar sikte på å adressere begrensningene i de tidligere tilnærmingene og tillater analyse av mengden proteinaggregater dannet i to forskjellige Escherichia coli-stammer etter behandling med et protetoksisk antimikrobielt overflatebelegg. Belegget består av metall-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-betinget med askorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet oppnås ved generering av reaktive oksygenarter8,18. Herein er en detaljert beskrivelse av fremstillingen av bakteriekulturen etter behandling med den antimikrobielle forbindelsen og en sammenligning av proteinaggregeringsstatus ved eksponering av to E. coli-stammer med tydelige følsomhetsprofiler for å øke konsentrasjonen av antimikrobielle. Den beskrevne metoden er billig, rask og reproduserbar og kan brukes til å studere proteinaggregering i nærvær av andre protetoksiske forbindelser. I tillegg kan protokollen modifiseres for å analysere hvilken innvirkning spesifikke genslettinger har på proteinaggregering i en rekke forskjellige bakterier.

Protocol

1. Stressbehandling av E. coli stammer MG1655 og CFT073 Inokuler 5 ml lysogenybuljong (LB) medium med en enkelt koloni av commensal E. coli stamme MG1655 og uropathogenic E. coli (UPEC) stamme CFT073, og inkubere i 14-16 timer (over natten) ved henholdsvis 37 °C og 300 o/min.MERK: Escherichia coli CFT073 er et menneskelig patogen. Håndtering av CFT073 må utføres med passende biosikkerhetstiltak i et Biosafety Level-2-sertifisert laboratorium. Fortynn hver st…

Representative Results

Figur 6: Representative resultater av antimikrobiell indusert proteinaggregering i commensal Escherichia coli-stamme MG1655 og UPEC-stamme CFT073. E. coli stammer MG1655 og CFT073 ble dyrket ved 37 °C og 300 o/min til OD600= 0,5-0,55 i MOPS-g media før de ble behandlet med de angitte konsentrasjonene (-, 0 mg/ml; +, 175 mg/ml; +…

Discussion

Denne protokollen beskriver en optimalisert metodikk for analyse av proteinaggregatdannelse etter behandling av forskjellige E. coli-stammer med en protetoksisk antimikrobiell. Protokollen tillater samtidig utvinning av uoppløselige og oppløselige proteinfraksjoner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for protein aggregert isolasjon fra cellene14,15,16,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Illinois State University School of Biological Sciences oppstartsfond, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID-stipendet R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. ble støttet av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K. P. H. ble støttet av et RISE-stipend levert av den tyske akademiske utvekslingstjenesten (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for å ha levert AGXX-pulveret. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 ble generert med Biorender.

Materials

Chemicals/Reagents
Acetone Fisher Scientific 67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 Bio-Rad 1610156
Ammonium persulfate Millipore Sigma A3678-100G
Benzonase nuclease Sigma E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa GoldBio P008-500
β-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-100ML
Bromophenol blue GoldBio B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250 MP Biomedicals LLC 821616
D-Glucose Millipore Sigma G8270-1KG
D-Sucrose Acros Organics 57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich SLBT9686
Glacial Acetic acid Millipore Sigma ARK2183-1L
Glycerol, 99% Sigma-Aldrich G5516-1L
Glycine GoldBio G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol) Sigma 402893-2.5L
LB broth (Miller) Millipore Sigma L3522-1KG
LB broth with agar (Miller) Millipore Sigma L2897-1KG
Lysozyme GoldBio L-040-25
10x MOPS Buffer Teknova M2101
Nonidet P-40 Thomas Scientific 9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic Sigma-Aldrich P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic Acros Organics 7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Millipore Sigma T9281-50ML
Thiamine Sigma-Aldrich T4625-100G
100% Trichloroacetic acid Millipore Sigma T6399-100G
Tris base GoldBio T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL) Alkali Scientific JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL) Carolina 726686
Erlenmeyer flask (500 mL) Carolina 726694
Freezer: -80 °C Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm) BioSpec Products 1107-9105
Microcentrifuge Hermle Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL) VWR International 87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL) Axygen Maxiclear Microtubes MCT-200-C
Plastic cuvettes Fischer Scientific 14-377-012
Power supply ThermoFisher Scientific EC105
Rocker Alkali Scientific RS7235
Shaking incubator (37 °C) Benchmark Scientific
Small glass plate Bio-Rad 1653311
Spacer plates (1 mm) Bio-Rad 1653308
Spectrophotometer Thermoscientific 3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber Bio-Rad 1658004
Vortexer Fisher Vortex Genie 2 12-812
Thermomixer Benchmark Scientific H5000-HC
10 well comb Bio-Rad 1653359

References

  1. Dahl, J. -. U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
  2. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
  3. Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -. U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
  4. Dahl, J. -. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  5. Groitl, B., Dahl, J. -. U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
  6. Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
  7. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  8. Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
  9. Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
  10. Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
  11. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
  12. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  13. Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
  14. Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  15. Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
  16. Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
  17. Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
  18. Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
  19. Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
  20. Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
  21. Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
  22. Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
  23. Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
  24. Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
  25. Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).

Play Video

Cite This Article
Sultana, S., Anderson, G. M., Hoffmann, K. P., Dahl, J. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. Exp. (172), e62628, doi:10.3791/62628 (2021).

View Video