Summary
ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。
Abstract
行動する動物におけるニューロンおよびグリアの細胞生理機能を完全に理解するためには、それらの形態を視覚化し、行動するマウス における生体内で のそれらの活性を記録する必要がある。この論文では、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞の縦方向イメージングを可能にするために、慢性頭蓋窓を移植する方法について説明する。遺伝的戦略およびウイルス注射と組み合わせて、特定の細胞および関心のある領域を構造的または生理学的マーカーで標識することができる。このプロトコルは、頭蓋窓を通して両方の細胞を同時にイメージングするために、皮質内のGCaMP6発現アストロサイトの近傍のニューロンを標識するためにウイルス注射を組み合わせる方法を実証する。同じ細胞の多光子イメージングは、目を覚まし、行動する動物で数日、数週間、または数ヶ月間行うことができる。このアプローチは、研究者に細胞ダイナミクスをリアルタイムで表示するための方法を提供し、神経科学における多くの質問に答えるために適用することができます。
Introduction
マウスの皮質においてin vivo多光子蛍光顕微鏡検査を行う能力は、細胞シグナル伝達および構造1、2、3、4、5、6、7、8、9、疾患病理学10、11、および細胞発生12,13の研究にとって最も重要である。.慢性頭蓋窓の移植により、縦方向の画像化が可能であり、生きた動物において皮質領域の数日、数週間、または数ヶ月13,14の反復画像化を可能にする。多光子顕微鏡は、深度プロービングの改善と使用される赤外線レーザーに関連する光損傷の低減により、in vivo、反復イメージングに最適です。これにより、様々な皮質領域における特定の細胞の分子動態および細胞動態の研究が可能になる。
多光子顕微鏡は、マウス15、16、17、18、19、20におけるニューロンおよびグリア細胞のインビボイメージングに使用されている。特定の細胞型および関心のある領域を標識するために、様々な戦略を実施することができる。1つの一般的なアプローチは、Cre-Lox組換え系を用いて、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の発現を細胞特異的な方法で駆動することである。これは、遺伝子改変マウスを用いて、例えば、tdTomato「フロックス」マウス(Ai14)を、目的のプロモーター21の下でCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配させることで行うことができる。あるいは、細胞特異的および部位特異的標識は、ウイルス注射によって達成され得る。ここでは、細胞特異的プロモーター下のCreリコンビナーゼをコードするウイルスと、目的のフロックス化遺伝子をコードするウイルスとを、規定領域に注入する。両方のウイルスベクターを受け取る適切な細胞型は、所望の遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、tdTomatoなどの構造マーカーとして、細胞形態の変化22、またはGCaMPおよび/またはRCaMPなどの遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を表示してカルシウム動態を調べることができます23。遺伝子組換えの方法は、1つ以上の細胞型を標識するために個々にまたは組み合わせて適用することができる。第3のアプローチは、トランスジェニックマウスまたはウイルス構築物(パッケージング能力が限られている)を必要としない、DNA構築物24の子宮エレクトロポレーションである。エレクトロポレーションのタイミングに応じて、異なる細胞型を標的とすることができる25、26、27。
多光子イメージングを行う場合、マウスは、覚醒中または麻酔をかけながら画像化することができる。覚醒マウスの撮像は、取り付けられたヘッドプレート28を介してマウスを固定することにより行うことができる。このアプローチは、マウスが取り付けられたヘッドプレートによって固定され、開放チャンバ30内を移動させられる、自由浮遊、空気支持発泡スチロールボール29、自由浮遊トレッドミル1、または空中吊り下げ式ホームケージシステムなどの方法を用いて、動物の比較的自由な移動を可能にすることによって、ストレスを少なくする。これらの画像化条件のそれぞれについて、まずマウスを画像化セットアップに慣れさせる必要があるであろう。本稿では、空輸式ホームケージシステムを用いた馴化とイメージングの手順について述べる。
このプロトコールは、皮質における縦方向の in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植を記載する。ここでは、アストロサイトにおいてGCaMP6fを条件付きに発現するマウスを用いて、カルシウムシグナル伝達ダイナミクスをモニターする。さらに、本稿では、tdTomatoをニューロンの標識として用いたウイルス注射の手順について述べる。これにより、ニューロンシナプス構造の変化の決定および/または同じアストロサイトの反復イメージングを可能にする構造マーカーとしての利用可能性が可能になる。プロトコル全体を通して、多光子顕微鏡から得られた画像の可能な限り最高の品質を確保するために、重要なステップが強調されます。
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Protocol
すべての動物実験は、ネブラスカ大学医療センターでIACUCによって承認されたガイドラインに従って実施した。
1. 手術前
- ウイルス注射用のピペットを準備する。ピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張り、ピペットを20°の角度で面取りします。ピペットを一晩滅菌します。
- 滅菌ゲルフォームの新鮮な断片を小さな正方形に切断して準備する。ゲルフォームを0.5mLの生理食塩水を含む滅菌マイクロフュージチューブに沈める。使用前にゲルフォームを生理食塩水に少なくとも30分間浸します。
- スポンジストリップの新鮮な部分を薄いストリップに切断して準備します。
- 手術の20分前に、4〜6週齢のGLAST-CreER/GCaMP6fマウスに、脳の腫れを防ぐために0.2mg / kgのデキサメタゾンを腹腔内に注射し、炎症を軽減するために5mg / kgのカルプロフェンを注射する。
注:アストロサイトの約40%においてGCaMP6fの組換えおよび発現を誘導するために、GLAST-CreER/GCaMP6fマウスに100mg/kgタモキシフェンを3週間で5日間連続で注射した。
2. 手術開始
- 20分後、マウスを酸素を含む3%イソフルランで約1.5分間の流量で1L/min麻酔する。
- 麻酔をかけたら、マウスを水の再循環毛布の上に座らせて、手術を通して体温を37°Cに維持する定位フレームの上に置きます。鼻クランプとイヤーバーを使用してマウスをフレームに固定します。鼻クランプとイヤーバーが、処置中に頭部が動かないほど十分に安定しているが、頭蓋骨が損傷するほどきつくないことを確認してください。
- 1-2 L /分の流量で酸素を含む1-1.5%イソフルランで麻酔を維持します。一部の動物は鎮静を維持するために多かれ少なかれイソフルランを必要とするかもしれないことに注意してください。動物の呼吸とつま先と尾のピンチへの反射を監視し、イソフルランを適切に調整します。
- 綿の先端アプリケーターを使用して各目に眼軟膏を塗布し、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。
- げっ歯類のトリマーを使用して、首から目のすぐ後ろまで髪を剃ります。動物のひげが誤ってトリミングされないように注意してください。
- 1つのヨウ素調製パッドで剃った部分をきれいにし、続いて1つのアルコール調製パッドできれいにする。
- 滅菌組織鉗子および外科用ハサミを使用して、前頭縫合糸からブレグマまでの前頭縫合糸からラムダまで後方まで皮膚を切断して除去する。
- 皮膚が取り除かれたら、頭蓋骨の出血を最小限に抑えるために、約0.1mLの1%キシロカイン(リドカインとエピネフリン1:200,000)を頭蓋骨に加える。
- ハンドルに取り付けられた滅菌サイズ11炭素鋼手術用ブレードを用いて、結合組織を頭蓋骨から穏やかに掻き取る。頭蓋骨の端付近の結合組織を除去するときは、残っている組織が後でガラスやヘッドプレートの強い付着を妨げる可能性があるため、特に注意してください。
- 滅菌組織鉗子を使用して、頭蓋骨から緩い結合組織を除去します。
- 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、頭蓋骨から残りのキシロカインをきれいに除去します。
- 完了したら、アセトンに浸した滅菌綿先端アプリケーターを用いて頭蓋骨を徹底的に脱脂する。圧縮空気を使用して、頭蓋骨を直ちにブロードライします。
3. 開頭術
- ファインポイントマーカーと定規を使用して、目的の位置の開口部に適したサイズを測定します。開口部のサイズをカバーガラスのサイズ(直径3mmまたは5mm)と比較して確認します。開口部がカバーガラスのサイズよりわずかに小さいことを確認します。
- 歯科用ドリルを使用して、開口部の輪郭を徐々にトレースし、骨を薄くする。骨を貫通しないようにゆっくりとドリルし、同心円でドリルして骨の薄肉化を容易にします。
- 各同心円パスの後、ドリルした領域に滅菌生理食塩水を1滴または2滴加えます。生理食塩水を少なくとも10秒間放置して、骨が過熱して下にある硬膜を損傷するのを防ぎます。
- 滅菌綿チップアプリケーターを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。掘削を再開する前に、残りの生理食塩水がすべて蒸発したことを確認するために、その領域に圧縮空気を吹き付けます。残っている骨の破片を吹き飛ばすためにこれを行います。
- 骨が除去のために適切に薄くなるまで、手順3.2-3.4を繰り返します。
- 骨の中央部を細かい鉗子で優しく押して、薄くなった頭蓋骨が動くことを確認することで、骨が除去のために適切に薄くなっていることを確認してください。根底にある血管系は、掘削が発生した場所に見えるはずです。骨が薄肉化が発生した場所でひび割れるように見えることがあることを確認します。
注:この段階でのトレーニングは、骨が適切に間伐された時期を特定するために不可欠です。 - 骨を取り除こうとする前に、マウスをチェックして完全に鎮静されていることを確認してください。そうでない場合は、骨を除去するときに脳の腫れを防ぐためにイソフルランの維持を徐々に増加させます。
- 生理食塩水で飽和したゲルフォームの小片を薄くした頭蓋骨に加える。薄くなった頭蓋骨に生理食塩水を1〜2滴追加します。
注:薄くなった頭蓋骨の上にたっぷりの生理食塩水を置くと、骨のフラップを取り外すときに出血を減らし、硬膜を保護するのに役立ちます。 - ミニチュアの15°尖った刃を使用して、刃を細くした骨に慎重に挿入し、薄くなった骨に沿って切断します。ゲルフォームを生理食塩水に浸し、発生する可能性のある出血を止める準備をしてください。
- 鉗子を使用して、慎重に骨を持ち上げて取り除きます。根底にある組織や血管系への損傷を避けるために、できるだけ穏やかにしてください。硬膜を傷つけないように細心の注意を払ってください。
- 骨フラップが取り除かれたら、生理食塩水で飽和した新鮮なゲルフォームを皮質に加えます。ゲルフォームが乾燥するのを防ぐために数滴の生理食塩水を加えると、下層の組織に損傷を与えるので。
4. ウイルス注射
- 定位装置を用いてウイルス注射を行う。
- AAV1 を準備します。CaMKII.0.4.Cre(3×1013 ゲノムコピー(GC)/ mLの力価)を生理食塩水中の段階希釈により1:5,000で投与する。
- AAV1の混合物を調製する。CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) および AAV1.キャグ。FLEX.tdトマト(力価5×1012 GC / mL)をパラフィルムの小片に塗布する。
- チップサイズが 20 μm の滅菌面取りガラスピペットにウイルス混合物を充填するには、ピペットを溶液の上に静かに置きます。
- ピペットが脳の表面に触れるようにピペットを下げ、L2/3注射の場合はさらに200〜300μm下げ続けます。細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステム( 材料表を参照)を用いて、2分間にわたって12〜15回圧力注入する(20psi、9msパルス持続時間)。ピペットが詰まっていないことを確認するために、各注射でピペットドロップのメニスカスを観察します。
- 注射したら、逆流を防ぐためにピペットを脳内に4〜5分間放置します。ピペットをゆっくりと引っ込めます。
- 2〜3部位(約500μm間隔)で注射を繰り返す。
- Creウイルスの段階希釈に使用したガラスピペット、パラフィルム、ピペットチップ、マイクロフュージチューブを10%漂白剤に廃棄します。
5. 頭蓋窓の移植
- ゲルフォームを取り除き、スポンジストリップの小さなストリップを使用して、残りの生理食塩水を浸します。
- 抗生物質エンロフロキサシン(22.7μg/mL)を数滴開口部に加え、1分間そこに留まらせる。1分後、新鮮なスポンジストリップを使用して、残りのエンロフロキサシンを吸収します。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
- 3回目の洗浄後、開口部に数滴の生理食塩水を加え、1分間そこに留まらせます。1分後、新鮮なスポンジストリップを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。この洗浄プロセスをさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後、開口部に少量の生理食塩水を加える。
- カバーガラスを開口部の上に置きます。鉗子を使用して、ガラスが開口部の上に平らになっていることを確認し、高品質の画像を取得します。
- ガラスを所定の位置に静かに保持しながら、シアノアクリレート粘着ゲル(材料表)をガラスの周囲に塗布し、窓の端を頭蓋骨に密封する。接着剤がカバーガラスの下に染み込まないようにし、できるだけ多くの接着剤をカバーガラスの表面から遠ざけてください。
- 接着ゲルの上にスーパー接着剤の層を塗布する。接着剤の上に歯科用セメント液の層を追加して、硬化させます。
- 適切なサイズのヘリコプタータイプのヘッドプレートを取り、中央の開口部の周りに接着剤の薄い層を塗布します。ヘッドプレートをカバーガラスの上に置き、接着剤が短時間乾くのを待ちます。
- 1.5 mL マイクロフュージチューブで、チューブの 0.1 mL マークに歯科用セメント粉末を追加します。速硬化、瞬間接着剤を7〜8滴加え、混合する。19G針で1mLのシリンジに引き込み、より大きな開口部を作ります。
- ヘリコプターバーの側面の穴から混合物を注入し、両側から浸透させます。露出した頭蓋骨の残りの部分に歯科用セメント/接着剤混合物を塗布してヘッドプレートを頭蓋骨に固定すると、イメージング中の動きのアーチファクトが減少します。
- 混合物を少なくとも15分間風乾させる。
- マウスに0.5mLの生理食塩水を皮下に注射して、回復を補助する。
6. 事後操作
- マウスを定位フレームから取り外し、ケージに戻します。
- ケージの一部を水再循環ブランケットの上に置き、回復を支援するためにゲル加熱パッドまたは等温パッドを空ける。
- 回復をさらに助けるために、通常の食事に加えて、食物ペレットと湿った食物の小さな助けを動物に提供します。回復期間中、手術後に毎日新しい食物ペレットとウェットフードを加えてください。
- 手術の翌日、マウスに5mg / kgカルプロフェンおよび5mg / kgエンロフロキサシンを1回注射する。
- 2〜6日目に、マウスに5mg / kgカルプロフェンを1回、5mg / kgエンロフロキサシンを2回注射し、地元のIACUCによる承認を待ってください。エンロフロキサシン注射を少なくとも8時間で分離する。
- 7〜20日目に、マウスに毎日5mg / kgのカルプロフェンを注射する。
7. イメージングのための動物の馴化
- 手術後14日目に、頭蓋窓の光学的明瞭さを調べます。窓が不明瞭または損傷している(すなわち、過剰な血管新生)マウスを使用しないでください。
- 蛍光顕微鏡下でtdトマトの発現を確認します。標識された細胞が同定できる場合は、動物の馴化を進めてください。
- 慣れ初日(ハンドリング)
- マウスを数分間保持し、取り扱い後にケージに戻します。セッション間に 15 分間隔で処理を 3 回繰り返します。
- 3回目の試行の後、動物を小さな布で包んでマウスに慣れさせる。
- マウスを布で包んだ状態で約1分間保持します。
- 試行後、マウスをケージに戻します。このプロセスをさらに2回繰り返し、各試行間に15分の間隔を空けます。
- 慣れの2日目
- マウスの重量を量り、記録します。
- マウスを布で包み、ヘッドプレートを介して空輸されたホームケージの頭部固定アームに固定します。
- 家のケージを光にさらしたままにしておきます。
- マウスをモバイルホームケージに15分間固定します。
- 慣れた後、マウスを家のケージから取り出し、空気の流れを止めます。
- マウスの重量を量り、ケージに戻します。体重の10%以上を失わないマウスのみを含めるように注意してください。慣れ親しんだ日に体重の10%以上を失うマウスを画像実験から除外する。
- 慣れの3日目とその先
- マウスの体重を計量して記録してから、空中に持ち上げたホームケージに固定します。
- マウスを空輸されたホームケージに固定します。
- 箱などの暗いインテリアを提供するもので家のケージを覆い、マウスを30分間固定したままにします。
- 30分後、ホームケージを取り外し、マウスを取り外し、空気の流れをオフにします。
- 慣れた後のマウスの体重を計量して記録します。
- このプロセスを毎日繰り返し、マウスがホームケージに固定される時間を15分延長する。マウスをホームケージに1.5時間固定できるまでこのプロセスを続けます(これは2光子イメージングセッションのおおよその期間です)。
- マウスをノイズに慣れさせるには、顕微鏡でいくつかの慣れセッションを実行して、マウスをレーザースキャニングミラーの音に順応させます。十分に慣れていないマウス(すなわち、発声およびストレス誘発排便)を除外する。
8. 多光子イメージング
- 手術後3週間でイメージングを開始し、窓をきれいにします。
- Ti:サファイアレーザーを搭載したカスタムメイドまたは市販の多光子顕微鏡でイメージングを実行します。高開口数(NA)水浸漬対物レンズを使用して画像を取得します。
メモ: 2 チャンネルイメージングは、565 nm ダイクロイックミラーと 2 本の外部光電子増倍管を使用して実現されます。GCaMP6f 発光の検出には 535/50 バンドパスフィルタを使用し、tdTomatoの検出には 610/75 バンドパスフィルタを使用します。25倍の水浸漬対物レンズ(1.05 NA)と共振スキャナを使用して、 図1 と 図2に示す画像を取得しました。関心のある各領域は、軸方向に1μmずつ分離された画像のスタックで構成されていた。各光学セクションは、512 x 512ピクセル、0.18 μm/ピクセルで収集されました。画像は、定位座標によって決定されるように一次運動皮質の前肢領域から取得された。 - レーザーの波長を 920 nm (赤方偏移 GECI を使用する場合は 990 nm) に設定します。
- マウスをモバイルホームケージの上に置き、ヘッドプレートを頭部固定アームにクランプします。
- 窓の中央に数滴の水を加えます。
- 顕微鏡の広視野モードを使用して、容易に識別可能な血管系の2〜3つの位置を選択する。これらの血管の画像を保存し、モーターコントローラに表示されるX座標とY座標を記録して、tdTomatoラベルの樹状突起を再配置して、その後のイメージングセッションに使用します。毎回X座標とY座標を調整して、保存した血管の画像と再調整します。
- 血管系を画像化し、位置を記録したら、tdTomatoを発現するニューロンを持つ領域を見つけます(図1)。ニューロンのシナプス構造(樹状突起および軸索)およびアストロサイトにおけるGCaMP6f活性を画像化する。
注:樹状突起は、同じ領域に確実に戻り、同じ樹状突起および星状細胞を繰り返し数日間にわたって画像化するためのランドマークとして機能します。安定した頭部固定および馴化後の頭部固定では、撮像面における検出可能なシフトは観察されなかった。X 方向と Y 方向に発生する変位は、モーション補正されます。 - イメージング後、マウスをケージに戻します。
注: マウスは通常、スコープ内に最大 2 時間保持されます。撮影が長時間続くと、対物レンズの下の水が乾くことがあります。実験中に水を加える必要があります。あるいは、水の代わりに超音波ゲルを使用することができる。
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Representative Results
頭蓋窓の質は、ニューロン構造がどれほど鮮明に見えるかによって評価することができる。良い窓には、樹枝状の棘がはっきりと見えます(図1)。構造データと位置データを保存すると、同じ動物を数日、数週間、または数か月にわたって繰り返し画像化して、同じ細胞を調べることができます(図1)。 図1 の画像は、一次運動皮質の前肢領域(5mmの窓内)から得られた。構造シナプス可塑性を研究するために、樹状突起スパインおよび軸索ブートンの密度およびダイナミクスを含む様々なパラメータを測定することができる。アストロサイト活性は、カルシウムシグナル伝達の時空間ダイナミクスを解析することで研究することができる(図2)。顕微鏡の能力(すなわち、共振スキャナ、対物レンズを制御するピエゾモータ)および実験上の問題に応じて、タイムラプスイメージングを単一焦点面または体積または多領域で実行して、所望の取得周波数でカルシウム活性を監視することができる。
図1:樹状突起とアストロサイトのイメージングを数日間にわたって繰り返した。 tdTomato(マゼンタ)を発現するデンドライトは、GCaMP6f発現アストロサイト(白色)を近接して同定し、繰り返しイメージングすることを可能にする。アストロサイト内のCa2+ 活性は、異なる日の異なる時点で示される。シナプス構造可塑性は同時に画像化することができる。2日目に現れた2つの新しい棘は矢印でマークされています。片方の脊椎は持続し、5日目に見えたが(青い矢印)、もう1つの脊椎は消失した(緑色の矢印)。スケール バー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アストロサイトーシスカルシウムシグナル伝達のイメージング。 GCaMP6fを発現するアストロサイトからのCa2+ 活性を示す画像。パネルは、集録中の異なる時点で4μmの体積から記録されたCa2+ 活性を示す。プロセスおよびマイクロドメインにおけるカルシウムシグナル伝達は、休止期間中に観察され得る。細胞全体を含むグローバルな事象は、188秒での移動発作中に観察することができる。スケール バー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、空中持ち上げられたホームケージ上の覚醒した頭部拘束マウスにおける皮質アストロサイトおよびニューロンの in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルを提示した。GECIsおよびニューロンシナプス構造を発現するアストロサイトを画像化するための頭蓋窓アプリケーションの具体例が提供されている。多光子顕微鏡法を用いることで、アストロサイトカルシウムシグナル伝達ダイナミクスと構造シナプスダイナミクスを数日間にわたって繰り返し記録することができます。
慢性頭蓋窓は、良好な光学画像品質を提供し、同じニューロンおよびグリア構造に対して複数の画像化セッションを実行することを可能にする。このアプローチはまた、開頭術をカバーガラスで覆う前に頭蓋内ウイルス注射を行うことを可能にする。
ユーザーは、慢性頭蓋窓の移植によって生じる多くの制限に注意する必要があります。高品質の窓を達成し、動物の生存を確保するためには、経験と多くの練習が必要です。さらに、手術は侵襲的であり、炎症反応をもたらし得る。手術中および手術後の回復中の薬理学的処置には、抗炎症薬および抗生物質31が含まれる。抗炎症薬の使用は、これらの薬物が研究中の現象にも影響を与える可能性があるため、神経炎症のモデルを調査する研究では適切ではないかもしれません。
より最近では、髄膜リンパ管新生は、頭蓋窓移植32に応答して起こることが示されている。したがって、慢性頭蓋窓は髄膜リンパ管を調査する研究には受け入れられない可能性がある。重要なことに、画像化実験31、33の前に、術後2〜3週間の待機期間が必要である。さらに、マウスの年齢、および手術後の回復時間は、非常に初期の発達事象を画像化する能力を制限する。頭蓋窓は若いマウス(P15-21)34に移植することができるが、炎症などの可能性のある副作用を考慮する必要がある。
慢性頭蓋窓の代替として、薄くなった頭蓋骨の準備も行われ得る。この方法は、画像化前に関心領域にわたって頭蓋骨を間引きする結果となる。薄くなった頭蓋骨の窓は侵襲性が低く、抗炎症薬投与の必要性を克服し、神経炎症および神経免疫相互作用のモデルを調査する研究において選択となる。しかしながら、反復的な撮像が望まれる場合、頭蓋骨は撮像前に再間引きされる必要があり、骨は画質が劣化する前に限られた回数しか再間引くことができない35。
再薄化を必要としない強化薄頭蓋骨法の修正版36が記載されているが、不均一な頭蓋骨厚さは球面収差を引き起こし、蛍光構造37の歪みをもたらし得る。したがって、樹状突起スパインなどの構造の同定とは対照的に、カルシウムシグナル伝達ダイナミクス38またはシナプスタンパク質27のレベルなどの定量的測定が記録されている場合、慢性頭蓋窓は、より光学的に安定で信頼性の高い調製を提供する。したがって、縦方向のインビボ画像化のために、頭蓋窓の挿入は、薬物治療39、行動パラダイム4、25における訓練、および神経学的障害11、27におけるシナプスリモデリングの結果としての変化を調べるための優れた方法である。
説明した手順は技術的に困難であり、高品質の画像取得の障壁となります。窓に感染がなく、根底にある組織への損傷が避けられるように、各ステップで細心の注意を払わなければなりません。これには、頭蓋骨上の結合組織の穏やかな掻き取り、穿孔時に骨を冷却するための適切な休憩をとること、骨の除去を容易にするための均一な菲薄化の確保、脳の腫脹の防止、および手術中に硬膜を損傷しないように細心の注意が含まれる。最適なウィンドウの準備のみが、より長いイメージングの間、光学的に透明なままです。
シナプス構造の変化は、麻酔をかけられたマウスにおいて数日間にわたって画像化することができるが、麻酔がインビボでアストロサイトカルシウムシグナル伝達を破壊することが示されているので、これはアストロサイトカルシウムシグナル伝達を調べる場合には好ましくない40。覚醒状態でインビボイメージングを行うためには、頭部拘束マウス、移動式ホームケージ、自由浮遊トレッドミル、空中浮遊発泡スチロールボール、または他の装置における画像化条件に動物を馴化させることが不可欠である。適切な慣れは、イメージング中のストレスを軽減するだけでなく、イメージングセッション中の動きのアーチファクトを最小限に抑えるようにも機能します。
要約すると、慢性頭蓋窓を介したin vivo多光子顕微鏡は、皮質内の細胞の構造的および機能的変化を研究するための有用なツールである。細胞特異的蛍光色素およびレポーターを用いて、細胞の形態、相互作用、および活性を研究することができる。慢性頭蓋窓によって可能になる縦方向イメージングにより、シナプス構造が時間の経過とともにどのように変化し、発達するかを調べることが可能である13,14。ここに提示されたプロトコルを用いて、感覚刺激23、38、移動もしくは驚愕6、41、疾患15、42、または関心のある他のパラメータに起因するアストロサイトにおけるカルシウムシグナル伝達ダイナミクスを調べることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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