Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.
Abstract
Para entender completamente a fisiologia celular dos neurônios e da glia no comportamento dos animais, é necessário visualizar sua morfologia e registrar sua atividade in vivo no comportamento de camundongos. Este artigo descreve um método para a implantação de uma janela craniana crônica para permitir a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. Em combinação com estratégias genéticas e injeções virais, é possível rotular células específicas e regiões de interesse com marcadores estruturais ou fisiológicos. Este protocolo demonstra como combinar injeções virais para rotular neurônios nas proximidades de astrócitos que expressam GCaMP6 no córtex para imagens simultâneas de ambas as células através de uma janela craniana. Imagens multifoton das mesmas células podem ser realizadas por dias, semanas ou meses acordados, comportando animais. Essa abordagem fornece aos pesquisadores um método para visualizar a dinâmica celular em tempo real e pode ser aplicada para responder a uma série de perguntas em neurociência.
Introduction
A capacidade de realizar microscopia de fluorescência in vivo multifotônio no córtex dos camundongos é primordial para o estudo da sinalização celular e estrutura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, patologia da doença 10,11, e desenvolvimento celular12,13 . Com a implantação de janelas cranianas crônicas, é possível imagens longitudinais, permitindo imagens repetidas de áreas corticais por dias, semanas ou meses13,14 em animais vivos. A microscopia multifotônio é ideal para imagens in vivo, repetidas devido à melhor sondagem de profundidade e fotodamagem reduzida associada ao laser infravermelho utilizado. Isso permite o estudo da dinâmica molecular e celular de células específicas em várias regiões corticais.
A microscopia multifotal tem sido utilizada para imagens in vivo de células neuronais e gliais em camundongos 15,16,17,18,19,20. Várias estratégias podem ser implementadas para rotular determinados tipos de células e áreas de interesse. Uma abordagem comum é conduzir a expressão de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas de forma específica das células usando o sistema de recombinação Cre-Lox. Isso pode ser realizado com camundongos geneticamente modificados, por exemplo, cruzando o tdTomato "floxed" mouse (Ai14) com um mouse expressando Cre-recombinase sob um promotor de interesse21. Alternativamente, a rotulagem específica de células e locais pode ser alcançada com injeções virais. Aqui, um vírus codificando Cre recombinase sob um promotor específico de células e um vírus codificando um gene de interesse floxed são injetados em uma região definida. Os tipos de células apropriados que recebem ambos os vetores virais expressarão os gene(s" desejados. Esses genes podem ser marcadores estruturais, como o tdTomato, para ver mudanças na morfologia celular22 ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como GCaMP e/ou RCaMP, para examinar a dinâmica do cálcio23. Métodos de recombinação genética podem ser aplicados individualmente ou em combinação para rotular um ou mais tipos de células. Uma terceira abordagem, não exigindo camundongos transgênicos ou construtos virais (que têm capacidade limitada de embalagem), está na eletroporação uterótera de construçõesde DNA 24. Dependendo do tempo da eletroporação, diferentes tipos de células podem ser direcionados 25,26,27.
Ao realizar imagens multifoton, os ratos podem ser visualizados enquanto estão acordados ou anestesiados. A imagem de ratos acordados pode ser realizada prendendo o mouse através de uma placa de cabeçaanexada 28. Essa abordagem torna-se menos estressante ao permitir a circulação relativamente livre do animal usando métodos, como bolas de isopor de flutuação livre, apoiadas pelo ar29, esteiras flutuantes1 ou um sistema de gaiola doméstica com ar levantado por ar onde os ratos são presos por uma placa de cabeça anexada e autorizados a se mover em uma câmara aberta30. Para cada uma dessas condições de imagem, primeiro será necessário habituar os ratos à configuração de imagem. Este artigo descreve o procedimento de habitação e imagem usando um sistema de gaiola doméstica com ar.
Este protocolo descreve a implantação de uma janela craniana crônica para imagens longitudinais in vivo no córtex. Aqui, usaremos camundongos que expressam condicionalmente GCaMP6f em astrócitos para monitorar a dinâmica de sinalização de cálcio. Além disso, este artigo descreve o procedimento para injeções virais usando tdTomato como um rótulo para neurônios. Isso permite a determinação de mudanças na estrutura sináptica neuronal e/ou a disponibilidade como marcador estrutural que permite imagens repetidas do mesmo astrócito. Ao longo do protocolo, serão destacadas etapas cruciais para garantir a melhor qualidade possível das imagens obtidas a partir da microscopia multifoton.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo IACUC no Centro Médico da Universidade de Nebraska.
1. Antes da cirurgia
- Prepare pipetas para injeções virais. Puxe capilares de vidro borossilicato usando um puxador de pipeta e coloque a pipeta em um ângulo de 20°. Esterilize as pipetas durante a noite.
- Prepare peças frescas de espuma de gel estéril cortando-as em pequenos quadrados. Submergir a espuma de gel em um tubo microfuge estéril contendo 0,5 mL de soro fisiológico. Mergulhe a espuma de gel em soro fisiológico por pelo menos 30 minutos antes de usar.
- Prepare pedaços frescos de tiras de esponja cortando-as em tiras finas.
- Vinte minutos antes da cirurgia, injete camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f de 4-6 semanas de idade intraperitoneal com 0,2 mg/kg dexametasona para evitar inchaço cerebral e 5 mg/kg de carprofeno para reduzir a inflamação.
NOTA: Para induzir a recombinação e expressão do GCaMP6f em aproximadamente 40% dos astrócitos, os camundongos GLAST-CreER/GCaMP6f foram injetados com 100 mg/kg de tamoxifeno a 3 semanas por 5 dias consecutivos.
2. Início da cirurgia
- Após 20 min, anestesia os camundongos com 3% de isoflurano com oxigênio a uma vazão de 1 L/min por aproximadamente 1,5 min.
- Uma vez anestesiado, coloque o mouse em uma estrutura estereotaxa que se senta em uma manta de recirculação de água para manter uma temperatura corporal de 37 °C durante toda a cirurgia. Fixar o mouse na armação usando o grampo de focinho e as barras de ouvido. Certifique-se de que o grampo de focinho e as barras de ouvido estão estáveis o suficiente para que a cabeça não se mova durante o procedimento, mas não tão apertado que o crânio esteja danificado.
- Mantenha a anestesia com isoflurane de 1-1,5% com oxigênio a uma vazão de 1-2 L/min. Note que alguns animais podem precisar de mais ou menos isoflurane para manter a sedação. Monitore a respiração do animal, bem como seus reflexos para as pinças dos dedo do dedo do poço e da cauda, e ajuste o isoflurane adequadamente.
- Aplique pomada ocular em cada olho usando um aplicador de ponta de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento.
- Usando aparadores de roedores, raspe o cabelo do pescoço para passar pelos olhos. Tenha cuidado para garantir que os bigodes do animal não sejam acidentalmente aparados.
- Limpe a área raspada com uma almofada de preparação de iodo, seguida por uma almofada de preparação para álcool.
- Usando fórceps de tecido estéril e tesoura cirúrgica, corte e remova a pele das suturas frontais anteriores à bregma até posteriormente a lambda.
- Uma vez que a pele é removida, adicione aproximadamente 0,1 mL de 1% de xilocaine (lidocaína com epinefrina 1:200.000) ao crânio para minimizar o sangramento do crânio.
- Usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono de tamanho 11 estéril presa a uma alça, raspe suavemente o tecido conjuntivo do crânio. Tome cuidado extra ao remover o tecido conjuntivo perto da borda do crânio, pois qualquer tecido restante poderia evitar uma forte aderência do vidro ou placa da cabeça mais tarde.
- Use fórceps de tecido estéril para remover tecido conjuntivo solto do crânio.
- Usando aplicadores de ponta de algodão estéreis, limpe qualquer xilocaine restante do crânio.
- Uma vez concluído, desengreça completamente o crânio usando um aplicador de ponta de algodão estéril mergulhado em acetona. Use ar comprimido para secar imediatamente o crânio.
3. Craniotomia
- Usando um marcador de ponto fino e uma régua, meça o tamanho apropriado para a abertura no local desejado. Confirme o tamanho da abertura comparando-a com o tamanho do vidro de cobertura (3 ou 5 mm de diâmetro); certifique-se de que a abertura é ligeiramente menor do que o tamanho do vidro de cobertura.
- Usando uma broca dentária, rastreie gradualmente o contorno da abertura, afinando o osso. Perfurar lentamente para evitar perfurar o osso, e perfurar em círculos concêntricos para facilitar o afinamento do osso.
- Após cada passe concêntrico, adicione uma gota ou duas de soro fisiológico estéril à área perfurada. Deixe que o soro fisiológico se sente por pelo menos 10 s para evitar que o osso superaqueça e danifique a duração subjacente.
- Use um aplicador de ponta de algodão estéril para absorver qualquer solução salina restante. Soprar ar comprimido sobre a área para garantir que todos os salinos restantes evaporaram antes de retomar a perfuração. Faça isso para explodir detritos ósseos que permanecem.
- Repita as etapas 3.2-3.4 até que o osso esteja adequadamente afinado para remoção.
- Certifique-se de que o osso está adequadamente diluído para remoção, empurrando suavemente a área central do osso com fórceps finos para verificar se o crânio diluído se move. A vasculatura subjacente deve ser visível onde a perfuração ocorreu. Observe que o osso pode aparecer como se rachasse onde ocorreu o afinamento.
NOTA: O treinamento nesta fase é crucial para identificar quando o osso foi diluído adequadamente. - Antes de tentar remover o osso, verifique o mouse para ter certeza de que ele está completamente sedado. Caso não, aumente gradualmente a manutenção isoflurane para evitar o inchaço cerebral ao remover o osso.
- Adicione um pequeno pedaço de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao crânio diluído. Adicione uma ou duas gotas adicionais de soro fisiológico ao crânio diluído.
NOTA: Ter bastante soro fisiológico sobre o crânio diluído ajuda a reduzir o sangramento e proteger a dura dura ao remover a aba óssea. - Usando uma lâmina pontiaguda de 15° em miniatura, insira cuidadosamente a lâmina no osso diluído e corte ao longo do osso fino. Mantenha a espuma de gel encharcada em soro fisiológico, pronta para parar qualquer sangramento que possa ocorrer.
- Usando fórceps, levante cuidadosamente e remova o osso. Seja o mais gentil possível para evitar danos ao tecido subjacente e vasculatura. Tome muito cuidado para não danificar a dura-mãe.
- Uma vez que a aba óssea é removida, adicione um pedaço fresco de espuma de gel saturado em soro fisiológico ao córtex. Adicione algumas gotas de soro fisiológico para evitar que a espuma de gel seque, pois isso causará danos ao tecido subjacente.
4. Injeções virais
- Realize injeções virais usando um aparelho estereotaxico.
- Prepare AAV1. CaMKII.0.4.Cre (título de 3 × 1013 cópias de genoma (GC)/mL) em 1:5.000 por diluições seriais em soro fisiológico.
- Prepare a mistura de AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) e AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (título de 5 × 1012 GC/mL) em um pequeno pedaço de parafilm.
- Encha uma pipeta de vidro estéril com um tamanho de ponta de 20 μm com a mistura do vírus, colocando suavemente a pipeta na solução.
- Abaixe a pipeta de modo que ela apenas toque a superfície do cérebro e continue a baixar por mais 200-300 μm para injeções L2/3. Utilizando um sistema de dispensa de microinjeção intracelular (ver a Tabela de Materiais), injeção de pressão 12-15 vezes ao longo de 2 min (20 psi, 9 ms de duração do pulso). Observe o menisco na queda da pipeta com cada injeção para garantir que a pipeta não esteja bloqueada.
- Uma vez injetado, deixe a pipeta no cérebro por 4-5 minutos para evitar o fluxo de volta. Retraia lentamente a pipeta.
- Repita as injeções em 2-3 locais (aproximadamente 500 μm de distância).
- Descarte as pipetas de vidro usadas, parafilm, pontas de pipeta e tubos de microfuge usados para diluições seriais do vírus Cre em 10% de alvejante.
5. Implantação de janela craniana
- Remova qualquer espuma de gel e use uma pequena tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante.
- Adicione algumas gotas do antibiótico enrofloxacina (22,7 μg/mL) à abertura e deixe que ele permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer enrofloxacina restante. Repita este processo mais duas vezes.
- Após a terceira lavagem, adicione algumas gotas de soro fisiológico à abertura e deixe que ela permaneça lá por 1 min. Depois de 1 min, use um pedaço fresco de tira de esponja para absorver qualquer solução salina restante. Repita este processo de lavagem mais duas vezes e após a terceira lavagem, adicione uma pequena gota de soro fisiológico à abertura.
- Coloque o vidro da tampa sobre a abertura. Use fórceps para garantir que o vidro esteja alinhado sobre a abertura para obter imagens de boa qualidade.
- Enquanto segura suavemente o vidro no lugar, aplique gel adesivo de cianoacrilato (Tabela de Materiais) ao redor do perímetro do vidro para selar as bordas da janela ao crânio. Certifique-se de não deixar a cola escoar sob o vidro de cobertura, e manter o máximo de cola fora da superfície do vidro de cobertura possível.
- Aplique uma camada de super cola sobre o gel adesivo. Adicione uma camada de líquido de cimento dental sobre a cola para permitir que ela endureça.
- Pegue uma placa de cabeça do tipo helicóptero de tamanho apropriado e aplique uma fina camada de cola ao redor da abertura central. Coloque a placa da cabeça sobre o vidro de cobertura e deixe a cola secar brevemente.
- Em um tubo de microfuça de 1,5 mL, adicione o pó de cimento dental à marca de 0,1 mL no tubo. Adicione 7-8 gotas de cura rápida, adesivo instantâneo e misture. Desenhe em uma seringa de 1 mL com uma agulha de 19 G que foi cortada para criar uma abertura maior.
- Injete a mistura através dos orifícios laterais da barra de helicóptero até que ela escoe de ambos os lados. Aplique a mistura de cimento/adesivo dentário ao resto do crânio exposto para fixar a placa de cabeça no crânio, o que reduzirá os artefatos de movimento durante a imagem.
- Deixe a mistura secar ao ar por pelo menos 15 minutos.
- Injete 0,5 mL de soro fisiológico subcutâneamente para ajudar na recuperação.
6. Pós-operação
- Remova o mouse do quadro estereotaxic e devolva-o à gaiola.
- Coloque uma parte da gaiola em uma manta de re-circulação de água, almofadas de aquecimento de gel espacial ou almofadas isotermais para ajudar na recuperação.
- Fornecer ao animal uma pequena dose de pelotas de alimentos e alimentos molhados, além de sua dieta regular, para ajudar ainda mais na recuperação. Adicione novas pelotas de alimentos e alimentos molhados todos os dias após a cirurgia durante a recuperação.
- No dia seguinte à cirurgia, injete camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e 5 mg/kg enrofloxacina.
- Nos dias 2-6, injete os camundongos uma vez com 5 mg/kg de carprofeno e duas vezes com 5 mg/kg enrofloxacina, aguardando aprovação do IACUC local. Separe as injeções de enrofloxacina por pelo menos 8 h.
- Nos dias 7 a 20, injete os ratos diariamente com 5 mg/kg de carprofeno.
7. Habituação animal para imagem
- No dia 14, após a cirurgia, examine a janela craniana para obter clareza óptica. Não use camundongos com janelas não claras ou danificadas (ou seja, angiogênese excessiva).
- Verifique se há expressão tdTomato sob um microscópio de fluorescência. Se as células rotuladas puderem ser identificadas, proceda com a habituação animal.
- Primeiro dia de habituação (manuseio)
- Segure o mouse por alguns minutos e devolva-o à sua gaiola após o manuseio. Repita o manuseio três vezes com um intervalo de 15 minutos entre as sessões.
- Após o terceiro ensaio, habite o rato embrulhando o animal em um pequeno pedaço de pano.
- Segure o mouse enrolado em pano por aproximadamente 1 min.
- Após o julgamento, devolva o rato para sua gaiola. Repita este processo mais duas vezes, permitindo um intervalo de 15 minutos entre cada ensaio.
- Segundo dia de habituação
- Pese e grave o peso do rato.
- Enrole o rato em pano e fixe-o através de sua placa de cabeça para o braço de fixação da cabeça da gaiola doméstica levantada a ar.
- Deixe a gaiola em casa exposta à luz.
- Deixe o mouse permanecer preso na gaiola doméstica móvel por 15 minutos.
- Após a habituação, remova o mouse da gaiola doméstica e desligue o fluxo de ar.
- Pese o rato e devolva-o para sua gaiola. Tome cuidado para incluir apenas camundongos que não perdem mais de 10% de seu peso corporal. Exclua camundongos que perdem mais de 10% de seu peso durante qualquer dia de habituação de experimentos de imagem.
- Terceiro dia de habituação e além
- Pese e grave o peso do rato antes de segurá-lo à gaiola de ar.
- Segure o mouse na gaiola de casa levantada pelo ar.
- Cubra a gaiola doméstica com algo que forneça um interior escuro, como uma caixa, e deixe que o mouse permaneça seguro por 30 minutos.
- Depois de 30 minutos, descubra a gaiola, remova o mouse e desligue o fluxo de ar.
- Pese e grave o peso do mouse após a habitação.
- Repita este processo todos os dias, aumentando a duração do mouse é fixado na gaiola doméstica em 15 minutos. Continue este processo até que o mouse possa ser fixado na gaiola doméstica por 1,5 h, pois esta é a duração aproximada de uma sessão de imagem de dois fótons.
- Para habituar o mouse ao ruído, realize algumas sessões de habitação no microscópio para aclimatar o mouse ao som dos espelhos de varredura a laser. Exclua camundongos que não habituam o suficiente (ou seja, vocalizações e defecação induzida pelo estresse).
8. Imagem multifoton
- Comece a imagem 3 semanas após a cirurgia para permitir que a janela se limpe.
- Realize imagens em um microscópio multifoton personalizado ou comercialmente disponível equipado com um laser Ti:Sapphire. Adquira imagens usando um objetivo de imersão de água de alta abertura numérica (NA).
NOTA: A imagem de dois canais é obtida usando um espelhodicróico de 565 nm e dois tubos fotomultiplier externos. Um filtro de bandpass 535/50 é usado para detectar emissão de GCaMP6f, e um filtro de bandpass 610/75 é usado para detectar tdTomato. Um objetivo de imersão em água de 25x (1,05 NA) e scanners ressonantes foram utilizados para adquirir imagens mostradas na Figura 1 e Figura 2. Cada região de interesse consistia em uma pilha de imagens separadas axially por 1 μm. Cada seção óptica foi coletada em 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. As imagens foram adquiridas da região do primeiro membro do córtex motor primário, conforme determinado pelas coordenadas estereotributicas. - Defina o comprimento de onda do laser para 920 nm (990 nm se um GECI de mudança vermelha for usado).
- Coloque o mouse na gaiola doméstica móvel e aperte a placa da cabeça no braço de fixação da cabeça.
- Adicione algumas gotas de água ao centro da janela.
- Usando o modo de campo largo do microscópio, selecione 2-3 posições de vasculatura facilmente identificável. Salve as imagens desses vasos sanguíneos e registe as coordenadas X e Y que aparecem no controlador do motor para realocar os dendritos rotulados por TdTomato para sessões de imagem subsequentes. Ajuste as coordenadas X e Y cada vez para realinhar com as imagens salvas dos vasos sanguíneos.
- Uma vez que a vasculatura tenha sido imageda e as posições registradas, localize as regiões com neurônios expressando tdTomato (Figura 1). Imagem as estruturas sinápticas (dendritos e axônios) de neurônios e atividade GCaMP6f em astrócitos.
NOTA: Os dendritos servirão como marcos para retornar de forma confiável às mesmas regiões e imagem dos mesmos dendritos e astrócitos ao longo de dias repetidos. Não foi observada mudança detectável no plano de imagem com fixação estável da cabeça e após a fixação da cabeça. O deslocamento que ocorre nas direções X e Y é corrigido por movimento. - Após a imagem, devolva o rato para sua gaiola.
NOTA: Os ratos são normalmente mantidos no escopo por um máximo de 2 h. Quando a imagem dura muito tempo, a água sob o objetivo pode secar. A água deve ser adicionada durante os experimentos. Alternativamente, um gel ultrassônico pode ser usado em vez de água.
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Representative Results
A qualidade da janela craniana pode ser avaliada pelo quão nítidas as estruturas neuronais aparecem. Em uma boa janela, espinhos dendráticos são claramente visíveis (Figura 1). Com os dados estruturais e posicionais armazenados, o mesmo animal pode ser imageado repetidamente por dias, semanas ou meses para examinar as mesmas células (Figura 1). As imagens na Figura 1 foram obtidas da região do primeiro quarto do córtex motor primário (em uma janela de 5 mm). Uma variedade de parâmetros pode ser medida, incluindo densidade e dinâmica de espinhos dendráticos e boutons axonais para estudar plasticidade sináptica estrutural. A atividade astrócito pode ser estudada analisando a dinâmica espostetemporal da sinalização de cálcio (Figura 2). Dependendo das capacidades do microscópio (ou seja, scanners ressonantes, motor piezo controlando o objetivo) e a questão experimental, a imagem de lapso de tempo pode ser realizada em um único plano focal ou em um volume ou multi-região para monitorar a atividade de cálcio na frequência de aquisição desejada.
Figura 1: Imagens repetidas de dendritos e astrócitos ao longo dos dias. Um dendrite expressando tdTomato (magenta) permite a identificação e imagens repetidas de astrócitos expressos GCaMP6f (branco) nas proximidades. A atividade ca2+ dentro dos astrócitos é mostrada em diferentes momentos em dias diferentes. A plasticidade estrutural sináptica pode ser simultaneamente imagens. Duas novas espinhas que apareceram no dia 2 estão marcadas com flechas. Enquanto uma coluna persistiu e era visível no dia 5 (seta azul), a outra coluna foi eliminada (arqueiro verde). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de sinalização de cálcio astrócito. Imagens mostrando atividade ca2+ de um astrócito expressando GCaMP6f. Os painéis mostram atividade Ca2+ registrada a partir de um volume de 4 μm em diferentes pontos de tempo durante a aquisição. A sinalização de cálcio nos processos e microdomínios pode ser observada durante os períodos de descanso. Um evento global que abrange toda a célula pode ser observado durante uma luta de locomoção aos 188 anos. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo para a implantação de janelas cranianas crônicas para imagens in vivo de astrócitos cortical e neurônios em ratos acordados e com cabeça em uma gaiola doméstica levantada pelo ar. Exemplos específicos foram fornecidos da aplicação da janela craniana para astrócitos de imagem que expressam GECIs e estruturas sinápticas neuronais. Com o uso de microscopia multifotítica, a dinâmica de sinalização de cálcio astrócito e a dinâmica sináptica estrutural podem ser registradas repetidamente ao longo dos dias.
Uma janela craniana crônica fornece boa qualidade de imagem óptica e permite que múltiplas sessões de imagem sejam realizadas das mesmas estruturas neuronais e gliais. A abordagem também permite realizar injeções virais intracranianas antes de cobrir a craniotomia com um copo de tampa.
Os usuários devem estar cientes de uma série de limitações incorridas através da implantação de janelas cranianas crônicas. Experiência e muita prática são necessárias para alcançar uma janela de alta qualidade e garantir a sobrevivência dos animais. Além disso, a cirurgia é invasiva e pode resultar em uma resposta inflamatória. O tratamento farmacológico durante a cirurgia e a recuperação pós-cirúrgica inclui anti-inflamatórios e antibióticos31. O uso de anti-inflamatórios pode não ser apropriado em estudos que investigam modelos de neuroinflamação, pois essas drogas também podem afetar o fenômeno em estudo.
Mais recentemente, a lymphangiogênese meningeal tem se mostrado em resposta à implantação da janela craniana32. Assim, a janela craniana crônica pode não ser, portanto, aceitável para estudos que investigam vasos linfáticos meningeais. É importante ressaltar que um período de espera de 2-3 semanas após a cirurgia é necessário antes dos experimentos de imagem31,33. Além disso, a idade dos camundongos, bem como o tempo de recuperação pós-operação, limita a capacidade de imagem de eventos de desenvolvimento muito precoces. Enquanto janelas cranianas podem ser implantadas em camundongos mais jovens (P15-21)34, possíveis efeitos colaterais, como inflamação, precisam ser considerados.
Como alternativa à janela craniana crônica, preparações finas do crânio também podem ser feitas. Este método resulta no afinamento do crânio sobre a região de interesse antes da imagem. Uma janela de crânio diluída é menos invasiva e supera a necessidade de administração de medicamentos anti-inflamatórios, tornando-se uma escolha em estudos que investigam modelos de neuroinflamação e interações neuroimunes. No entanto, se for desejada uma imagem repetida, o crânio precisa ser diluído antes da imagem, e o osso só pode ser diluído um número limitado de vezes antes que a qualidade da imagem se degrade35.
Embora uma versão modificada de um método reforçado de crânio fino que não exija retocimento tenha sido descrita36, uma espessura não uniforme do crânio pode causar aberrações esféricas, resultando na distorção das estruturas fluorescentes37. Assim, quando estão sendo registradas medidas quantitativas, como a dinâmica de sinalização de cálcio38 ou níveis de proteínas sinápticas27, em oposição à identificação de estruturas como colunas dendríticas, a janela craniana crônica proporciona uma preparação mais estável e confiável. Assim, para a imagem longitudinal, in vivo, a inserção de janelas cranianas é o método superior para examinar mudanças em decorrência do tratamento medicamentoso39, treinamento em paradigma comportamental 4,25 e remodelação sináptica em distúrbios neurológicos11,27.
O procedimento descrito é tecnicamente desafiador e fornece uma barreira para a aquisição de imagem de qualidade. Deve-se tomar cuidado extremo em cada passo para garantir que a janela permaneça livre de infecção, e que os danos ao tecido subjacente sejam evitados. Isso inclui a raspagem suave do tecido conjuntivo no crânio, fazer pausas adequadas para resfriar o osso durante a perfuração, garantir o afinamento uniforme para facilitar a remoção óssea, evitar o inchaço cerebral e cuidados extremos para não danificar a dura-seca durante a cirurgia. Apenas os melhores preparos da janela permanecem opticamente transparentes por períodos mais longos de imagem.
Embora mudanças nas estruturas sinápticas possam ser imagens em camundongos anestesiados ao longo dos dias, isso não é preferido ao examinar a sinalização de cálcio astrócito, pois a anestesia tem sido demonstrada para interromper a sinalização de cálcio astrócito in vivo40. Para realizar imagens in vivo em ratos acordados e com a cabeça, é essencial habituar o animal às condições de imagem na gaiola móvel, esteira flutuante livre, bola de isopor levantada a ar ou outro aparelho. A habituação adequada não só reduzirá o estresse durante a imagem, mas também agirá para minimizar artefatos de movimento durante as sessões de imagem.
Em resumo, a microscopia multifoton in vivo através de uma janela craniana crônica é uma ferramenta útil para estudar mudanças estruturais e funcionais das células no córtex. Usando corantes fluorescentes específicos para células e repórteres, é possível estudar morfologia celular, interações e atividade. Com a imagem longitudinal permitida por janelas cranianas crônicas, é possível examinar como as estruturas sinápticas mudam e se desenvolvem ao longo do tempo13,14. Utilizando o protocolo aqui apresentado, é possível examinar a dinâmica de sinalização de cálcio em astrócitos devido à estimulação sensorial23,38, locomoção ou início 6,41, doença 15,42 ou outros parâmetros de interesse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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