Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

Published: June 22, 2021 doi: 10.3791/62633
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

Abstract

כדי להבין באופן מלא את הפיזיולוגיה התאית של נוירונים וגליה בבעלי חיים מתנהגים, יש צורך לדמיין את המורפולוגיה שלהם ולתעד את פעילותם in vivo בעכברים מתנהגים. מאמר זה מתאר שיטה להשתלת חלון גולגולת כרוני כדי לאפשר הדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש. בשילוב עם אסטרטגיות גנטיות וזריקות ויראליות, ניתן לסמן תאים ואזורי עניין ספציפיים עם סמנים מבניים או פיזיולוגיים. פרוטוקול זה מדגים כיצד לשלב זריקות נגיפיות כדי לתייג נוירונים בקרבת אסטרוציטים המבטאים GCaMP6 בקליפת המוח להדמיה סימולטנית של שני התאים דרך חלון גולגולת. הדמיה מרובת-פוטון של אותם תאים יכולה להתבצע במשך ימים, שבועות או חודשים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. גישה זו מספקת לחוקרים שיטה לצפייה בדינמיקה התאית בזמן אמת וניתן ליישם אותה כדי לענות על מספר שאלות במדעי המוח.

Introduction

היכולת לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מרובת-פוטונים in vivo בקליפת המוח של עכברים היא בעלת חשיבות עליונה לחקר האיתות והמבנה התאי 1,2,3,4,5,6,7,8,9, פתולוגיה של מחלות 10,11 והתפתחות תאית12,13 . עם השתלת חלונות גולגולתיים כרוניים, הדמיה אורכית אפשרית, המאפשרת הדמיה חוזרת ונשנית של אזורים בקליפת המוח במשך ימים, שבועות או חודשים13,14 בבעלי חיים. מיקרוסקופיית מולטיפוטונים אידיאלית להדמיה חוזרת ונשנית של in vivo בגלל בדיקת עומק משופרת ופוטו-דאמג' מופחת הקשור ללייזר האינפרא אדום שבו נעשה שימוש. זה מאפשר מחקר של דינמיקה מולקולרית ותאית של תאים ספציפיים באזורים שונים בקליפת המוח.

מיקרוסקופיית מולטיפוטונים שימשה להדמיית in vivo של תאי עצב וגלייה בעכברים 15,16,17,18,19,20. ניתן ליישם אסטרטגיות שונות כדי לתייג סוגי תאים ותחומי עניין מסוימים. גישה נפוצה אחת היא להניע את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים המקודדים גנטית באופן ספציפי לתא באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre-Lox. זה יכול להתבצע עם עכברים מהונדסים גנטית, למשל, חציית עכבר tdTomato "floxed" (Ai14) עם עכבר המבטא Cre-recombinase תחת מקדם של עניין21. לחלופין, ניתן להשיג תיוג ספציפי לתא ולאתר באמצעות זריקות ויראליות. כאן, וירוס המקודד Cre רקומבינאז תחת מקדם ספציפי לתא ונגיף המקודד גן מעניין של floxed מוזרקים לאזור מוגדר. סוגי תאים מתאימים המקבלים את שני הווקטורים הנגיפיים יבטאו את הגנים הרצויים. גנים אלה יכולים להיות סמנים מבניים, כגון tdTomato, כדי לראות שינויים במורפולוגיה התאית22 או באינדיקטורים לסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP ו/או RCaMP, כדי לבחון את הדינמיקה של סידן23. שיטות של רקומבינציה גנטית ניתן ליישם בנפרד או בשילוב כדי לתייג סוג אחד או יותר של תאים. גישה שלישית, שאינה דורשת עכברים מהונדסים או מבנים נגיפיים (שיש להם קיבולת אריזה מוגבלת), היא אלקטרופורציה של רחם של מבני דנ"א24. בהתאם לתזמון האלקטרופורציה, ניתן לכוון לסוגי תאים שונים 25,26,27.

בעת ביצוע הדמיית מולטיפוטונים, ניתן לצלם עכברים כשהם ערים או מרדימים. הדמיה של עכברים ערים יכולה להתבצע על ידי אבטחת העכבר באמצעות לוחית ראש מחוברת28. גישה זו הופכת לפחות מלחיצה בכך שהיא מאפשרת תנועה חופשית יחסית של החיה באמצעות שיטות, כגון כדורי קלקר29 צפים חופשיים ונתמכים באוויר, הליכונים צפים חופשיים1, או מערכת כלובים ביתית מורמת אוויר שבה העכברים מהודקים על ידי לוחית ראש מחוברת ומותר להם לנוע בתא פתוח30. עבור כל אחד מתנאי ההדמיה הללו, יהיה צורך תחילה להרגיל את העכברים למערך ההדמיה. מאמר זה מתאר את הליך ההרגלה וההדמיה באמצעות מערכת כלוב ביתית מורמת אוויר.

פרוטוקול זה מתאר השתלה של חלון גולגולתי כרוני להדמיית in vivo אורכית בקליפת המוח. כאן, נשתמש בעכברים המבטאים באופן מותנה GCaMP6f באסטרוציטים כדי לנטר את הדינמיקה של איתות סידן. יתר על כן, מאמר זה מתאר את ההליך עבור זריקות ויראליות באמצעות tdTomato כתווית עבור נוירונים. זה מאפשר לקבוע את השינויים במבנה הסינפטי העצבי ו /או את הזמינות כסמן מבני המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו אסטרוציט. לאורך הפרוטוקול, יודגשו צעדים חיוניים כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של תמונות המתקבלות ממיקרוסקופיית מולטי-פוטון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי IACUC במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

1. לפני הניתוח

  1. הכינו פיפטות לזריקות ויראליות. משכו נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ושפשפו את הפיפטה בזווית של 20 מעלות. לעקר את הפיפטות למשך הלילה.
  2. מכינים חתיכות טריות של קצף ג'ל סטרילי על ידי חיתוך אותם לריבועים קטנים. הטביעו את קצף הג'ל בצינור מיקרופוג' סטרילי המכיל 0.5 מ"ל של מי מלח. משרים את קצף הג'ל במי מלח לפחות 30 דקות לפני השימוש.
  3. מכינים חתיכות טריות של רצועות ספוג על ידי חיתוך אותן לרצועות דקות.
  4. עשרים דקות לפני הניתוח, הזריקו עכברי GLAST-CreER/GCaMP6f בני 4-6 שבועות באופן תוך-צפקי עם 0.2 מ"ג/ק"ג דקסמתזון למניעת נפיחות במוח ו-5 מ"ג/ק"ג קרפרופן להפחתת דלקת.
    הערה: כדי לגרום לרקומבינציה ולביטוי של GCaMP6f בכ-40% מהאסטרוציטים, עכברי GLAST-CreER/GCaMP6f הוזרקו להם 100 מ"ג/ק"ג טמוקסיפן במשך 3 שבועות במשך 5 ימים רצופים.

2. תחילת הניתוח

  1. לאחר 20 דקות, מרדימים את העכברים עם 3% איזופלורן עם חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה למשך כ-1.5 דקות.
  2. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר על מסגרת סטריאוטקסית שיושבת על שמיכת מים המסתובבת מחדש כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניתוח. הצמידו את העכבר למסגרת באמצעות מהדק החוטם ומוטות האוזניים. ודא כי מהדק החוטם ופסי האוזניים יציבים מספיק כדי שהראש לא יזוז במהלך ההליך, אך לא כל כך הדוק שהגולגולת פגומה.
  3. יש לשמור על הרדמה עם 1-1.5% איזופלורן עם חמצן בקצב זרימה של 1-2 ליטר לדקה. שים לב שבעלי חיים מסוימים עשויים להזדקק לאיזופלורן פחות או יותר כדי לשמור על הרגעה. עקוב אחר נשימת החיה כמו גם הרפלקסים שלה לצביטות הבוהן והזנב, והתאים את האיזופלורן כראוי.
  4. יש למרוח משחה לעיניים על כל עין באמצעות אפליקטור קצה כותנה כדי למנוע מהעיניים להתייבש במהלך ההליך.
  5. באמצעות גוזמי מכרסמים, לגלח את השיער מהצוואר ועד ממש מעבר לעיניים. יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שהשפמים של החיה לא ייגזמו בטעות.
  6. נקו את האזור המגולח עם כרית הכנה אחת ליוד, ואחריה כרית הכנה אחת לאלכוהול.
  7. באמצעות מלקחיים של רקמה סטרילית ומספריים כירורגיים, חותכים ומסירים את העור מהתפרים הקדמיים לברגמא כל הדרך האחורית למבדה.
  8. לאחר הסרת העור, יש להוסיף כ-0.1 מ"ל של 1% קסילוקיין (לידוקאין עם אפינפרין 1:200,000) לגולגולת כדי למזער את הדימום של הגולגולת.
  9. באמצעות להב כירורגי סטרילי פלדת פחמן בגודל 11 המחובר לידית, מגרדים בעדינות את רקמת החיבור מהגולגולת. יש לנקוט משנה זהירות בעת הסרת רקמת החיבור בסמוך לקצה הגולגולת, שכן כל רקמה שנותרה יכולה למנוע הידבקות חזקה של לוחית הזכוכית או הראש בהמשך.
  10. השתמש בכוחי רקמה סטרילית כדי להסיר רקמת חיבור רופפת מהגולגולת.
  11. באמצעות אפליקטורים בעלי קצה כותנה סטרילי, נקו את כל הקסילוקאין שנותר מהגולגולת.
  12. לאחר השלמתו, יש לנטרל ביסודיות את הגולגולת באמצעות אפליקטור קצה כותנה סטרילי הטבול באצטון. השתמש באוויר דחוס כדי לייבש מיד את הגולגולת.

3. קרניוטומיה

  1. באמצעות סמן נקודה עדינה וסרגל, מדוד את הגודל המתאים לפתח במיקום הרצוי. אשר את גודל הפתח על ידי השוואתו לגודל זכוכית הכיסוי (קוטר 3 או 5 מ"מ); ודא שהפתח מעט קטן יותר מגודל זכוכית הכיסוי.
  2. באמצעות מקדחה דנטלית, בהדרגה לעקוב אחר קווי המתאר של הפתח, דילול העצם. קודחים לאט כדי למנוע קידוחים דרך העצם, ומקדחים במעגלים קונצנטריים כדי להקל על דילול אפילו של העצם.
  3. לאחר כל מעבר קונצנטרי, הוסיפו טיפה או שתיים של מלח סטרילי לאזור שנקדח. אפשרו למלח לשבת לפחות 10 שניות כדי למנוע מהעצם להתחמם יתר על המידה ולפגוע בדורה הבסיסית.
  4. השתמשו באפליקטור קצה כותנה סטרילי כדי לספוג את כל המלחים שנותרו. פוצצו אוויר דחוס מעל האזור כדי להבטיח שכל המלחים שנותרו התאדו לפני חידוש הקידוחים. עשו זאת כדי לפוצץ את פסולת העצמות שנותרה.
  5. יש לחזור על שלבים 3.2-3.4 עד שהעצם מדוללת כראוי להסרה.
  6. יש לוודא כי העצם מדוללת כראוי להסרה על ידי דחיפה עדינה על האזור המרכזי של העצם עם מלקחיים עדינים כדי לבדוק כי הגולגולת הדלילה נעה. כלי הדם הבסיסיים צריכים להיות גלויים למקום שבו התרחש הקידוח. שימו לב שהעצם עשויה להיראות כאילו היא תיסדק במקום שבו חל דילול.
    הערה: אימון בשלב זה הוא חיוני כדי לזהות מתי העצם דוללה כראוי.
  7. לפני שתנסה להסיר את העצם, בדוק את העכבר כדי לוודא שהוא מסומם לחלוטין. אם לא, להגדיל בהדרגה את תחזוקת האיזופלורן כדי למנוע נפיחות במוח בעת הסרת העצם.
  8. מוסיפים חתיכה קטנה של קצף ג'ל רוויה במי מלח לגולגולת הדלילה. מוסיפים עוד טיפה אחת או שתיים של מלח לגולגולת הדלילה.
    הערה: הרבה מלח על הגולגולת הדלילה עוזר להפחית את הדימום ולהגן על הדורה בעת הסרת דש העצם.
  9. באמצעות להב מחודד מיניאטורי של 15°, החדירו בזהירות את הלהב לעצם הדלילה וחתכו לאורך העצם הדלילה. שמור על קצף הג'ל ספוג במי מלח, מוכן לעצור כל דימום שעלול להתרחש.
  10. באמצעות מלקחיים, בזהירות להרים ולהסיר את העצם. היו עדינים ככל האפשר כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית ובמערכת כלי הדם. היזהרו מאוד שלא לפגוע בדורה מאטר.
  11. לאחר הסרת דש העצם, הוסיפו קליפת המוח חתיכה טרייה של קצף ג'ל רוויה במי מלח. הוסיפו כמה טיפות של מלח כדי למנוע מקצף הג'ל להתייבש, שכן הדבר יגרום נזק לרקמה שמתחת.

4. זריקות ויראליות

  1. בצע זריקות ויראליות באמצעות מנגנון סטריאוטקסי.
    1. הכן את AAV1. CaMKII.0.4.Cre (טיטר של 3 × 1013 עותקי גנום (GC)/mL) בשעה 1:5,000 על ידי דילולים סדרתיים במי מלח.
    2. הכן את התערובת של AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) ו-AAV1. קג. FLEX.tdTomato (טיטר של 5 × 1012 GC/mL) על חתיכת פרפילם קטנה.
    3. ממלאים פיפטת זכוכית משופעת סטרילית בגודל קצה של 20 מיקרומטר עם תערובת הנגיף על ידי הנחת הפיפטה בעדינות על התמיסה.
    4. הורידו את הפיפטה כך שהיא פשוט תיגע במשטח המוח ותמשיכו להוריד למשך 200-300 מיקרומטר נוספים עבור זריקות L2/3. באמצעות מערכת מיקרו-איניג'קציה תוך-תאית (ראו טבלת החומרים), הזרקת לחץ 12-15 פעמים במשך 2 דקות (20 psi, משך דופק של 9 אלפיות השנייה). שימו לב למניסקוס בטיפת הפיפטה עם כל זריקה כדי להבטיח שהפיפטה לא תיחסם.
    5. לאחר הזרקתם, השאירו את הפיפטה במוח למשך 4-5 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת. לאט לאט נסוגו מהפיפטה.
    6. חזרו על ההזרקות ב-2-3 אתרים (במרחק של כ-500 מיקרומטר זה מזה).
    7. השליכו את פיפטות הזכוכית המשומשות, הפרפילם, קצות הפיפטה וצינורות המיקרופוג' המשמשים לדילול סדרתי של נגיף ה-Cre ל-10% אקונומיקה.

5. השתלת חלון הגולגולת

  1. מוציאים כל קצף ג'ל, ומשתמשים ברצועה קטנה של רצועות ספוג כדי לספוג את כל המלחים שנותרו.
  2. הוסיפו כמה טיפות של האנטיביוטיקה אנרופלוקסצין (22.7 מיקרוגרם/מ"ל) לפתח ואפשרו לו להישאר שם במשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה טרייה של רצועת ספוג כדי לספוג כל אנרופלוקסצין שנותר. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות.
  3. לאחר הכביסה השלישית, מוסיפים כמה טיפות של מלח לפתח ומאפשרים לו להישאר שם במשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה טרייה של רצועת ספוג כדי לספוג את כל המלח שנותרו. חזרו על תהליך ההדחה הזה פעמיים נוספות ולאחר הכביסה השלישית, הוסיפו טיפה קטנה של מלח לפתח.
  4. מניחים את זכוכית הכיסוי מעל הפתח. השתמש במלקחיים כדי להבטיח שהזכוכית תשטוף מעל הפתח כדי לקבל תמונות באיכות טובה.
  5. תוך כדי החזקה עדינה של הזכוכית במקומה, יש למרוח ג'ל דבק ציאנואקרילט (טבלת חומרים) סביב היקף הזכוכית כדי לאטום את שולי החלון אל הגולגולת. הקפידו לא לתת לדבק לחלחל מתחת לזכוכית הכיסוי, והרחיקו כמה שיותר דבק מפני השטח של זכוכית הכיסוי.
  6. יש למרוח שכבה של דבק-על על ג'ל ההדבקה. הוסיפו שכבה של נוזל צמנט דנטלי מעל הדבק כדי לאפשר לו להתקשות.
  7. קחו לוחית ראש בגודל מתאים מסוג מסוק והניחו שכבה דקה של דבק סביב הפתח המרכזי. מניחים את צלחת הראש מעל זכוכית הכיסוי, ומאפשרים לדבק להתייבש לזמן קצר.
  8. בצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל, הוסיפו אבקת צמנט דנטלית לסימן 0.1 מ"ל על הצינור. הוסיפו 7-8 טיפות של ריפוי מהיר, דבק מיידי וערבבו. ציירו למזרק של 1 מ"ל עם מחט של 19 גרם שנחתכה כדי ליצור פתח גדול יותר.
  9. הזריקו את התערובת דרך החורים הצדדיים של מוט המסוק עד שהיא מחלחלת משני הצדדים. יש למרוח את תערובת המלט/דבק הדנטלי על שאר הגולגולת החשופה כדי להדק את לוחית הראש לגולגולת, מה שיפחית את תוצרי התנועה במהלך ההדמיה.
  10. תנו לתערובת להתייבש באוויר למשך 15 דקות לפחות.
  11. הזריקו לעכבר 0.5 מ"ל של מלח תת עורי כדי לסייע בהתאוששות.

6. לאחר הפעולה

  1. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזיר אותו לכלוב שלו.
  2. מניחים חלק מהכלוב על שמיכה המסתובבת מחדש במים, רפידות חימום ג'ל חלל או רפידות איזותרמיות כדי לסייע בהתאוששות.
  3. לספק לבעל החיים עזרה קטנה של כדורי מזון ומזון רטוב, בנוסף לתזונה הרגילה שלהם, כדי לסייע עוד יותר בהתאוששות. הוסיפו כדורית מזון חדשה ומזון רטוב בכל יום לאחר הניתוח למשך ההחלמה.
  4. יום לאחר הניתוח, הזריקו לעכברים פעם אחת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן ו-5 מ"ג/ק"ג אנרופלוקסצין.
  5. בימים 2-6, הזריקו לעכברים פעם אחת קרפרופן במינון 5 מ"ג/ק"ג ופעמיים עם 5 מ"ג/ק"ג אנרופלקסצין, בהמתנה לאישור ה-IACUC המקומי. הפרד את זריקות האנרופלוקסצין ב-8 שעות לפחות.
  6. בימים 7-20, להזריק לעכברים מדי יום 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן.

7. הרגלת בעלי חיים להדמיה

  1. ביום ה-14 לאחר הניתוח, בדקו את חלון הגולגולת לבהירות אופטית. אין להשתמש בעכברים עם חלונות לא ברורים או פגומים בדרך אחרת (כלומר, אנגיוגנזה מוגזמת).
  2. בדוק אם יש ביטוי tdTomato תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם ניתן לזהות תאים מסומנים, המשך בהרגלת בעלי חיים.
  3. היום הראשון להרגלה (טיפול)
    1. החזיקו את העכבר לכמה דקות והחזירו אותו לכלוב שלו לאחר הטיפול. חזור על הטיפול שלוש פעמים עם מרווח של 15 דקות בין ההפעלות.
    2. לאחר הניסוי השלישי, הרגילו את העכבר על ידי עטיפת החיה בפיסת בד קטנה.
    3. החזק את העכבר עטוף בבד למשך כדקה אחת.
    4. לאחר המשפט, החזירו את העכבר לכלוב שלו. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות, מה שמאפשר מרווח של 15 דקות בין כל ניסוי.
  4. היום השני של ההרגלה
    1. שקלו ותעדו את משקל העכבר.
    2. עטפו את העכבר בבד, והצמידו אותו דרך צלחת הראש שלו לזרוע קיבוע הראש של הכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
    3. השאירו את הכלוב הביתי חשוף לאור.
    4. אפשרו לעכבר להישאר מאובטח בכלוב הבית הנייד למשך 15 דקות.
    5. לאחר ההרגלה, מוציאים את העכבר מהכלוב הביתי וכובים את זרימת האוויר.
    6. שקלו את העכבר והחזירו אותו לכלוב שלו. הקפידו לכלול רק עכברים שאינם מאבדים יותר מ-10% ממשקל גופם. אל תכלול עכברים שמאבדים יותר מ-10% ממשקלם במהלך כל יום של התרגלות מניסויי הדמיה.
  5. היום השלישי להרגלה ומעבר לכך
    1. שקלו ותעדו את משקל העכבר לפני שאתם מאבטחים אותו לכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
    2. הצמידו את העכבר לכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
    3. כסו את הכלוב הביתי במשהו שיספק פנים כהה, כגון קופסה, ויאפשרו לעכבר להישאר מאובטח במשך 30 דקות.
    4. לאחר 30 דקות, חשפו את הכלוב הביתי, הסירו את העכבר וכבו את זרימת האוויר.
    5. שקלו ותעדו את משקל העכבר לאחר ההרגלה.
    6. חזור על תהליך זה מדי יום, והגדיל את משך הזמן שהעכבר מאובטח לכלוב הביתי ב -15 דקות. המשך בתהליך זה עד שניתן יהיה לאבטח את העכבר לכלוב הביתי למשך 1.5 שעות מכיוון שזהו משך הזמן המשוער של סשן הדמיה של שני פוטונים.
    7. כדי להרגיל את העכבר לרעש, בצע כמה הפעלות הרגלה במיקרוסקופ כדי לאקלם את העכבר לקולות מראות סריקת הלייזר. לא לכלול עכברים שאינם מצליחים להתרגל מספיק (כלומר, קולות ועשיית צרכים הנגרמת על ידי לחץ).

8. הדמיית מולטיפוטונים

  1. התחילו את ההדמיה 3 שבועות לאחר הניתוח כדי לאפשר לחלון להתבהר.
  2. בצע הדמיה במיקרוסקופ מולטי-פוטון מותאם אישית או זמין מסחרית המצויד בלייזר Ti:Sapphire. השג תמונות באמצעות מטרת טבילת מים עם מפתח צמצם מספרי גבוה (NA).
    הערה: הדמיה דו-ערוצית מושגת באמצעות מראה דיכרונית של 565 ננומטר ושני צינורות פוטומולטיפליירים חיצוניים. מסנן פס פס 535/50 משמש לזיהוי פליטת GCaMP6f, ומסנן פס פס 610/75 משמש לזיהוי tdTomato. מטרת טבילת מים פי 25 (1.05 NA) וסורקי תהודה שימשו כדי להשיג תמונות המוצגות באיור 1 ובאיור 2. כל אזור עניין כלל ערימה של תמונות המופרדות באופן אקסיאלי ב-1 מיקרומטר. כל מקטע אופטי נאסף ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים, 0.18 מיקרומטר/פיקסל. התמונות נרכשו מהאזור הקדמי של קליפת המוח המוטורית הראשונית כפי שנקבע על ידי קואורדינטות סטריאוטקסיות.
  3. הגדר את אורך הגל של הלייזר ל- 920 ננומטר (990 ננומטר אם נעשה שימוש ב- GECI בעל תזוזה אדומה).
  4. הניחו את העכבר על כלוב הבית הנייד, והידקו את לוחית הראש לזרוע קיבוע הראש.
  5. הוסיפו כמה טיפות מים למרכז החלון.
  6. באמצעות מצב השדה הרחב של המיקרוסקופ, בחר 2-3 מיקומים של כלי דם הניתנים לזיהוי בקלות. שמור את התמונות של כלי דם אלה ותעד את הקואורדינטות X ו- Y המופיעות בבקר המנוע כדי להעביר את הדנדריטים המסומנים ב- tdTomato למפגשי הדמיה מאוחרים יותר. התאם את הקואורדינטות X ו- Y בכל פעם כדי להתאים מחדש עם התמונות השמורות של כלי הדם.
  7. לאחר שצולם כלי הדם ותועדו מיקומים, אתרו את האזורים באמצעות תאי עצב המבטאים tdTomato (איור 1). דמיינו את המבנים הסינפטיים (דנדריטים ואקסונים) של נוירונים ואת פעילות GCaMP6f באסטרוציטים.
    הערה: הדנדריטים ישמשו כציוני דרך כדי לחזור באופן אמין לאותם אזורים ולדמות את אותם דנדריטים ואסטרוציטים במשך ימים חוזרים ונשנים. לא נצפתה תזוזה ניתנת לזיהוי במישור ההדמיה עם קיבוע ראש יציב ולאחר התרגלות לקיבוע הראש. תזוזה המתרחשת בכיווני X ו- Y מתוקנת בתנועה.
  8. לאחר ההדמיה, החזירו את העכבר לכלוב שלו.
    הערה: עכברים נשמרים בדרך כלל בטווח של 2 שעות לכל היותר. כאשר ההדמיה נמשכת זמן רב, המים שמתחת למטרה עלולים להתייבש. יש להוסיף מים במהלך הניסויים. לחלופין, ניתן להשתמש בג'ל קולי במקום במים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להעריך את איכות חלון הגולגולת על ידי עד כמה חדים המבנים העצביים. בחלון טוב, קוצים דנדריטיים נראים בבירור (איור 1). עם הנתונים המבניים והמיקום המאוחסנים, ניתן לצלם את אותה חיה שוב ושוב במשך ימים, שבועות או חודשים כדי לבחון את אותם תאים (איור 1). התמונות באיור 1 התקבלו מהאזור הקדמי של קליפת המוח המוטורית הראשונית (בחלון של 5 מ"מ). ניתן למדוד מגוון פרמטרים, כולל צפיפות ודינמיקה של עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים כדי לחקור פלסטיות סינפטית מבנית. ניתן לחקור פעילות אסטרוציטית על ידי ניתוח הדינמיקה הספטיוטמפוראלית של איתות סידן (איור 2). בהתאם ליכולות המיקרוסקופ (כלומר, סורקי תהודה, מנוע פייזו השולט במטרה) והשאלה הניסיונית, הדמיה בהילוך מהיר יכולה להתבצע במישור מוקד יחיד או בנפח או בריבוי אזורים כדי לעקוב אחר פעילות הסידן בתדר הרכישה הרצוי.

Figure 1
איור 1: הדמיה חוזרת ונשנית של דנדריטים ואסטרוציטים לאורך ימים. דנדריט המבטא tdTomato (מגנטה) מאפשר זיהוי והדמיה חוזרת ונשנית של אסטרוציטים המבטאים GCaMP6f (לבן) בסמיכות. פעילות Ca2+ בתוך אסטרוציטים מוצגת בנקודות זמן שונות בימים שונים. ניתן לדמות פלסטיות מבנית סינפטית במקביל. שני קוצים חדשים שהופיעו ביום 2 מסומנים בחצים. בעוד שעמוד שדרה אחד נמשך ונראה ביום 5 (חץ כחול), עמוד השדרה השני חוסל (חץ ירוק). סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של איתות סידן אסטרוציטי. תמונות המציגות פעילות Ca2+ מתוך אסטרוציט המבטא GCaMP6f. הפאנלים מציגים פעילות Ca2+ שנרשמה מנפח של 4 מיקרומטר בנקודות זמן שונות במהלך הרכישה. ניתן להבחין באיתות סידן בתהליכים ובמיקרו-דומיינים בתקופות המנוחה. ניתן לצפות באירוע גלובלי המקיף את התא כולו במהלך התקף תנועה ב-188 שניות. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, הצגנו פרוטוקול להשתלה של חלונות גולגולתיים כרוניים להדמיית in vivo של אסטרוציטים בקליפת המוח ותאי עצב בעכברים ערים ומרוסנים על הראש על כלוב ביתי מורם באוויר. דוגמאות ספציפיות סופקו ליישום חלון הגולגולת להדמיית אסטרוציטים המבטאים GECIs ומבנים סינפטיים עצביים. עם השימוש במיקרוסקופיית מולטיפוטונים, ניתן להקליט שוב ושוב דינמיקה של איתות סידן אסטרוציטי ודינמיקה סינפטית מבנית לאורך ימים.

חלון גולגולתי כרוני מספק איכות הדמיה אופטית טובה ומאפשר לבצע מפגשי הדמיה מרובים של אותם מבנים עצביים וגליאליים. הגישה גם מאפשרת לבצע זריקות ויראליות תוך גולגולתיות לפני כיסוי הגולגולת בכוס כיסוי.
המשתמשים צריכים להיות מודעים למספר מגבלות שנגרמו כתוצאה מהשתלת חלונות גולגולת כרוניים. נדרש ניסיון ותרגול רב כדי להשיג חלון באיכות גבוהה ולהבטיח את הישרדות בעלי החיים. יתר על כן, הניתוח הוא פולשני ועלול לגרום לתגובה דלקתית. טיפול תרופתי במהלך ניתוח והתאוששות לאחר ניתוח כולל תרופות אנטי דלקתיות ואנטיביוטיקה31. ייתכן שהשימוש בתרופות נוגדות דלקת לא יתאים למחקרים החוקרים מודלים של דלקת עצבית, שכן תרופות אלה עשויות להשפיע גם על התופעה הנחקרת.

לאחרונה, הודגם כי לימפנגיוגנזה של קרום המוח מתרחשת בתגובה להשתלת חלוןהגולגולת 32. לפיכך, חלון הגולגולת הכרוני עשוי שלא להיות מקובל על מחקרים החוקרים כלי לימפה של קרום המוח. חשוב לציין שתקופת המתנה של שבועיים-שלושה לאחר הניתוח נחוצה לפני ניסויי הדמיה31,33. בנוסף, גיל העכברים, כמו גם זמן ההתאוששות לאחר הניתוח, מגבילים את היכולת לדמות אירועים התפתחותיים מוקדמים מאוד. אמנם ניתן להשתיל חלונות גולגולת בעכברים צעירים יותר (P15-21)34, אך יש לקחת בחשבון תופעות לוואי אפשריות, כגון דלקת.

כחלופה לחלון הגולגולת הכרוני, ניתן גם לבצע תכשירי גולגולת דלילים. שיטה זו גורמת לדליל הגולגולת על פני אזור העניין לפני ההדמיה. חלון גולגולת דליל הוא פחות פולשני ומתגבר על הצורך במתן תרופות אנטי דלקתיות, מה שהופך אותו לבחירה במחקרים שחוקרים מודלים של דלקת עצבית ואינטראקציות נוירואימוניות. עם זאת, אם רוצים הדמיה חוזרת ונשנית, יש לדלל מחדש את הגולגולת לפני ההדמיה, וניתן לדלל מחדש את העצם רק מספר מוגבל של פעמים לפני שאיכות התמונה יורדתל-35.

אף על פי שגרסה שונה של שיטת גולגולת דקה מחוזקת שאינה דורשת רהינינג תוארה36, עובי גולגולת לא אחיד עלול לגרום לסטיות כדוריות, וכתוצאה מכך עיוות של מבנים פלואורסצנטיים37. לכן, כאשר נרשמות מדידות כמותיות, כגון דינמיקת איתות סידן38 או רמות של חלבונים סינפטיים27, בניגוד לזיהוי מבנים כגון עמודי שדרה דנדריטיים, חלון הגולגולת הכרוני מספק הכנה יציבה ואמינה יותר מבחינה אופטית. לפיכך, עבור הדמיה אורכית, in vivo, החדרת חלונות גולגולת היא השיטה הטובה ביותר לבחינת שינויים כתוצאה מטיפול תרופתי39, אימון בפרדיגמה התנהגותית 4,25, ושיפוץ סינפטי בהפרעות נוירולוגיות11,27.

ההליך המתואר הוא מאתגר מבחינה טכנית ומספק חסם לרכישת תמונה איכותית. יש לנקוט משנה זהירות בכל שלב כדי להבטיח שהחלון יישאר נקי מזיהומים, ונמנע נזק לרקמה הבסיסית. זה כולל גירוד עדין של רקמת חיבור על הגולגולת, לקיחת הפסקות נאותות לקירור העצם בעת הקידוח, הבטחת דילול אחיד כדי להקל על הסרת עצם קלה, מניעת נפיחות במוח, וטיפול קיצוני לא לפגוע בדורה מאטר במהלך הניתוח. רק ההכנות הטובות ביותר לחלונות נשארות שקופות אופטית לפרקי הדמיה ארוכים יותר.

בעוד שניתן לדמות שינויים במבנים סינפטיים בעכברים מורדמים לאורך ימים, הדבר אינו עדיף כאשר בוחנים את איתות הסידן של אסטרוציטים, שכן הוכח כי הרדמה משבשת את איתות הסידן האסטרוציטים in vivo40. כדי לבצע הדמיה in vivo בעכברים ערים ומרוסנים, חיוני להרגיל את החיה לתנאי ההדמיה בכלוב הבית הנייד, בהליכון הצף בחופשיות, בכדור קלקר מורם באוויר או במנגנון אחר. הרגלה נכונה לא רק תפחית את הלחץ במהלך ההדמיה, אלא גם תפעל כדי למזער ממצאי תנועה במהלך מפגשי ההדמיה.

לסיכום, מיקרוסקופיית in vivo multiphoton באמצעות חלון גולגולתי כרוני היא כלי שימושי לחקר שינויים מבניים ותפקודיים של תאים בקליפת המוח. באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ספציפיים לתאים וכתבים, ניתן לחקור מורפולוגיה תאית, אינטראקציות ופעילות. עם הדמיית האורך המותרת על ידי חלונות גולגולת כרוניים, ניתן לבחון כיצד מבנים סינפטיים משתנים ומתפתחים עם הזמן13,14. באמצעות הפרוטוקול שהוצג כאן, ניתן לבחון דינמיקה של איתות סידן באסטרוציטים עקב גירוי חושי23,38, תנועה או בהלה 6,41, מחלה15,42, או פרמטרים אחרים של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15o Pointed Blade Surgistar 6500 Surgery Tools
19 G Needles BD 305186 Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Addgene 28306-AAV1 Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre Addgene 105558-AAV1 Viral Vector
Acteone Fisher Scientific A16P4 Reagent
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific Covidien 5750 Surgery Supply
Beveler Narishige Equipment
Borosilicate Glass World Precision Instruments TW100F-4 Surgery Supply
Carbide Burs SS White Dental 14717 Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL Zoetis Mylan Institutional, LLC. Drug
Compressed Air Fisher Scientific 23-022-523 Surgery Supply
Cotton Tip Applicators Puritan 836-WC NO BINDER Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm Warner Instruments 64-0720, 64-0700 Surgery Supply
Dental Drill Aseptico Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL Mylan Institutional, LLC. Drug
Dissecting Microscope Nikon Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid) Patterson Dental 602-8518 Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder) Patterson Dental 602-7932 Reagent
Enrofloxacin, 2.27% Bayer Drug
Eye Ointment Dechra 17033-211-38 Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries Equipment
Forceps (Large) World Precision Instruments 14099 Surgery Tools
Forceps (Small) World Precision Instruments 501764 Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J The Jackson Laboratory Stock No: 024105 Mouse line
Germinator Fisher Scientific Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J The Jackson Laboratory Stock No: 012586 Mouse Line
Headplate Neurotar Model 1, Model 3 Surgery Supply
Hemostatic forceps World Precision Instruments 501705 Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade World Precision Instruments 501247 Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades World Precision Instruments 500236 Surgery Tools
Iodine Prep Pads Avantor 15648-926 Surgery Supply
Isoflurane Piramal Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box Harvard Apparatus Equipment
Isoflurane Vaporizer SurgiVet Equipment
Krazy Glue Office Depot KG517 Reagent
Loctite 401 Henkel 40140 fast-curing instant adhesive
Loctite 454 Fisher Scientific NC9194415 cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller Sutter Instruments Equipment
Multiphoton Microscope Equipment
Nitrogen Matheson NI M200 Gas
Oxygen Matheson OX M250 Gas
Picospritzer Parker intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips Rainin 17014340 Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer Wahl Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride) Med Vet International RX0.9NACL-30BAC Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11 Integra 4-111 Surgery Tools
Scissors World Precision Instruments 503667 Surgery Tools
Stereotaxic Instrument Stoelting Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips) Kettenbach Dental 31002 Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam) Ethicon 1972 Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle BD 309625 Surgery Supply
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648-1G Reagent
Ti:Sapphire Laser Coherent Equipment
Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM Surgery Supply
Water Blanket Fisher Scientific Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL Fresenius Kabi USA Drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  3. Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
  4. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  5. Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
  6. Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  7. Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
  8. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  9. Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
  10. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  11. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  12. Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  15. Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
  16. Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
  17. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  18. Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
  19. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  20. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  21. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  22. Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
  23. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  24. Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
  25. Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
  26. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  27. Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
  28. Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
  29. Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  30. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
  31. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  32. Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  33. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
  34. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
  35. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  36. Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
  37. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  38. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  39. Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
  40. Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  41. Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
  42. Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 172
השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית <em>In Vivo</em> בעכברים ערים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, … More

Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice. J. Vis. Exp. (172), e62633, doi:10.3791/62633 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter