Summary
Здесь представлен протокол имплантации хронического черепного окна для продольной визуализации клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы.
Abstract
Чтобы полностью понять клеточную физиологию нейронов и глии у ведущих себя животных, необходимо визуализировать их морфологию и записать их активность in vivo у ведущих себя мышей. В этой статье описывается метод имплантации хронического черепного окна, позволяющий проводить продольную визуализацию клеток мозга у бодрствующих мышей с ограничением головы. В сочетании с генетическими стратегиями и вирусными инъекциями можно маркировать конкретные клетки и области, представляющие интерес, структурными или физиологическими маркерами. Этот протокол демонстрирует, как комбинировать вирусные инъекции для маркировки нейронов в непосредственной близости от GCaMP6-экспрессирующих астроцитов в коре для одновременной визуализации обеих клеток через краниальное окно. Многофотонная визуализация одних и тех же клеток может выполняться в течение нескольких дней, недель или месяцев у бодрствующих, ведущих себя животных. Этот подход предоставляет исследователям метод просмотра клеточной динамики в режиме реального времени и может быть применен для ответа на ряд вопросов в нейробиологии.
Introduction
Способность выполнять in vivo многофотонную флуоресцентную микроскопию в коре мышей имеет первостепенное значение для изучения клеточной сигнализации и структуры 1,2,3,4,5,6,7,8,9, патологии заболевания 10,11 и клеточного развития 12,13 . При имплантации хронических черепных окон возможна продольная визуализация, позволяющая повторно визуализировать корковые области в течение дней, недель или месяцев13,14 у живых животных. Многофотонная микроскопия идеально подходит для повторной визуализации in vivo из-за улучшенного глубинного зондирования и уменьшения фотоповреждений, связанных с используемым инфракрасным лазером. Это позволяет изучать молекулярную и клеточную динамику специфических клеток в различных корковых областях.
Многофотонная микроскопия использовалась для визуализации in vivo нейронных и глиальных клеток у мышей 15,16,17,18,19,20. Различные стратегии могут быть реализованы для маркировки определенных типов клеток и областей интересов. Одним из распространенных подходов является управление экспрессией генетически закодированных флуоресцентных белков специфическим для клеток способом с использованием системы рекомбинации Cre-Lox. Это может быть выполнено с генетически модифицированными мышами, например, скрещивание tdTomato «флоксированной» мыши (Ai14) с мышью, экспрессирующей cre-recombinase под промотором, представляющим интерес21. В качестве альтернативы, маркировка клеток и участков может быть достигнута с помощью вирусных инъекций. Здесь вирус, кодирующий Cre-рекомбиназу под клеточным промотором, и вирус, кодирующий интересующий ген флоксированной, вводятся в определенную область. Соответствующие типы клеток, получающие оба вирусных вектора, затем будут экспрессировать желаемый ген (ы). Эти гены могут быть структурными маркерами, такими как tdTomato, для просмотра изменений в клеточной морфологии22 или генетически закодированными показателями кальция (GECI), такими как GCaMP и / или RCaMP, для изучения динамики кальция23. Методы генетической рекомбинации могут применяться индивидуально или в комбинации для маркировки одного или более типов клеток. Третий подход, не требующий трансгенных мышей или вирусных конструкций (которые имеют ограниченную упаковочную способность), заключается в внутриутробной электропорации конструкций ДНК24. В зависимости от времени электропорации, различные типы клеток могут быть нацеленына 25,26,27.
При выполнении многофотонной визуализации мыши могут быть изображены во время бодрствования или обезболены. Визуализация бодрствующих мышей может быть выполнена путем закрепления мыши с помощью прикрепленной головной пластины28. Этот подход становится менее стрессовым, позволяя относительно свободно передвигаться животному с использованием методов, таких как свободно плавающие, поддерживаемые воздухом шарики из пенополистирола29, свободно плавающие беговые дорожки1 или система домашних клеток с воздушным подъемом, где мыши скрепляются прикрепленной головной пластиной и могут перемещаться в открытой камере30. Для каждого из этих условий визуализации сначала необходимо будет приучить мышей к настройке визуализации. В этой статье описывается процедура привыкания и визуализации с использованием системы домашних клеток с воздушным подъемом.
Этот протокол описывает имплантацию хронического черепного окна для продольной визуализации in vivo в коре головного мозга. Здесь мы будем использовать мышей, которые условно экспрессируют GCaMP6f в астроцитах, для мониторинга динамики передачи сигналов кальция. Далее в данной работе описывается процедура вирусных инъекций с использованием tdTomato в качестве метки для нейронов. Это позволяет определить изменения в нейрональной синаптической структуре и/или доступность в качестве структурного маркера, который позволяет повторно визуализировать один и тот же астроцит. На протяжении всего протокола будут выделены важные шаги для обеспечения наилучшего качества изображений, полученных с помощью многофотонной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, утвержденными IACUC в Медицинском центре Университета Небраски.
1. Перед операцией
- Подготовьте пипетки для вирусных инъекций. Потяните боросиликатные стеклянные капилляры с помощью съемника пипетки и скосите пипетку под углом 20°. Стерилизуйте пипетки на ночь.
- Приготовьте свежие кусочки стерильной гелевой пены, разрезав их на небольшие квадратики. Погрузите гелевую пену в стерильную микрофьюжную трубку, содержащую 0,5 мл физиологического раствора. Замочите гелевую пену в физиологическом растворе не менее чем на 30 минут перед использованием.
- Приготовьте свежие кусочки полосок губки, разрезав их на тонкие полоски.
- За двадцать минут до операции вводят 4-6-недельным мышам GLAST-CreER/GCaMP6f внутрибрюшинно 0,2 мг/кг дексаметазона для предотвращения отека мозга и 5 мг/кг карпрофена для уменьшения воспаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы индуцировать рекомбинацию и экспрессию GCaMP6f примерно в 40% астроцитов, мышам GLAST-CreER/GCaMP6f вводили 100 мг/кг тамоксифена через 3 недели в течение 5 дней подряд.
2. Начало операции
- Через 20 мин обезболивают мышей 3% изофлураном кислородом со скоростью потока 1 л/мин в течение примерно 1,5 мин.
- После анестезии поместите мышь на стереотаксическую рамку, которая сидит на водоциркуляющем одеяле, чтобы поддерживать температуру тела 37 ° C на протяжении всей операции. Прикрепите мышь к раме с помощью зажима морды и ушных вкладышей. Убедитесь, что зажим морды и ушные вкладыши достаточно устойчивы, чтобы голова не двигалась во время процедуры, но не настолько плотно, чтобы череп был поврежден.
- Поддерживают анестезию 1-1,5% изофлураном с кислородом со скоростью потока 1-2 л/мин. Обратите внимание, что некоторым животным может потребоваться больше или меньше изофлунана для поддержания седации. Следите за дыханием животного, а также его рефлексами на щипки пальцев ног и хвоста и соответствующим образом регулируйте изофлуран.
- Нанесите глазную мазь на каждый глаз с помощью хлопкового аппликатора, чтобы предотвратить пересыхание глаз во время процедуры.
- Используя триммеры для грызунов, сбривайте волосы от шеи до самых глаз. Соблюдайте осторожность, чтобы убедиться, что усы животного не были случайно подстрижены.
- Очистите выбритую область одной прокладкой для приготовления йода, а затем одной прокладкой для приготовления спирта.
- Используя стерильные тканевые щипцы и хирургические ножницы, вырежьте и удалите кожу с лобных швов перед брегмой вплоть до лямбды.
- После удаления кожи добавьте примерно 0,1 мл 1% ксилокаина (лидокаина с адреналином 1:200 000) в череп, чтобы свести к минимуму кровотечение черепа.
- Используя стерильный хирургический клинок из углеродистой стали 11, прикрепленный к рукоятке, аккуратно соскоблите соединительную ткань с черепа. Будьте особенно осторожны при удалении соединительной ткани вблизи края черепа, так как любая оставшаяся ткань может предотвратить сильную адгезию стекла или головной пластины в дальнейшем.
- Используйте стерильные тканевые щипцы для удаления рыхлой соединительной ткани из черепа.
- Используя стерильные аппликаторы для хлопчатобумажных наконечников, очистите череп от любого оставшегося ксилокаина.
- После завершения тщательно обезжирьте череп с помощью стерильного хлопкового наконечника, смоченного в ацетоне. Используйте сжатый воздух, чтобы немедленно высушить череп феном.
3. Краниотомия
- Используя маркер тонкой точки и линейку, измерьте соответствующий размер отверстия в нужном месте. Подтвердите размер отверстия, сравнив его с размером покровного стекла (3 или 5 мм в диаметре); убедитесь, что отверстие немного меньше размера защитного стекла.
- С помощью бормашины постепенно прослеживайте контур отверстия, истончая кость. Медленно сверлите, чтобы предотвратить сверление кости, и сверлите в концентрических кругах, чтобы облегчить равномерное истончение кости.
- После каждого концентрического прохода добавляйте каплю или две стерильного физиологического раствора в пробуренную область. Дайте физиологическому раствору постоять не менее 10 с, чтобы предотвратить перегрев кости и повреждение основной твердой мозговой оболочки.
- Используйте стерильный аппликатор хлопкового наконечника, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор. Выдувайте сжатый воздух над областью, чтобы убедиться, что весь оставшийся физиологический раствор испарился перед возобновлением бурения. Сделайте это, чтобы сдуть остатки кости.
- Повторяйте шаги 3.2-3.4 до тех пор, пока кость не истончится для удаления.
- Убедитесь, что кость достаточно истончена для удаления, осторожно надавливая на центральную область кости тонкими щипцами, чтобы проверить, что истонченный череп движется. Подлежащая сосудистая система должна быть видна там, где произошло сверление. Обратите внимание, что кость может выглядеть так, как будто она треснет там, где произошло истончение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тренировка на этом этапе имеет решающее значение для определения того, когда кость была истончена соответствующим образом. - Прежде чем пытаться удалить кость, проверьте мышь, чтобы убедиться, что она полностью седативна. Если нет, постепенно увеличивайте содержание изофлурана, чтобы предотвратить отек мозга при удалении кости.
- Добавьте небольшой кусочек гелевой пены, насыщенной физиологическим раствором, к истонченному черепу. Добавьте одну или две дополнительные капли физиологического раствора в истонченный череп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие большого количества физиологического раствора над истонченным черепом помогает уменьшить кровотечение и защитить твердую мозговую оболочку при удалении костного лоскута. - Используя миниатюрное заостренное лезвие на 15°, аккуратно вставьте лезвие в истонченную кость и разрезайте вдоль истонченной кости. Держите гелевую пену смоченной в физиологическом растворе, готовой остановить любые кровотечения, которые могут возникнуть.
- Используя щипцы, осторожно поднимите и удалите кость. Будьте максимально щадны, чтобы избежать повреждения подлежащей ткани и сосудистой системы. Будьте предельно осторожны, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку.
- После того, как костный лоскут удален, добавьте свежий кусочек гелевой пены, насыщенной физиологическим раствором, в кору. Добавьте несколько капель физиологического раствора, чтобы предотвратить высыхание гелевой пены, так как это приведет к повреждению подлежащей ткани.
4. Вирусные инъекции
- Выполняют вирусные инъекции с помощью стереотаксического аппарата.
- Подготовьте AAV1. CaMKII.0.4.Cre (титр 3 × 1013 копий генома (GC)/мл) при 1:5000 путем последовательных разведений в физиологическом растворе.
- Приготовьте смесь AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) и AAV1. ЦАГ. FLEX.tdTomato (титр 5 × 1012 ГК/мл) на небольшом кусочке парапленки.
- Наполните стерильную скошенную стеклянную пипетку с наконечником размером 20 мкм вирусной смесью, аккуратно положив пипетку на раствор.
- Опустите пипетку так, чтобы она просто коснулась поверхности мозга и продолжайте опускаться в течение дополнительных 200-300 мкм для инъекций L2/3. Используя внутриклеточную микроинъекционную дозирующую систему (см. Таблицу материалов), вводят давление 12-15 раз в течение 2 мин (20 psi, длительность импульса 9 мс). Наблюдайте, как мениск в пипетке падает с каждой инъекцией, чтобы убедиться, что пипетка не заблокирована.
- После инъекции оставьте пипетку в мозге на 4-5 минут, чтобы предотвратить обратный поток. Медленно втягивайте пипетку.
- Повторите инъекции в 2-3 местах (приблизительно на расстоянии 500 мкм друг от друга).
- Выбросьте использованные стеклянные пипетки, парапленки, наконечники пипеток и микрофьюжировочные трубки, используемые для последовательного разведения вируса Cre, в 10% отбеливатель.
5. Имплантация краниального окна
- Удалите любую гелевую пену и используйте небольшую полоску губчатых полосок, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор.
- Добавьте несколько капель антибиотика энрофлоксацина (22,7 мкг/мл) в отверстие и дайте ему остаться там в течение 1 мин. Через 1 мин используйте свежий кусочек губчатой полоски, чтобы впитать оставшийся энрофлоксацин. Повторите этот процесс еще два раза.
- После третьей промывки добавьте в отверстие несколько капель физиологического раствора и дайте ему остаться там в течение 1 мин. Через 1 мин используйте свежий кусочек губчатой полоски, чтобы впитать оставшийся физиологический раствор. Повторите этот процесс промывки еще два раза и после третьей стирки добавьте небольшую каплю физиологического раствора в отверстие.
- Поместите покровное стекло над отверстием. Используйте щипцы, чтобы убедиться, что стекло находится заподлицо над отверстием для получения изображений хорошего качества.
- Осторожно удерживая стекло на месте, нанесите цианоакрилатный клейкий гель (Таблица материалов) по периметру стекла, чтобы запечатать края окна на черепе. Убедитесь, что клей не просачивается под покровное стекло, и держите как можно больше клея с поверхности покровного стекла.
- Нанесите слой суперклея поверх клеевого геля. Добавьте слой зубной цементной жидкости поверх клея, чтобы он затвердел.
- Возьмите головную пластину вертолетного типа соответствующего размера и нанесите тонкий слой клея вокруг центрального отверстия. Поместите головную пластину поверх покровного стекла и дайте клею ненадолго высохнуть.
- В микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл добавьте порошок зубного цемента к отметке 0,1 мл на трубке. Добавьте 7-8 капель быстроотверждающегося, мгновенного клея и перемешайте. Втяните в шприц объемом 1 мл с помощью иглы 19 г, которая была разрезана, чтобы создать большее отверстие.
- Впрыскивайте смесь через боковые отверстия вертолетного стержня до тех пор, пока она не просочится с обеих сторон. Нанесите зубную цементно-клеевую смесь на остальную часть открытого черепа, чтобы закрепить головную пластину на черепе, что уменьшит артефакты движения во время визуализации.
- Дайте смеси высохнуть на воздухе не менее 15 минут.
- Введите мышам 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы помочь в выздоровлении.
6. После операции
- Извлеките мышь из стереотаксической рамки и верните ее в клетку.
- Поместите часть клетки на водоциркуляционное одеяло, прокладки с космическим гелем или изотермические прокладки, чтобы помочь с восстановлением.
- Обеспечьте животному небольшую помощь пищевыми гранулами и влажным кормом, в дополнение к их обычному рациону, чтобы еще больше помочь в выздоровлении. Добавляйте новые пищевые гранулы и влажный корм каждый день после операции на время восстановления.
- На следующий день после операции мышам однократно вводят 5 мг/кг карпрофена и 5 мг/кг энрофлоксацина.
- На 2-6 день вводите мышам один раз с 5 мг / кг карпрофена и два раза с 5 мг / кг энрофлоксацина, в ожидании одобрения местным IACUC. Отделяют инъекции энрофлоксацина не менее чем на 8 ч.
- В дни 7-20 ежедневно вводят мышам 5 мг/кг карпрофена.
7. Привыкание животных к визуализации
- На 14-й день после операции осмотрите краниальное окно на предмет оптической прозрачности. Не используйте мышей с неясными или иным образом поврежденными окнами (т.е. чрезмерным ангиогенезом).
- Проверьте экспрессию tdTomato под флуоресцентным микроскопом. Если меченые клетки могут быть идентифицированы, приступайте к привыканию животных.
- Первый день привыкания (обращения)
- Подержите мышь в течение нескольких минут и верните ее в клетку после обработки. Повторите обработку три раза с интервалом в 15 минут между сеансами.
- После третьего испытания приучите мышь, завернув животное в небольшой кусочек ткани.
- Держите мышь завернутой в ткань примерно 1 минуту.
- После испытания верните мышь в клетку. Повторите этот процесс еще два раза, обеспечивая 15-минутный интервал между каждым испытанием.
- Второй день привыкания
- Взвесьте и запишите вес мыши.
- Заверните мышь в ткань и закрепите ее через головную пластину к рычагу фиксации головы поднятой по воздуху домашней клетки.
- Оставьте домашнюю клетку открытой для света.
- Дайте мыши оставаться в клетке мобильного дома в течение 15 минут.
- После привыкания выньте мышь из домашней клетки и выключите воздушный поток.
- Взвесьте мышь и верните ее в клетку. Позаботьтесь о том, чтобы включить только мышей, которые не теряют более 10% своей массы тела. Исключите мышей, которые теряют более 10% своего веса в течение любого дня привыкания из экспериментов по визуализации.
- Третий день привыкания и далее
- Взвесьте и запишите вес мыши, прежде чем закрепить ее в домашней клетке, поднятой по воздуху.
- Закрепите мышь в домашней клетке, поднятой по воздуху.
- Накройте домашнюю клетку чем-то, что обеспечит темную внутреннюю часть, например, коробкой, и позвольте мыши оставаться защищенной в течение 30 минут.
- Через 30 минут раскройте домашнюю клетку, извлеките мышь и выключите воздушный поток.
- Взвешивайте и записывайте вес мыши после привыкания.
- Повторяйте этот процесс каждый день, увеличивая продолжительность закрепления мыши в домашней клетке на 15 минут. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока мышь не будет закреплена в домашней клетке в течение 1,5 ч, так как это приблизительная продолжительность сеанса двухфотонной визуализации.
- Чтобы приучить мышь к шуму, выполните некоторые сеансы привыкания на микроскопе, чтобы акклиматизировать мышь к звукам лазерных сканирующих зеркал. Исключите мышей, которые не привыкают в достаточной степени (т. Е. Вокализации и дефекация, вызванная стрессом).
8. Многофотонная визуализация
- Начните визуализацию через 3 недели после операции, чтобы окно очистилось.
- Выполняйте визуализацию на специально изготовленном или коммерчески доступном многофотонном микроскопе, оснащенном Ti:Sapphire лазером. Получайте изображения с помощью объектива с высокой числовой диафрагмой (NA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Двухканальная визуализация достигается с помощью 565 нм дихроичного зеркала и двух внешних фотоумноживателей. Полосовой фильтр 535/50 используется для обнаружения излучения GCaMP6f, а для обнаружения tdTomato используется полосовой фильтр 610/75. Для получения изображений, показанных на рисунках 1 и 2, использовались 25-кратный объектив погружения в воду (1,05 NA) и резонансные сканеры. Каждая интересующая область состояла из стопки изображений, разделенных в осевом направлении на 1 мкм. Каждая оптическая секция была собрана в 512 x 512 пикселей, 0,18 мкм / пиксель. Изображения были получены из передней области первичной моторной коры, определяемой стереотаксическими координатами. - Установите длину волны лазера на 920 нм (990 нм, если используется GECI с красным смещением).
- Поместите мышь в клетку мобильного дома и прижмите головную панель к рычагу фиксации головы.
- Добавьте несколько капель воды в центр окна.
- Используя широкоугольный режим микроскопа, выберите 2-3 положения легко идентифицируемой сосудистой системы. Сохраните изображения этих кровеносных сосудов и запишите координаты X и Y, которые появляются на контроллере двигателя, чтобы переместить дендриты, меченые tdTomato, для последующих сеансов визуализации. Каждый раз корректируйте координаты X и Y, чтобы перестроиться с сохраненными изображениями кровеносных сосудов.
- После того, как сосудистая система была визуализирована и позиции записаны, найдите области с нейронами, экспрессирующими tdTomato (рисунок 1). Изображение синаптических структур (дендритов и аксонов) нейронов и активности GCaMP6f в астроцитах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дендриты будут служить ориентирами для надежного возвращения в одни и те же области и изображения одних и тех же дендритов и астроцитов в течение нескольких дней. Не наблюдалось заметного сдвига в плоскости визуализации при стабильной фиксации головы и после привыкания к фиксации головы. Смещение, происходящее в направлениях X и Y, корректируется движением. - После визуализации верните мышь в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей обычно держат на прицеле максимум 2 ч. Когда визуализация длится в течение длительного времени, вода под объективом может высохнуть. Воду следует добавлять во время экспериментов. В качестве альтернативы вместо воды можно использовать ультразвуковой гель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Качество черепного окна можно оценить по тому, насколько четкими выглядят нейронные структуры. В хорошем окне хорошо видны дендритные шипы (рисунок 1). При сохранении структурных и позиционных данных одно и то же животное может быть изображено многократно в течение нескольких дней, недель или месяцев для изучения одних и тех же клеток (рисунок 1). Изображения на рисунке 1 были получены из передней области первичной моторной коры (в окне 5 мм). Можно измерить различные параметры, включая плотность и динамику дендритных шипов и аксональных бутонов для изучения структурной синаптической пластичности. Астроцитарную активность можно изучать, анализируя пространственно-временную динамику передачи сигналов кальция (рисунок 2). В зависимости от возможностей микроскопа (т.е. резонансных сканеров, пьезомотора, контролирующего объектив) и экспериментального вопроса, покадровая визуализация может быть выполнена в одной фокальной плоскости или в объеме или мультирегионе для мониторинга активности кальция на желаемой частоте сбора.
Рисунок 1: Повторная визуализация дендритов и астроцитов в течение нескольких дней. Дендритный экспрессирующий tdTomato (пурпурный) позволяет идентифицировать и повторно визуализировать GCaMP6f-экспрессирующие астроциты (белые) в непосредственной близости. Активность Ca2+ в астроцитах проявляется в разные моменты времени в разные дни. Синаптическая структурная пластичность может быть одновременно изображена. Два новых колючка, появившиеся на 2-й день, отмечены стрелками. В то время как один позвоночник сохранялся и был виден на 5-й день (синяя стрелка), другой позвоночник был устранен (зеленая стрелка). Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация астроцитарной передачи сигналов кальция. Изображения, показывающие активность Ca2+ из астроцита, экспрессирующего GCaMP6f. Панели показывают активность Ca2+, записанную из объема 4 мкм в разные моменты времени во время приобретения. Передача сигналов кальция в процессах и микродоменах может наблюдаться в периоды покоя. Глобальное событие, охватывающее всю клетку, можно наблюдать во время локомоционного схватки в 188 с. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представили протокол имплантации хронических черепных окон для визуализации in vivo корковых астроцитов и нейронов у бодрствующих, с задержкой головы мышей в воздушной домашней клетке. Были приведены конкретные примеры применения краниального окна для визуализации астроцитов, которые экспрессируют GECI и нейрональные синаптические структуры. С использованием многофотонной микроскопии астроцитарная динамика передачи сигналов кальция и структурная синаптическая динамика могут регистрироваться многократно в течение нескольких дней.
Хроническое краниальное окно обеспечивает хорошее качество оптической визуализации и позволяет выполнять несколько сеансов визуализации одних и тех же нейронных и глиальных структур. Подход также позволяет выполнять внутричерепные вирусные инъекции перед покрытием трепанации черепа покровным стеклом.
Пользователи должны знать о ряде ограничений, возникающих при имплантации хронических черепных окон. Опыт и много практики необходимы для достижения качественного окна и обеспечения выживания животных. Кроме того, операция является инвазивной и может привести к воспалительной реакции. Фармакологическое лечение во время операции и послеоперационного восстановления включает противовоспалительные препараты и антибиотики31. Использование противовоспалительных препаратов может быть неуместным в исследованиях, изучающих модели нейровоспаления, поскольку эти препараты также могут влиять на изучаемое явление.
Совсем недавно было показано, что менингеальный лимфангиогенез происходит в ответ на имплантацию черепного окна32. Таким образом, хроническое краниальное окно может быть неприемлемо для исследований, изучающих менингеальные лимфатические сосуды. Важно отметить, что 2-3-недельный период ожидания после операции необходим перед экспериментами по визуализации 31,33. Кроме того, возраст мышей, а также время восстановления после операции ограничивают способность отображать очень ранние события развития. В то время как краниальные окна могут быть имплантированы молодым мышам (P15-21)34, необходимо учитывать возможные побочные эффекты, такие как воспаление.
В качестве альтернативы хроническому черепному окну также могут быть изготовлены препараты для истончения черепа. Этот метод приводит к истончению черепа над интересующей областью перед визуализацией. Истонченное окно черепа менее инвазивно и преодолевает необходимость введения противовоспалительных препаратов, что делает его выбором в исследованиях, изучающих модели нейровоспаления и нейроиммунных взаимодействий. Однако, если требуется повторная визуализация, череп должен быть повторно истончен перед визуализацией, а кость может быть повторно истончена только ограниченное количество раз, прежде чем качество изображения ухудшится35.
Хотя была описана модифицированная версия армированного метода с тонким черепом, не требующая повторного окрашивания,неоднородная толщина черепа может вызывать сферические аберрации, приводящие к искажению флуоресцентных структур37. Таким образом, когда регистрируются количественные измерения, такие как динамика передачи сигналов кальция38 или уровни синаптических белков27, в отличие от идентификации таких структур, как дендритные шипы, хроническое черепное окно обеспечивает более оптически стабильную и надежную подготовку. Таким образом, для продольной визуализации in vivo вставка черепных окон является превосходным методом изучения изменений в результатемедикаментозного лечения 39, обучения поведенческой парадигме 4,25 и синаптического ремоделирования при неврологических расстройствах11,27.
Описанная процедура является технически сложной и обеспечивает барьер для получения качественного изображения. На каждом шагу необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы убедиться, что окно остается свободным от инфекции, и избежать повреждения подлежащей ткани. Это включает в себя мягкий соскоб соединительной ткани на черепе, адекватные перерывы для охлаждения кости при сверлении, обеспечение равномерного истончения для облегчения легкого удаления кости, предотвращение отека мозга и крайнюю осторожность, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку во время операции. Только лучшие оконные препараты остаются оптически прозрачными в течение более длительных периодов визуализации.
В то время как изменения в синаптических структурах могут быть визуализированы у обезболенных мышей в течение нескольких дней, это не предпочтительно при изучении передачи сигналов кальция астроцитами, поскольку анестезия, как было показано, нарушает передачу сигналов кальция астроцитов in vivo40. Чтобы выполнить визуализацию in vivo у бодрствующих, сдерживаемых головой мышей, важно приучить животное к условиям визуализации в подвижной домашней клетке, свободно плавающей беговой дорожке, воздушном шарике из пенополистирола или другом аппарате. Правильное привыкание не только уменьшит стресс во время визуализации, но и сведет к минимуму артефакты движения во время сеансов визуализации.
Таким образом, многофотонная микроскопия in vivo через хроническое черепное окно является полезным инструментом для изучения структурных и функциональных изменений клеток коры головного мозга. Используя клеточные флуоресцентные красители и репортеры, можно изучать клеточную морфологию, взаимодействия и активность. С помощью продольной визуализации, допускаемой хроническими краниальными окнами, можно исследовать, как синаптические структуры изменяются и развиваются с течением времени13,14. Используя представленный здесь протокол, можно исследовать динамику передачи сигналов кальция в астроцитах за счет сенсорной стимуляции 23,38, локомоции или испуга 6,41, заболевания15,42 или других интересующих параметров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
