Summary
Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.
Abstract
Para comprender completamente la fisiología celular de las neuronas y la glía en animales que se comportan, es necesario visualizar su morfología y registrar su actividad in vivo en ratones que se comportan. Este artículo describe un método para la implantación de una ventana craneal crónica para permitir la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida. En combinación con estrategias genéticas e inyecciones virales, es posible etiquetar células y regiones específicas de interés con marcadores estructurales o fisiológicos. Este protocolo demuestra cómo combinar inyecciones virales para etiquetar neuronas en las cercanías de los astrocitos que expresan GCaMP6 en la corteza para obtener imágenes simultáneas de ambas células a través de una ventana craneal. Las imágenes multifotónicas de las mismas células se pueden realizar durante días, semanas o meses en animales despiertos y de comportamiento. Este enfoque proporciona a los investigadores un método para ver la dinámica celular en tiempo real y se puede aplicar para responder a una serie de preguntas en neurociencia.
Introduction
La capacidad de realizar microscopía de fluorescencia multifotónica in vivo en la corteza de ratones es primordial para el estudio de la señalización celular y la estructura 1,2,3,4,5,6,7,8,9, la patología de la enfermedad 10,11 y el desarrollo celular12,13 . Con la implantación de ventanas craneales crónicas, es posible la obtención de imágenes longitudinales, lo que permite la obtención repetida de imágenes de áreas corticales durante días, semanas o meses13,14 en animales vivos. La microscopía multifotónica es ideal para imágenes repetidas in vivo debido a la mejora del sondeo de profundidad y la reducción del fotodaño asociado con el láser infrarrojo utilizado. Esto permite el estudio de la dinámica molecular y celular de células específicas en varias regiones corticales.
La microscopía multifotónica se ha utilizado para la obtención de imágenes in vivo de células neuronales y gliales en ratones 15,16,17,18,19,20. Se pueden implementar varias estrategias para etiquetar tipos de células particulares y áreas de interés. Un enfoque común es impulsar la expresión de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente de una manera específica de la célula utilizando el sistema de recombinación Cre-Lox. Esto se puede realizar con ratones modificados genéticamente, por ejemplo, cruzando tdTomato "floxed" mouse (Ai14) con un ratón que expresa Cre-recombinasa bajo un promotor de interés21. Alternativamente, el etiquetado específico de células y sitios se puede lograr con inyecciones virales. Aquí, un virus que codifica Cre recombinasa bajo un promotor específico de la célula y un virus que codifica un gen floxed de interés se inyectan en una región definida. Los tipos de células apropiadas que reciben ambos vectores virales expresarán los genes deseados. Estos genes pueden ser marcadores estructurales, como tdTomato, para ver los cambios en la morfología celular22 o indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP y / o RCaMP, para examinar la dinámica del calcio23. Los métodos de recombinación genética se pueden aplicar individualmente o en combinación para etiquetar uno o más tipos de células. Un tercer enfoque, que no requiere ratones transgénicos o construcciones virales (que tienen una capacidad de empaque limitada), es la electroporación in utero de las construcciones de ADN24. Dependiendo del momento de la electroporación, se pueden apuntar a diferentes tipos decélulas 25,26,27.
Al realizar imágenes multifotónicas, los ratones pueden ser fotografiados mientras están despiertos o anestesiados. Las imágenes de ratones despiertos se pueden realizar asegurando el ratón a través de una placa de cabeza adjunta28. Este enfoque se hace menos estresante al permitir el movimiento relativamente libre del animal utilizando métodos, como bolas de espuma de poliestireno29 que flotan libremente y apoyadas en el aire, cintas de correr que flotanlibremente 1 o un sistema de jaula doméstica levantada por aire donde los ratones se sujetan con una placa de cabeza adjunta y se les permite moverse en una cámara abierta30. Para cada una de estas condiciones de imagen, primero será necesario habituar a los ratones a la configuración de imágenes. Este artículo describe el procedimiento de habituación e imágenes utilizando un sistema de jaula casera con elevación por aire.
Este protocolo describe la implantación de una ventana craneal crónica para imágenes longitudinales in vivo en la corteza. Aquí, usaremos ratones que expresan condicionalmente GCaMP6f en astrocitos para monitorear la dinámica de señalización del calcio. Además, este artículo describe el procedimiento para las inyecciones virales utilizando tdTomato como una etiqueta para las neuronas. Esto permite la determinación de cambios en la estructura sináptica neuronal y/o la disponibilidad como marcador estructural que permite la obtención de imágenes repetidas del mismo astrocito. A lo largo del protocolo, se destacarán pasos cruciales para garantizar la mejor calidad posible de las imágenes obtenidas de la microscopía multifotónica.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas por el IACUC en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.
1. Antes de la cirugía
- Prepare pipetas para inyecciones virales. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y bisele la pipeta en un ángulo de 20 °. Esterilizar las pipetas durante la noche.
- Prepare trozos frescos de espuma de gel estéril cortándolos en cuadrados pequeños. Sumerja la espuma de gel en un tubo de microfuge estéril que contenga 0,5 ml de solución salina. Remoje la espuma de gel en solución salina durante al menos 30 minutos antes de su uso.
- Prepare trozos frescos de tiras de esponja cortándolos en tiras delgadas.
- Veinte minutos antes de la cirugía, inyecte a ratones GLAST-CreER/GCaMP6f de 4-6 semanas de edad por vía intraperitoneal 0,2 mg/kg de dexametasona para prevenir la hinchazón cerebral y 5 mg/kg de carprofeno para reducir la inflamación.
NOTA: Para inducir la recombinación y expresión de GCaMP6f en aproximadamente el 40% de los astrocitos, los ratones GLAST-CreER/GCaMP6f fueron inyectados con 100 mg/kg de tamoxifeno a las 3 semanas durante 5 días consecutivos.
2. Inicio de la cirugía
- Después de 20 min, anestesiar a los ratones con 3% de isoflurano con oxígeno a un caudal de 1 L/min durante aproximadamente 1,5 min.
- Una vez anestesiado, coloque el ratón sobre un marco estereotáxico que se asiente sobre una manta de recirculación de agua para mantener una temperatura corporal de 37 °C durante toda la cirugía. Asegure el ratón al marco con la abrazadera del hocico y las barras para los oídos. Asegúrese de que la abrazadera del hocico y las barras para los oídos sean lo suficientemente estables como para que la cabeza no se mueva durante el procedimiento, pero no tan apretadas que el cráneo esté dañado.
- Mantener la anestesia con isoflurano al 1-1,5% con oxígeno a un caudal de 1-2 L/min. Tenga en cuenta que algunos animales pueden necesitar más o menos isoflurano para mantener la sedación. Controle la respiración del animal, así como sus reflejos en los pellizcos de los dedos de los pies y la cola, y ajuste el isoflurano adecuadamente.
- Aplique ungüento para los ojos en cada ojo con un aplicador de punta de algodón para evitar que los ojos se sequen durante el procedimiento.
- Usando recortadores de roedores, afeite el cabello desde el cuello hasta pasar por los ojos. Tenga cuidado para asegurarse de que los bigotes del animal no se recorten accidentalmente.
- Limpie el área afeitada con una almohadilla de preparación de yodo, seguida de una almohadilla de preparación de alcohol.
- Usando pinzas de tejido estéril y tijeras quirúrgicas, corte y retire la piel de las suturas frontales anteriores a la bregma hasta la lambda.
- Una vez que se retira la piel, agregue aproximadamente 0.1 ml de xilocaína al 1% (lidocaína con epinefrina 1: 200,000) al cráneo para minimizar el sangrado del cráneo.
- Usando una cuchilla quirúrgica estéril de acero al carbono tamaño 11 unida a un mango, raspe suavemente el tejido conectivo del cráneo. Tenga especial cuidado al extraer el tejido conectivo cerca del borde del cráneo, ya que cualquier tejido restante podría evitar una fuerte adhesión del vidrio o la placa de la cabeza más adelante.
- Use fórceps de tejido estéril para eliminar el tejido conectivo suelto del cráneo.
- Usando aplicadores de punta de algodón estériles, limpie cualquier xilocaína restante del cráneo.
- Una vez completado, desengrase completamente el cráneo con un aplicador de punta de algodón estéril sumergido en acetona. Use aire comprimido para secar inmediatamente el cráneo.
3. Craneotomía
- Usando un marcador de punto fino y una regla, mida el tamaño apropiado para la abertura en la ubicación deseada. Confirme el tamaño de la abertura comparándolo con el tamaño del vidrio de la cubierta (3 o 5 mm de diámetro); asegúrese de que la abertura sea ligeramente más pequeña que el tamaño del vidrio de la cubierta.
- Usando un taladro dental, rastree gradualmente el contorno de la abertura, adelgazando el hueso. Perfore lentamente para evitar la perforación a través del hueso y perfore en círculos concéntricos para facilitar incluso el adelgazamiento del hueso.
- Después de cada paso concéntrico, agregue una o dos gotas de solución salina estéril al área perforada. Permita que la solución salina repose durante al menos 10 s para evitar que el hueso se sobrecaliente y dañe la duramadre subyacente.
- Use un aplicador de punta de algodón estéril para absorber cualquier solución salina restante. Sople aire comprimido sobre el área para asegurarse de que toda la solución salina restante se haya evaporado antes de reanudar la perforación. Haga esto para soplar los restos óseos que quedan.
- Repita los pasos 3.2-3.4 hasta que el hueso se adelgace adecuadamente para su extracción.
- Asegúrese de que el hueso se adeluya adecuadamente para su extracción empujando suavemente el área central del hueso con fórceps finos para verificar que el cráneo adelgazado se mueva. La vasculatura subyacente debe ser visible donde ocurrió la perforación. Observe que el hueso puede aparecer como si se agrietara donde ocurrió el adelgazamiento.
NOTA: El entrenamiento en esta etapa es crucial para identificar cuándo el hueso se ha adelgazado adecuadamente. - Antes de intentar extraer el hueso, revise el ratón para asegurarse de que esté completamente sedado. De lo contrario, aumente gradualmente el mantenimiento del isoflurano para evitar la hinchazón del cerebro al extraer el hueso.
- Agregue un pequeño trozo de espuma de gel saturada de solución salina al cráneo adelgazado. Agregue una o dos gotas adicionales de solución salina al cráneo adelgazado.
NOTA: Tener mucha solución salina sobre el cráneo adelgazado ayuda a reducir el sangrado y proteger la duramadre al extraer el colgajo óseo. - Usando una hoja puntiaguda en miniatura de 15 °, inserte cuidadosamente la cuchilla en el hueso adelgazado y corte a lo largo del hueso adelgazado. Mantenga la espuma de gel empapada en solución salina, lista para detener cualquier sangrado que pueda ocurrir.
- Usando fórceps, levante y retire cuidadosamente el hueso. Sea lo más suave posible para evitar daños en el tejido subyacente y la vasculatura. Tenga mucho cuidado de no dañar la duramadre.
- Una vez que se retira el colgajo óseo, agregue un trozo fresco de espuma de gel saturada de solución salina a la corteza. Agregue unas gotas de solución salina para evitar que la espuma de gel se seque, ya que esto causará daño al tejido subyacente.
4. Inyecciones virales
- Realizar inyecciones virales utilizando un aparato estereotáxico.
- Preparar AAV1. CaMKII.0.4.Cre (título de 3 × 1013 copias del genoma (GC)/ml) a 1:5.000 por diluciones seriadas en solución salina.
- Prepare la mezcla de AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) y AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (título de 5 × 1012 GC/mL) en un pequeño trozo de parafilm.
- Llene una pipeta de vidrio biselada estéril con un tamaño de punta de 20 μm con la mezcla de virus colocando suavemente la pipeta sobre la solución.
- Baje la pipeta para que solo toque la superficie del cerebro y continúe bajando durante 200-300 μm adicionales para inyecciones de L2/3. Utilizando un sistema de dispensación de microinyección intracelular (consulte la Tabla de Materiales), inyecte presión 12-15 veces durante 2 minutos (20 psi, duración del pulso de 9 ms). Observe el menisco en la caída de la pipeta con cada inyección para asegurarse de que la pipeta no esté bloqueada.
- Una vez inyectada, deje la pipeta en el cerebro durante 4-5 minutos para evitar el reflujo. Retraiga lentamente la pipeta.
- Repita las inyecciones en 2-3 sitios (aproximadamente 500 μm de distancia).
- Deseche las pipetas de vidrio, parafilm, puntas de pipeta y tubos de microfuge utilizados para diluciones en serie del virus Cre en lejía al 10%.
5. Implantación de ventana craneal
- Retire cualquier espuma de gel y use una pequeña tira de tiras de esponja para absorber cualquier solución salina restante.
- Agregue unas gotas del antibiótico enrofloxacina (22,7 μg / ml) a la abertura y deje que permanezca allí durante 1 min. Después de 1 min, use un trozo fresco de tira de esponja para absorber cualquier enrofloxacina restante. Repita este proceso dos veces más.
- Después del tercer lavado, agregue unas gotas de solución salina a la abertura y deje que permanezca allí durante 1 minuto. Después de 1 min, use un trozo fresco de tira de esponja para absorber cualquier solución salina restante. Repita este proceso de lavado dos veces más y después del tercer lavado, agregue una pequeña gota de solución salina a la abertura.
- Coloque el vidrio de la cubierta sobre la abertura. Use fórceps para asegurarse de que el vidrio esté enrasado sobre la abertura para obtener imágenes de buena calidad.
- Mientras mantiene suavemente el vidrio en su lugar, aplique gel adhesivo de cianoacrilato (Tabla de materiales) alrededor del perímetro del vidrio para sellar los bordes de la ventana al cráneo. Asegúrese de no dejar que el pegamento se filtre debajo del vidrio de la cubierta y mantenga la mayor cantidad de pegamento fuera de la superficie del vidrio de la cubierta como sea posible.
- Aplique una capa de súper pegamento sobre el gel adhesivo. Agregue una capa de líquido de cemento dental sobre el pegamento para permitir que se endurezca.
- Tome una placa de cabeza tipo helicóptero del tamaño adecuado y aplique una capa delgada de pegamento alrededor de la abertura central. Coloque la placa de la cabeza sobre el vidrio de la cubierta y deje que el pegamento se seque brevemente.
- En un tubo de microfuge de 1.5 mL, agregue polvo de cemento dental a la marca de 0.1 mL en el tubo. Agregue 7-8 gotas de curado rápido, adhesivo instantáneo y mezcle. Introducir en una jeringa de 1 ml con una aguja de 19 G que se haya cortado para crear una abertura más grande.
- Inyecte la mezcla a través de los orificios laterales de la barra del helicóptero hasta que se filtre desde cada lado. Aplique la mezcla de cemento dental / adhesivo al resto del cráneo expuesto para sujetar la placa de la cabeza al cráneo, lo que reducirá los artefactos de movimiento durante las imágenes.
- Deje que la mezcla se seque al aire durante al menos 15 minutos.
- Inyecte al ratón 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea para ayudar en la recuperación.
6. Operación posterior
- Retire el ratón del marco estereotáxico y devuélvalo a su jaula.
- Coloque una parte de la jaula sobre una manta de recirculación de agua, almohadillas térmicas de gel espacial o almohadillas isotérmicas para ayudar con la recuperación.
- Proporcione al animal una pequeña ración de pellets de alimentos y alimentos húmedos, además de su dieta regular, para ayudar aún más en la recuperación. Agregue nuevos gránulos de alimentos y alimentos húmedos cada día después de la cirugía durante la duración de la recuperación.
- El día después de la cirugía, inyecte a los ratones una vez con 5 mg / kg de carprofeno y 5 mg / kg de enrofloxacina.
- En los días 2-6, inyecte a los ratones una vez con 5 mg / kg de carprofeno y dos veces con 5 mg / kg de enrofloxacina, en espera de la aprobación de la IACUC local. Separe las inyecciones de enrofloxacina por lo menos 8 h.
- En los días 7-20, inyecte a los ratones diariamente con 5 mg / kg de carprofeno.
7. Habituación animal para imágenes
- El día 14 después de la cirugía, examine la ventana craneal para obtener claridad óptica. No use ratones con ventanas poco claras o dañadas (es decir, angiogénesis excesiva).
- Compruebe la expresión de tdTomato bajo un microscopio de fluorescencia. Si se pueden identificar células marcadas, proceda con la habituación animal.
- Primer día de habituación (manipulación)
- Sostenga el ratón durante unos minutos y devuélvalo a su jaula después de manipularlo. Repita el manejo tres veces con un intervalo de 15 minutos entre las sesiones.
- Después del tercer ensayo, habitúe al ratón envolviendo al animal en un pequeño trozo de tela.
- Mantenga el ratón envuelto en tela durante aproximadamente 1 min.
- Después de la prueba, devuelva el ratón a su jaula. Repita este proceso dos veces más, lo que permite un intervalo de 15 minutos entre cada ensayo.
- Segundo día de habituación
- Pesa y registra el peso del ratón.
- Envuelva el ratón en un paño y asegúrelo a través de su placa de cabeza al brazo de fijación de la cabeza de la jaula casera levantada por aire.
- Deje la jaula casera expuesta a la luz.
- Permita que el ratón permanezca asegurado en la jaula de la casa móvil durante 15 minutos.
- Después de la habituación, retire el ratón de la jaula doméstica y apague el flujo de aire.
- Pesa el ratón y devuélvelo a su jaula. Tenga cuidado de incluir solo ratones que no pierdan más del 10% de su peso corporal. Excluya a los ratones que pierden más del 10% de su peso durante cualquier día de habituación de los experimentos de imágenes.
- Tercer día de habituación y más allá
- Pese y registre el peso del ratón antes de asegurarlo a la jaula doméstica levantada por aire.
- Asegure el ratón a la jaula doméstica levantada por aire.
- Cubra la jaula de la casa con algo que proporcione un interior oscuro, como una caja, y permita que el mouse permanezca asegurado durante 30 minutos.
- Después de 30 minutos, descubra la jaula doméstica, retire el mouse y apague el flujo de aire.
- Pesar y registrar el peso del ratón después de la habituación.
- Repita este proceso todos los días, aumentando la duración de la fijación del ratón a la jaula doméstica en 15 minutos. Continúe este proceso hasta que el ratón pueda ser asegurado a la jaula doméstica durante 1,5 h, ya que esta es la duración aproximada de una sesión de imágenes de dos fotones.
- Para habituar al ratón al ruido, realice algunas sesiones de habituación en el microscopio para aclimatar el ratón a los sonidos de los espejos de escaneo láser. Excluir a los ratones que no logran habituarse lo suficiente (es decir, vocalizaciones y defecación inducida por el estrés).
8. Imágenes multifotónicas
- Comience la toma de imágenes 3 semanas después de la cirugía para permitir que la ventana se despeje.
- Realice imágenes en un microscopio multifotón hecho a medida o disponible comercialmente equipado con un láser Ti: Sapphire. Adquiera imágenes utilizando un objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (NA).
NOTA: La obtención de imágenes de dos canales se logra mediante el uso de un espejo dicroico de 565 nm y dos tubos fotomultiplicadores externos. Se utiliza un filtro de paso de banda 535/50 para detectar la emisión de GCaMP6f, y un filtro de paso de banda 610/75 se utiliza para detectar tdTomato. Se utilizó un objetivo de inmersión en agua de 25x (1.05 NA) y escáneres resonantes para adquirir las imágenes que se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Cada región de interés consistía en una pila de imágenes separadas axialmente por 1 μm. Cada sección óptica se recogió a 512 x 512 píxeles, 0,18 μm/píxel. Las imágenes se adquirieron de la región de la extremidad anterior de la corteza motora primaria según lo determinado por coordenadas estereotáxicas. - Establezca la longitud de onda del láser en 920 nm (990 nm si se utiliza un GECI desplazado al rojo).
- Coloque el ratón en la jaula de la casa móvil y sujete la placa de la cabeza al brazo de fijación de la cabeza.
- Agregue unas gotas de agua al centro de la ventana.
- Usando el modo de campo amplio del microscopio, seleccione 2-3 posiciones de vasculatura fácilmente identificable. Guarde las imágenes de estos vasos sanguíneos y registre las coordenadas X e Y que aparecen en el controlador del motor para reubicar las dendritas marcadas con tdTomato para sesiones de imágenes posteriores. Ajuste las coordenadas X e Y cada vez para realinearse con las imágenes guardadas de los vasos sanguíneos.
- Una vez que se haya tomado una imagen de la vasculatura y se hayan registrado las posiciones, localice las regiones con neuronas que expresan tdTomato (Figura 1). Imagen de las estructuras sinápticas (dendritas y axones) de las neuronas y la actividad de GCaMP6f en los astrocitos.
NOTA: Las dendritas servirán como puntos de referencia para regresar de manera confiable a las mismas regiones y obtener imágenes de las mismas dendritas y astrocitos durante días repetidos. No se observó ningún cambio detectable en el plano de imagen con fijación estable de la cabeza y después de la habituación a la fijación de la cabeza. El desplazamiento que se produce en las direcciones X e Y se corrige por movimiento. - Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula.
NOTA: Los ratones generalmente se mantienen en el alcance durante un máximo de 2 h. Cuando la imagen dura mucho tiempo, el agua debajo del objetivo puede secarse. Se debe agregar agua durante los experimentos. Alternativamente, se puede usar un gel ultrasónico en lugar de agua.
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Representative Results
La calidad de la ventana craneal se puede evaluar por lo nítidas que aparecen las estructuras neuronales. En una buena ventana, las espinas dendríticas son claramente visibles (Figura 1). Con los datos estructurales y posicionales almacenados, el mismo animal puede ser fotografiado repetidamente durante días, semanas o meses para examinar las mismas células (Figura 1). Las imágenes de la Figura 1 se obtuvieron de la región de la extremidad anterior de la corteza motora primaria (en una ventana de 5 mm). Se puede medir una variedad de parámetros, incluida la densidad y la dinámica de las espinas dendríticas y los boutons axonales para estudiar la plasticidad sináptica estructural. La actividad astrocítica se puede estudiar analizando la dinámica espaciotemporal de la señalización del calcio (Figura 2). Dependiendo de las capacidades del microscopio (es decir, escáneres resonantes, piezoeléctrico que controlan el objetivo) y la pregunta experimental, las imágenes de lapso de tiempo se pueden realizar en un solo plano focal o en un volumen o multirregión para monitorear la actividad del calcio a la frecuencia de adquisición deseada.
Figura 1: Imágenes repetidas de dendritas y astrocitos durante días. Una dendrita que expresa tdTomato (magenta) permite la identificación y la obtención repetida de imágenes de astrocitos que expresan GCaMP6f (blanco) en las proximidades. La actividad de Ca2+ dentro de los astrocitos se muestra en diferentes puntos de tiempo en diferentes días. La plasticidad estructural sináptica se puede visualizar simultáneamente. Dos nuevas espinas que aparecieron el día 2 están marcadas con flechas. Mientras que una columna persistió y fue visible en el Día 5 (flecha azul), la otra columna vertebral fue eliminada (flecha verde). Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de señalización astrocítica de calcio. Imágenes que muestran la actividad de Ca2+ de un astrocito que expresa GCaMP6f. Los paneles muestran la actividad de Ca2+ registrada a partir de un volumen de 4 μm en diferentes puntos de tiempo durante la adquisición. La señalización de calcio en procesos y microdominios se puede observar durante los períodos de descanso. Un evento global que abarca toda la célula se puede observar durante un combate de locomoción a los 188 s. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, hemos presentado un protocolo para la implantación de ventanas craneales crónicas para imágenes in vivo de astrocitos corticales y neuronas en ratones despiertos y con la cabeza restringida en una jaula casera levantada por aire. Se han proporcionado ejemplos específicos de la aplicación de ventana craneal para imágenes de astrocitos que expresan GECI y estructuras sinápticas neuronales. Con el uso de la microscopía multifotónica, la dinámica de señalización astrocítica del calcio y la dinámica sináptica estructural se pueden registrar repetidamente durante días.
Una ventana craneal crónica proporciona una buena calidad de imagen óptica y permite realizar múltiples sesiones de imágenes de las mismas estructuras neuronales y gliales. El enfoque también permite realizar inyecciones virales intracraneales antes de cubrir la craneotomía con un vidrio de cubierta.
Los usuarios deben ser conscientes de una serie de limitaciones incurridas a través de la implantación de ventanas craneales crónicas. Se necesita experiencia y mucha práctica para lograr una ventana de alta calidad y garantizar la supervivencia de los animales. Además, la cirugía es invasiva y puede dar lugar a una respuesta inflamatoria. El tratamiento farmacológico durante la cirugía y la recuperación postquirúrgica incluye medicamentos antiinflamatorios y antibióticos31. El uso de medicamentos antiinflamatorios puede no ser apropiado en estudios que investigan modelos de neuroinflamación, ya que estos medicamentos también pueden afectar el fenómeno en estudio.
Más recientemente, se ha demostrado que la linfangiogénesis meníngea ocurre en respuesta a la implantación de la ventana craneal32. Por lo tanto, la ventana craneal crónica podría no ser aceptable para los estudios que investigan los vasos linfáticos meníngeos. Es importante destacar que es necesario un período de espera de 2-3 semanas después de la cirugía antes de los experimentosde imágenes 31,33. Además, la edad de los ratones, así como el tiempo de recuperación posterior a la operación, limita la capacidad de obtener imágenes de eventos de desarrollo muy tempranos. Si bien las ventanas craneales se pueden implantar en ratones más jóvenes (P15-21)34, se deben considerar los posibles efectos secundarios, como la inflamación.
Como alternativa a la ventana craneal crónica, también se pueden hacer preparaciones de cráneo adelgazadas. Este método da como resultado el adelgazamiento del cráneo sobre la región de interés antes de la obtención de imágenes. Una ventana del cráneo adelgazada es menos invasiva y supera la necesidad de administración de medicamentos antiinflamatorios, por lo que es una opción en los estudios que investigan modelos de neuroinflamación e interacciones neuroinmunes. Sin embargo, si se desean imágenes repetidas, el cráneo debe volver a adelgazarse antes de la obtención de imágenes, y el hueso solo se puede volver a adelgazar un número limitado de veces antes de que la calidad de la imagen se degrade35.
Aunque se ha descrito una versión modificada de un método de cráneo delgado reforzado que no requiere reafilado36, un grosor de cráneo no uniforme puede causar aberraciones esféricas, lo que resulta en la distorsión de las estructuras fluorescentes37. Así, cuando se registran mediciones cuantitativas, como la dinámica de señalización del calcio38 o los niveles de proteínas sinápticas27, a diferencia de la identificación de estructuras como las espinas dendríticas, la ventana craneal crónica proporciona una preparación ópticamente más estable y fiable. Así, para la imagen longitudinal, in vivo, la inserción de ventanas craneales es el método superior para examinar los cambios resultantes del tratamiento farmacológico39, el entrenamiento en un paradigma conductual 4,25 y la remodelación sináptica en trastornos neurológicos11,27.
El procedimiento descrito es técnicamente desafiante y proporciona una barrera para la adquisición de imágenes de calidad. Se debe tener extremo cuidado en cada paso para garantizar que la ventana permanezca libre de infección y se evite el daño al tejido subyacente. Esto incluye un raspado suave del tejido conectivo en el cráneo, tomar descansos adecuados para enfriar el hueso al perforar, garantizar un adelgazamiento uniforme para facilitar la extracción fácil del hueso, prevenir la hinchazón del cerebro y tener mucho cuidado para no dañar la duramadre durante la cirugía. Solo las mejores preparaciones de ventanas permanecen ópticamente transparentes durante períodos más largos de imágenes.
Si bien los cambios en las estructuras sinápticas se pueden obtener imágenes en ratones anestesiados durante días, esto no se prefiere cuando se examina la señalización de calcio de astrocitos, ya que se ha demostrado que la anestesia interrumpe la señalización de calcio de astrocitos in vivo40. Para realizar imágenes in vivo en ratones despiertos y con la cabeza restringida, es esencial habituar al animal a las condiciones de imagen en la jaula de la casa móvil, la cinta de correr que flota libremente, la bola de espuma de poliestireno levantada por aire u otro aparato. La habituación adecuada no solo reducirá el estrés durante las imágenes, sino que también actuará para minimizar los artefactos de movimiento durante las sesiones de imágenes.
En resumen, la microscopía multifotónica in vivo a través de una ventana craneal crónica es una herramienta útil para estudiar los cambios estructurales y funcionales de las células en la corteza. Usando colorantes fluorescentes específicos de la célula y reporteros, es posible estudiar la morfología celular, las interacciones y la actividad. Con la imagen longitudinal permitida por las ventanas craneales crónicas, es posible examinar cómo las estructuras sinápticas cambian y se desarrollan con el tiempo13,14. Utilizando el protocolo aquí presentado, es posible examinar la dinámica de señalización del calcio en astrocitos debido a la estimulación sensorial23,38, locomoción o sobresalto 6,41, enfermedad15,42, u otros parámetros de interés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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