Summary
Présenté ici est un protocole pour l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale des cellules du cerveau chez des souris éveillées et retenues par la tête.
Abstract
Pour bien comprendre la physiologie cellulaire des neurones et de la glie chez les animaux qui se comportent, il est nécessaire de visualiser leur morphologie et d’enregistrer leur activité in vivo chez les souris qui se comportent. Cet article décrit une méthode d’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour permettre l’imagerie longitudinale des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. En combinaison avec des stratégies génétiques et des injections virales, il est possible de marquer des cellules et des régions d’intérêt spécifiques avec des marqueurs structurels ou physiologiques. Ce protocole montre comment combiner des injections virales pour marquer les neurones à proximité des astrocytes exprimant GCaMP6 dans le cortex pour l’imagerie simultanée des deux cellules à travers une fenêtre crânienne. L’imagerie multiphotonique des mêmes cellules peut être effectuée pendant des jours, des semaines ou des mois chez des animaux éveillés et se comportant. Cette approche fournit aux chercheurs une méthode pour visualiser la dynamique cellulaire en temps réel et peut être appliquée pour répondre à un certain nombre de questions en neurosciences.
Introduction
La capacité d’effectuer une microscopie à fluorescence multiphotonique in vivo dans le cortex de souris est primordiale pour l’étude de la signalisation cellulaire et de la structure 1,2,3,4,5,6,7,8,9, de la pathologie de la maladie 10,11 et du développement cellulaire12,13 . Avec l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques, l’imagerie longitudinale est possible, permettant une imagerie répétée des zones corticales pendant des jours, des semaines oudes mois 13,14 chez des animaux vivants. La microscopie multiphotonique est idéale pour l’imagerie in vivo et répétée en raison de l’amélioration du sondage en profondeur et de la réduction des photodommages associés au laser infrarouge utilisé. Cela permet d’étudier la dynamique moléculaire et cellulaire de cellules spécifiques dans diverses régions corticales.
La microscopie multiphotonique a été utilisée pour l’imagerie in vivo de cellules neuronales et gliales chez des souris 15,16,17,18,19,20. Diverses stratégies peuvent être mises en œuvre pour étiqueter des types de cellules et des domaines d’intérêt particuliers. Une approche courante consiste à stimuler l’expression de protéines fluorescentes génétiquement codées d’une manière spécifique à la cellule en utilisant le système de recombinaison Cre-Lox. Cela peut être effectué avec des souris génétiquement modifiées, par exemple en croisant une souris tdTomato « floxed » (Ai14) avec une souris exprimant la Cre-recombinase sous un promoteur d’intérêt21. Alternativement, le marquage spécifique aux cellules et au site peut être réalisé avec des injections virales. Ici, un virus codant pour la Cre recombinase sous un promoteur spécifique à la cellule et un virus codant pour un gène floxé d’intérêt sont injectés dans une région définie. Les types de cellules appropriés recevant les deux vecteurs viraux exprimeront alors le(s) gène(s) souhaité(s). Ces gènes peuvent être des marqueurs structurels, tels que tdTomato, pour visualiser les changements dans la morphologie cellulaire22 ou des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP et / ou RCaMP, pour examiner la dynamiquedu calcium 23. Les méthodes de recombinaison génétique peuvent être appliquées individuellement ou en combinaison pour marquer un ou plusieurs types de cellules. Une troisième approche, ne nécessitant pas de souris transgéniques ou de constructions virales (qui ont une capacité d’emballage limitée), consiste à électroporation in utero des constructions d’ADN24. Selon le moment de l’électroporation, différents types de cellules peuvent être ciblés 25,26,27.
Lors de l’imagerie multiphotonique, les souris peuvent être imagées alors qu’elles sont éveillées ou anesthésiées. L’imagerie des souris éveillées peut être réalisée en sécurisant la souris via une plaque de tête attachée28. Cette approche est rendue moins stressante en permettant un mouvement relativement libre de l’animal à l’aide de méthodes, telles que des balles en polystyrène flottant librement et soutenues par air29, des tapis roulants flottantlibrement 1 ou un système de cage domestique soulevé par air où les souris sont fixées par une plaque de tête attachée et autorisées à se déplacer dans une chambre ouverte30. Pour chacune de ces conditions d’imagerie, il sera d’abord nécessaire d’habituer les souris à la configuration d’imagerie. Cet article décrit la procédure d’accoutumance et d’imagerie à l’aide d’un système de cage domestique soulevé par air.
Ce protocole décrit l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale in vivo dans le cortex. Ici, nous utiliserons des souris qui expriment conditionnellement GCaMP6f dans les astrocytes pour surveiller la dynamique de signalisation du calcium. En outre, cet article décrit la procédure pour les injections virales en utilisant tdTomato comme étiquette pour les neurones. Cela permet de déterminer les changements dans la structure synaptique neuronale et / ou la disponibilité en tant que marqueur structurel permettant l’imagerie répétée du même astrocyte. Tout au long du protocole, des étapes cruciales seront mises en évidence pour assurer la meilleure qualité possible des images obtenues à partir de la microscopie multiphotonique.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l’IACUC au Centre médical de l’Université du Nebraska.
1. Avant la chirurgie
- Préparez des pipettes pour les injections virales. Tirez les capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur de pipette et biseautez la pipette à un angle de 20°. Stériliser les pipettes pendant la nuit.
- Préparez des morceaux frais de mousse de gel stérile en les coupant en petits carrés. Immergez la mousse de gel dans un tube de microfuge stérile contenant 0,5 mL de solution saline. Faire tremper la mousse de gel dans une solution saline pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
- Préparez des morceaux frais de lanières d’éponge en les coupant en fines lanières.
- Vingt minutes avant la chirurgie, injecter par voie intrapéritonéale de 4 à 6 semaines de GLAST-CreER/GCaMP6f des souris de 0,2 mg/kg de dexaméthasone pour prévenir l’enflure du cerveau et 5 mg/kg de carprofène pour réduire l’inflammation.
REMARQUE: Pour induire la recombinaison et l’expression de GCaMP6f dans environ 40% des astrocytes, des souris GLAST-CreER / GCaMP6f ont été injectées avec 100 mg / kg de tamoxifène à 3 semaines pendant 5 jours consécutifs.
2. Début de la chirurgie
- Après 20 min, anesthésier les souris avec 3% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1 L/min pendant environ 1,5 min.
- Une fois anesthésiée, placez la souris sur un cadre stéréotaxique qui repose sur une couverture de recirculation d’eau pour maintenir une température corporelle de 37 ° C tout au long de la chirurgie. Fixez la souris au cadre à l’aide de la pince à museau et des barres d’oreille. Assurez-vous que la pince à museau et les barres d’oreille sont suffisamment stables pour que la tête ne bouge pas pendant la procédure, mais pas si serrées que le crâne soit endommagé.
- Maintenir l’anesthésie avec 1-1,5% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1-2 L / min. Notez que certains animaux peuvent avoir besoin de plus ou moins d’isoflurane pour maintenir la sédation. Surveillez la respiration de l’animal ainsi que ses réflexes aux pincements des orteils et de la queue, et ajustez l’isoflurane de manière appropriée.
- Appliquez une pommade pour les yeux sur chaque œil à l’aide d’un applicateur à pointe de coton pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure.
- À l’aide de coupe-rongeurs, rasez les cheveux du cou jusqu’au-delà des yeux. Soyez prudent pour vous assurer que les moustaches de l’animal ne sont pas coupées accidentellement.
- Nettoyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’iode, suivi d’un tampon de préparation à l’alcool.
- À l’aide de pinces en tissu stérile et de ciseaux chirurgicaux, coupez et retirez la peau des sutures frontales antérieures à la bregma jusqu’au lambda.
- Une fois la peau enlevée, ajoutez environ 0,1 mL de xylocaïne à 1 % (lidocaïne avec épinéphrine 1:200 000) au crâne pour minimiser les saignements du crâne.
- À l’aide d’une lame chirurgicale stérile en acier au carbone de taille 11 attachée à un manche, grattez doucement le tissu conjonctif du crâne. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous retirez le tissu conjonctif près du bord du crâne, car tout tissu restant pourrait empêcher une forte adhérence du verre ou de la plaque de tête plus tard.
- Utilisez des pinces à tissu stérile pour enlever le tissu conjonctif lâche du crâne.
- À l’aide d’applicateurs de pointe en coton stériles, nettoyez toute xylocaïne restante du crâne.
- Une fois terminé, dégraissez soigneusement le crâne à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton trempé dans de l’acétone. Utilisez de l’air comprimé pour sécher immédiatement le crâne.
3. Craniotomie
- À l’aide d’un marqueur de point fin et d’une règle, mesurez la taille appropriée pour l’ouverture à l’emplacement souhaité. Confirmer la taille de l’ouverture en la comparant à la taille du verre de couverture (3 ou 5 mm de diamètre); assurez-vous que l’ouverture est légèrement plus petite que la taille du verre de couverture.
- À l’aide d’une perceuse dentaire, tracez progressivement le contour de l’ouverture, en amincissant l’os. Percez lentement pour éviter de percer l’os et percez en cercles concentriques pour faciliter même l’amincissement de l’os.
- Après chaque passage concentrique, ajoutez une goutte ou deux de solution saline stérile à la zone percée. Laissez la solution saline reposer pendant au moins 10 s pour empêcher l’os de surchauffer et d’endommager la dure-mère sous-jacente.
- Utilisez un applicateur de pointe en coton stérile pour absorber toute solution saline restante. Soufflez de l’air comprimé sur la zone pour vous assurer que toute la solution saline restante s’est évaporée avant de reprendre le forage. Faites-le pour souffler les débris osseux qui restent.
- Répétez les étapes 3.2 à 3.4 jusqu’à ce que l’os soit correctement aminci pour être enlevé.
- Assurez-vous que l’os est correctement aminci pour être retiré en poussant doucement sur la zone centrale de l’os avec une pince fine pour vérifier que le crâne aminci bouge. La vascularisation sous-jacente doit être visible à l’endroit où le forage a eu lieu. Observez que l’os peut sembler se fissurer là où l’amincissement s’est produit.
REMARQUE: L’entraînement à ce stade est crucial pour identifier quand l’os a été aminci de manière appropriée. - Avant d’essayer de retirer l’os, vérifiez la souris pour vous assurer qu’elle est complètement sous sédation. Sinon, augmentez progressivement l’entretien de l’isoflurane pour prévenir l’enflure du cerveau lors de l’ablation de l’os.
- Ajouter un petit morceau de mousse de gel saturé de solution saline au crâne aminci. Ajouter une ou deux gouttes supplémentaires de solution saline au crâne aminci.
REMARQUE: Avoir beaucoup de solution saline sur le crâne aminci aide à réduire les saignements et à protéger la dure-mère lors du retrait du lambeau osseux. - À l’aide d’une lame miniature pointue à 15°, insérez soigneusement la lame dans l’os aminci et coupez-la le long de l’os aminci. Gardez la mousse de gel imbibée de solution saline, prête à arrêter les saignements qui peuvent survenir.
- À l’aide d’une pince, soulevez et retirez soigneusement l’os. Soyez aussi doux que possible pour éviter d’endommager les tissus et le système vasculaire sous-jacents. Prenez un soin extrême à ne pas endommager la dure-mère.
- Une fois le lambeau osseux retiré, ajoutez un morceau frais de mousse de gel saturé de solution saline au cortex. Ajoutez quelques gouttes de solution saline pour empêcher la mousse de gel de se dessécher, car cela endommagerait le tissu sous-jacent.
4. Injections virales
- Effectuer des injections virales à l’aide d’un appareil stéréotaxique.
- Préparez AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titre de 3 × 1013 copies du génome (GC)/mL) à 1:5 000 par dilutions en série dans une solution saline.
- Préparez le mélange d’AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) et AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titre de 5 × 1012 GC/mL) sur un petit morceau de parafilm.
- Remplissez une pipette en verre biseauté stérile d’une taille de pointe de 20 μm avec le mélange de virus en plaçant doucement la pipette sur la solution.
- Abaissez la pipette de sorte qu’elle touche simplement la surface du cerveau et continuez à baisser pendant 200 à 300 μm supplémentaires pour les injections de L2/3. À l’aide d’un système de distribution de micro-injection intracellulaire (voir le tableau des matériaux), injectez sous pression 12 à 15 fois sur 2 min (20 psi, durée d’impulsion de 9 ms). Observez le ménisque dans la pipette tomber à chaque injection pour s’assurer que la pipette n’est pas bloquée.
- Une fois injecté, laissez la pipette dans le cerveau pendant 4 à 5 minutes pour éviter tout reflux. Rétractez lentement la pipette.
- Répétez les injections à 2-3 sites (à environ 500 μm d’intervalle).
- Jetez les pipettes en verre, le parafilm, les embouts de pipette et les tubes de microfuge utilisés pour les dilutions en série du virus Cre dans de l’eau de Javel à 10%.
5. Implantation de la fenêtre crânienne
- Retirez toute mousse de gel et utilisez une petite bande de bandes d’éponge pour absorber toute solution saline restante.
- Ajouter quelques gouttes de l’antibiotique enrofloxacine (22,7 μg/mL) à l’ouverture et laisser y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber l’enrofloxacine restante. Répétez ce processus deux fois de plus.
- Après le troisième lavage, ajoutez quelques gouttes de solution saline à l’ouverture et laissez-la y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber toute solution saline restante. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus et après le troisième lavage, ajoutez une petite goutte de solution saline à l’ouverture.
- Placez le verre de couverture sur l’ouverture. Utilisez des pinces pour vous assurer que le verre est affleurant sur l’ouverture afin d’obtenir des images de bonne qualité.
- Tout en maintenant doucement le verre en place, appliquez un gel adhésif cyanoacrylate (Table des matériaux) autour du périmètre du verre pour sceller les bords de la fenêtre au crâne. Assurez-vous de ne pas laisser la colle s’infiltrer sous le verre de couverture et gardez autant de colle que possible sur la surface du verre de couverture.
- Appliquez une couche de super colle sur le gel adhésif. Ajouter une couche de liquide de ciment dentaire sur la colle pour lui permettre de durcir.
- Prenez une plaque de tête de type hélicoptère de taille appropriée et appliquez une fine couche de colle autour de l’ouverture centrale. Placez la plaque de tête sur le verre de couverture et laissez la colle sécher brièvement.
- Dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter de la poudre de ciment dentaire à la marque de 0,1 mL sur le tube. Ajouter 7 à 8 gouttes d’adhésif instantané à durcissement rapide et mélanger. Aspirer dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 19 G qui a été coupée pour créer une plus grande ouverture.
- Injecter le mélange à travers les trous latéraux de la barre de l’hélicoptère jusqu’à ce qu’il s’infiltre de chaque côté. Appliquez le mélange de ciment dentaire et d’adhésif sur le reste du crâne exposé pour fixer la plaque frontale au crâne, ce qui réduira les artefacts de mouvement pendant l’imagerie.
- Laisser sécher le mélange à l’air libre pendant au moins 15 min.
- Injecter à la souris 0,5 mL de solution saline par voie sous-cutanée pour aider à la récupération.
6. Après l’opération
- Retirez la souris du cadre stéréotaxique et retournez-la dans sa cage.
- Placez une partie de la cage sur une couverture de recirculation d’eau, des coussins chauffants en gel d’espace ou des coussinets isothermes pour aider à la récupération.
- Fournissez à l’animal une petite aide de granulés alimentaires et de nourriture humide, en plus de son régime alimentaire régulier, pour aider davantage à la récupération. Ajoutez de nouveaux granulés alimentaires et des aliments humides chaque jour après la chirurgie pendant toute la durée de la récupération.
- Le lendemain de la chirurgie, injectez une fois aux souris 5 mg / kg de carprofène et 5 mg / kg d’enrofloxacine.
- Aux jours 2 à 6, injecter aux souris une fois 5 mg/kg de carprofène et deux fois 5 mg/kg d’enrofloxacine, en attendant l’approbation de l’IACUC local. Séparer les injections d’enrofloxacine d’au moins 8 h.
- Les jours 7 à 20, injecter quotidiennement aux souris 5 mg / kg de carprofène.
7. Habituation des animaux pour l’imagerie
- Le jour 14 après la chirurgie, examinez la fenêtre crânienne pour la clarté optique. N’utilisez pas de souris dont les fenêtres ne sont pas claires ou autrement endommagées (c.-à-d. angiogenèse excessive).
- Vérifiez l’expression de tdTomato au microscope à fluorescence. Si des cellules marquées peuvent être identifiées, procédez à l’accoutumance animale.
- Premier jour d’accoutumance (manipulation)
- Tenez la souris pendant quelques minutes et retournez-la dans sa cage après l’avoir manipulée. Répétez la manipulation trois fois avec un intervalle de 15 minutes entre les séances.
- Après le troisième essai, habituez la souris en l’enveloppant dans un petit morceau de tissu.
- Tenez la souris enveloppée dans un chiffon pendant environ 1 min.
- Après l’essai, ramenez la souris dans sa cage. Répétez ce processus deux fois de plus, en permettant un intervalle de 15 minutes entre chaque essai.
- Deuxième jour d’accoutumance
- Pesez et enregistrez le poids de la souris.
- Enveloppez la souris dans un chiffon et fixez-la via sa plaque de tête au bras de fixation de la tête de la cage domestique soulevée par air.
- Laissez la cage de la maison exposée à la lumière.
- Laissez la souris rester sécurisée dans la cage du mobil-home pendant 15 min.
- Après l’accoutumance, retirez la souris de la cage de la maison et éteignez le flux d’air.
- Pesez la souris et retournez-la dans sa cage. Prenez soin de n’inclure que les souris qui ne perdent pas plus de 10% de leur poids corporel. Exclure les souris qui perdent plus de 10% de leur poids au cours de n’importe quelle journée d’accoutumance des expériences d’imagerie.
- Troisième jour d’accoutumance et au-delà
- Pesez et enregistrez le poids de la souris avant de la fixer à la cage domestique soulevée par air.
- Fixez la souris à la cage de la maison soulevée par air.
- Couvrez la cage de la maison avec quelque chose qui fournira un intérieur sombre, comme une boîte, et laissez la souris rester sécurisée pendant 30 minutes.
- Après 30 minutes, découvrez la cage de la maison, retirez la souris et coupez le flux d’air.
- Pesez et enregistrez le poids de la souris après l’accoutumance.
- Répétez ce processus tous les jours, en augmentant de 15 minutes la durée pendant laquelle la souris est fixée à la cage de la maison. Continuez ce processus jusqu’à ce que la souris puisse être fixée à la cage domestique pendant 1,5 h, car il s’agit de la durée approximative d’une séance d’imagerie à deux photons.
- Pour habituer la souris au bruit, effectuez quelques séances d’accoutumance sur le microscope pour acclimater la souris aux sons des miroirs à balayage laser. Exclure les souris qui ne s’habituent pas suffisamment (c.-à-d. vocalisations et défécation induite par le stress).
8. Imagerie multiphotonique
- Commencez l’imagerie 3 semaines après la chirurgie pour permettre à la fenêtre de se dégager.
- Effectuez des images sur un microscope multiphoton sur mesure ou disponible dans le commerce équipé d’un laser Ti:Sapphire. Acquérir des images à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA).
REMARQUE: L’imagerie à deux canaux est obtenue à l’aide d’un miroir dichroïque de 565 nm et de deux tubes photomultiplicateurs externes. Un filtre passe-bande 535/50 est utilisé pour détecter les émissions GCaMP6f, et un filtre passe-bande 610/75 est utilisé pour détecter tdTomato. Un objectif d’immersion dans l’eau 25x (1,05 NA) et des scanners résonants ont été utilisés pour acquérir les images illustrées aux figures 1 et 2. Chaque région d’intérêt consistait en une pile d’images séparées axialement par 1 μm. Chaque section optique a été collectée à 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. Les images ont été acquises à partir de la région du membre antérieur du cortex moteur primaire déterminée par les coordonnées stéréotaxiques. - Réglez la longueur d’onde du laser à 920 nm (990 nm si un GECI décalé vers le rouge est utilisé).
- Placez la souris sur la cage de la maison mobile et fixez la plaque frontale au bras de fixation de la tête.
- Ajoutez quelques gouttes d’eau au centre de la fenêtre.
- En utilisant le mode grand champ du microscope, sélectionnez 2-3 positions de vascularisation facilement identifiable. Enregistrez les images de ces vaisseaux sanguins et enregistrez les coordonnées X et Y qui apparaissent sur le contrôleur moteur pour déplacer les dendrites marquées tdTomato pour les séances d’imagerie ultérieures. Ajustez les coordonnées X et Y à chaque fois pour les réaligner avec les images enregistrées des vaisseaux sanguins.
- Une fois la vascularisation imagée et les positions enregistrées, localisez les régions avec des neurones exprimant tdTomato (Figure 1). Image des structures synaptiques (dendrites et axones) des neurones et de l’activité de GCaMP6f dans les astrocytes.
REMARQUE: Les dendrites serviront de repères pour revenir de manière fiable dans les mêmes régions et imager les mêmes dendrites et astrocytes sur des jours répétés. Aucun décalage détectable dans le plan d’imagerie n’a été observé avec une fixation stable de la tête et après accoutumance à la fixation de la tête. Le déplacement qui se produit dans les directions X et Y est corrigé du mouvement. - Après l’imagerie, ramenez la souris dans sa cage.
REMARQUE: Les souris sont généralement maintenues sur la portée pendant un maximum de 2 h. Lorsque l’imagerie dure longtemps, l’eau sous l’objectif peut sécher. De l’eau doit être ajoutée pendant les expériences. Alternativement, un gel à ultrasons peut être utilisé à la place de l’eau.
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Representative Results
La qualité de la fenêtre crânienne peut être évaluée par la netteté des structures neuronales. Dans une bonne fenêtre, les épines dendritiques sont clairement visibles (Figure 1). Une fois les données structurelles et de position stockées, le même animal peut être imagé à plusieurs reprises pendant des jours, des semaines ou des mois pour examiner les mêmes cellules (Figure 1). Les images de la figure 1 ont été obtenues à partir de la région du membre antérieur du cortex moteur primaire (dans une fenêtre de 5 mm). Une variété de paramètres peuvent être mesurés, y compris la densité et la dynamique des épines dendritiques et des boutons axonaux pour étudier la plasticité synaptique structurelle. L’activité astrocytaire peut être étudiée en analysant la dynamique spatio-temporelle de la signalisation calcique (Figure 2). Selon les capacités du microscope (c.-à-d. les scanners résonants, le moteur piézoélectrique contrôlant l’objectif) et la question expérimentale, l’imagerie en accéléré peut être effectuée dans un seul plan focal ou dans un volume ou une multirégion pour surveiller l’activité du calcium à la fréquence d’acquisition souhaitée.
Figure 1 : Imagerie répétée des dendrites et des astrocytes au fil des jours. Une dendrite exprimant tdTomato (magenta) permet l’identification et l’imagerie répétée d’astrocytes exprimant GCaMP6f (blanc) à proximité. L’activitéde Ca 2+ dans les astrocytes est montrée à différents moments et à différents jours. La plasticité structurelle synaptique peut être imagée simultanément. Deux nouvelles épines apparues le jour 2 sont marquées de flèches. Alors qu’une colonne vertébrale persistait et était visible le jour 5 (flèche bleue), l’autre colonne vertébrale était éliminée (flèche verte). Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Imagerie de la signalisation du calcium astrocytaire. Images montrant l’activité ca2+ d’un astrocyte exprimant GCaMP6f. Les panneaux montrent l’activité Ca2+ enregistrée à partir d’un volume de 4 μm à différents moments de l’acquisition. La signalisation du calcium dans les processus et les microdomaines peut être observée pendant les périodes de repos. Un événement global englobant l’ensemble de la cellule peut être observé lors d’un combat de locomotion à 188 s. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons présenté un protocole pour l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques pour l’imagerie in vivo d’astrocytes corticaux et de neurones chez des souris éveillées et retenues sur une cage domestique soulevée par air. Des exemples spécifiques ont été fournis de l’application de la fenêtre crânienne pour l’imagerie des astrocytes qui expriment les GECI et les structures synaptiques neuronales. Avec l’utilisation de la microscopie multiphotonique, la dynamique de signalisation du calcium astrocytaire et la dynamique synaptique structurelle peuvent être enregistrées à plusieurs reprises au cours des jours.
Une fenêtre crânienne chronique offre une bonne qualité d’imagerie optique et permet d’effectuer plusieurs séances d’imagerie des mêmes structures neuronales et gliales. L’approche permet également d’effectuer des injections virales intracrâniennes avant de recouvrir la craniotomie d’un verre de couverture.
Les utilisateurs doivent être conscients d’un certain nombre de limitations encourues lors de l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques. L’expérience et beaucoup de pratique sont nécessaires pour obtenir une fenêtre de haute qualité et pour assurer la survie des animaux. De plus, la chirurgie est invasive et peut entraîner une réponse inflammatoire. Le traitement pharmacologique pendant la chirurgie et la récupération post-chirurgicale comprend des anti-inflammatoires et des antibiotiques31. L’utilisation d’anti-inflammatoires peut ne pas être appropriée dans les études portant sur des modèles de neuroinflammation, car ces médicaments peuvent également affecter le phénomène à l’étude.
Plus récemment, il a été démontré que la lymphangiogenèse méningée se produit en réponse à l’implantation de la fenêtre crânienne32. Ainsi, la fenêtre crânienne chronique pourrait donc ne pas être acceptable pour les études portant sur les vaisseaux lymphatiques méningés. Il est important de noter qu’une période d’attente de 2 à 3 semaines après la chirurgie est nécessaire avant les expériences d’imagerie31,33. De plus, l’âge des souris, ainsi que le temps de récupération post-opératoire, limitent la capacité d’imager des événements de développement très précoces. Bien que les fenêtres crâniennes puissent être implantées chez les souris plus jeunes (P15-21)34, les effets secondaires possibles, tels que l’inflammation, doivent être pris en compte.
Comme alternative à la fenêtre crânienne chronique, des préparations de crâne aminci peuvent également être faites. Cette méthode entraîne l’amincissement du crâne sur la région d’intérêt avant l’imagerie. Une fenêtre crânienne amincie est moins invasive et surmonte le besoin d’administration de médicaments anti-inflammatoires, ce qui en fait un choix dans les études portant sur des modèles de neuroinflammation et d’interactions neuroimmunes. Cependant, si une imagerie répétée est souhaitée, le crâne doit être à nouveau aminci avant l’imagerie, et l’os ne peut être éclairci qu’un nombre limité de fois avant que la qualité de l’image ne se dégrade35.
Bien qu’une version modifiée d’une méthode de crâne mince renforcé qui ne nécessite pas de remontée ait été décrite36, une épaisseur de crâne non uniforme peut provoquer des aberrations sphériques, entraînant la distorsion des structures fluorescentes37. Ainsi, lorsque des mesures quantitatives sont enregistrées, telles que la dynamique de signalisation du calcium38 ou les niveaux de protéines synaptiques27, par opposition à l’identification de structures telles que les épines dendritiques, la fenêtre crânienne chronique fournit une préparation optiquement plus stable et fiable. Ainsi, pour l’imagerie longitudinale in vivo, l’insertion de fenêtres crâniennes est la méthode supérieure pour examiner les changements résultant du traitement médicamenteux39, de l’entraînement dans un paradigme comportemental 4,25 et du remodelage synaptique dans les troubles neurologiques11,27.
La procédure décrite est techniquement difficile et constitue un obstacle à l’acquisition d’images de qualité. Des précautions extrêmes doivent être prises à chaque étape pour s’assurer que la fenêtre reste exempte d’infection et que les dommages au tissu sous-jacent sont évités. Cela comprend le grattage en douceur du tissu conjonctif sur le crâne, la prise de pauses adéquates pour refroidir l’os lors du forage, l’amincissement uniforme pour faciliter l’ablation osseuse, la prévention de l’enflure du cerveau et des soins extrêmes pour ne pas endommager la dure-mère pendant la chirurgie. Seules les meilleures préparations de fenêtres restent optiquement transparentes pendant de plus longues périodes d’imagerie.
Bien que les changements dans les structures synaptiques puissent être imagés chez des souris anesthésiées au fil des jours, cela n’est pas préférable lors de l’examen de la signalisation du calcium des astrocytes, car il a été démontré que l’anesthésie perturbe la signalisation du calcium des astrocytes in vivo40. Pour effectuer une imagerie in vivo chez des souris éveillées et retenues à la tête, il est essentiel d’habituer l’animal aux conditions d’imagerie dans la cage de la maison mobile, le tapis roulant flottant librement, la boule de polystyrène soulevée par air ou tout autre appareil. Une bonne accoutumance réduira non seulement le stress pendant l’imagerie, mais agira également pour minimiser les artefacts de mouvement pendant les séances d’imagerie.
En résumé, la microscopie multiphotonique in vivo à travers une fenêtre crânienne chronique est un outil utile pour étudier les changements structurels et fonctionnels des cellules du cortex. À l’aide de colorants fluorescents et de rapporteurs spécifiques aux cellules, il est possible d’étudier la morphologie, les interactions et l’activité cellulaires. Avec l’imagerie longitudinale permise par les fenêtres crâniennes chroniques, il est possible d’examiner comment les structures synaptiques changent et se développent au fil du temps13,14. En utilisant le protocole présenté ici, il est possible d’examiner la dynamique de la signalisation du calcium dans les astrocytes en raison de la stimulation sensorielle 23,38, de la locomotion ou du sursaut 6,41, de la maladie15,42 ou d’autres paramètres d’intérêt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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