Summary
Qui viene presentato un protocollo per l'impianto di una finestra cranica cronica per l'imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa.
Abstract
Per comprendere appieno la fisiologia cellulare dei neuroni e della glia negli animali che si comportano, è necessario visualizzare la loro morfologia e registrare la loro attività in vivo nei topi che si comportano. Questo documento descrive un metodo per l'impianto di una finestra cranica cronica per consentire l'imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa. In combinazione con strategie genetiche e iniezioni virali, è possibile etichettare cellule e regioni di interesse specifiche con marcatori strutturali o fisiologici. Questo protocollo dimostra come combinare iniezioni virali per etichettare i neuroni nelle vicinanze degli astrociti che esprimono GCaMP6 nella corteccia per l'imaging simultaneo di entrambe le cellule attraverso una finestra cranica. L'imaging multifotonico delle stesse cellule può essere eseguito per giorni, settimane o mesi in animali svegli e che si comportano. Questo approccio fornisce ai ricercatori un metodo per visualizzare le dinamiche cellulari in tempo reale e può essere applicato per rispondere a una serie di domande nelle neuroscienze.
Introduction
La capacità di eseguire la microscopia a fluorescenza multifotone in vivo nella corteccia dei topi è fondamentale per lo studio della segnalazione e della struttura cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8,9, della patologia della malattia 10,11 e dello sviluppo cellulare12,13 . Con l'impianto di finestre craniche croniche, è possibile l'imaging longitudinale, consentendo l'imaging ripetuto delle aree corticali per giorni, settimane o mesi13,14 negli animali vivi. La microscopia multifotonica è ideale per l'imaging in vivo e ripetuto grazie al miglioramento del rilevamento della profondità e al ridotto fotodanno associato al laser a infrarossi utilizzato. Ciò consente lo studio della dinamica molecolare e cellulare di cellule specifiche in varie regioni corticali.
La microscopia multifotonica è stata utilizzata per l'imaging in vivo di cellule neuronali e gliali nei topi 15,16,17,18,19,20. Varie strategie possono essere implementate per etichettare particolari tipi di cellule e aree di interesse. Un approccio comune è quello di guidare l'espressione di proteine fluorescenti geneticamente codificate in modo cellulare specifico utilizzando il sistema di ricombinazione Cre-Lox. Questo può essere eseguito con topi geneticamente modificati, ad esempio, incrociando tdTomato topo "floxed" (Ai14) con un topo che esprime Cre-ricombinasi sotto un promotore di interesse21. In alternativa, l'etichettatura cellulare e sito-specifica può essere ottenuta con iniezioni virali. Qui, un virus che codifica per cre ricombinasi sotto un promotore cellulare specifico e un virus che codifica per un gene floxed di interesse vengono iniettati in una regione definita. I tipi di cellule appropriati che ricevono entrambi i vettori virali esprimeranno quindi il gene o i geni desiderati. Questi geni possono essere marcatori strutturali, come tdTomato, per visualizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare22 o indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP e / o RCaMP, per esaminare la dinamica del calcio23. I metodi di ricombinazione genetica possono essere applicati singolarmente o in combinazione per etichettare uno o più tipi di cellule. Un terzo approccio, che non richiede topi transgenici o costrutti virali (che hanno una capacità di confezionamento limitata), è l'elettroporazione in utero dei costrutti di DNA24. A seconda della tempistica dell'elettroporazione, diversi tipi di celle possono essere presi di mira 25,26,27.
Quando si esegue l'imaging multifotonico, i topi possono essere ripresi mentre sono svegli o anestetizzati. L'imaging dei topi svegli può essere eseguito fissando il mouse tramite una piastra frontale attaccata28. Questo approccio è reso meno stressante consentendo un movimento relativamente libero dell'animale utilizzando metodi, come le sfere di polistirolo29 fluttuanti e supportate dall'aria, i tapis roulant fluttuanti1 o un sistema di gabbie domestiche sollevate ad aria in cui i topi sono fissati da una piastra di testa attaccata e autorizzati a muoversi in una camera aperta30. Per ciascuna di queste condizioni di imaging, sarà prima necessario abituare i topi alla configurazione di imaging. Questo documento descrive l'assuefazione e la procedura di imaging utilizzando un sistema di gabbie domestiche sollevate dall'aria.
Questo protocollo descrive l'impianto di una finestra cranica cronica per l'imaging longitudinale in vivo nella corteccia. Qui, useremo topi che esprimono condizionatamente GCaMP6f negli astrociti per monitorare le dinamiche di segnalazione del calcio. Inoltre, questo documento descrive la procedura per le iniezioni virali utilizzando tdTomato come etichetta per i neuroni. Ciò consente la determinazione dei cambiamenti nella struttura sinaptica neuronale e/o la disponibilità come marcatore strutturale che consente l'imaging ripetuto dello stesso astrocita. Durante tutto il protocollo, verranno evidenziati i passaggi cruciali per garantire la migliore qualità possibile delle immagini ottenute dalla microscopia multifotonica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dalla IACUC presso l'Università del Nebraska Medical Center.
1. Prima dell'intervento chirurgico
- Preparare le pipette per le iniezioni virali. Tirare i capillari di vetro borosilicato usando un estrattore di pipette e smussare la pipetta con un angolo di 20 °. Sterilizzare le pipette durante la notte.
- Preparare pezzi freschi di schiuma gel sterile tagliandoli in piccoli quadrati. Immergere la schiuma di gel in un tubo di microfuga sterile contenente 0,5 ml di soluzione salina. Immergere la schiuma gel in soluzione salina per almeno 30 minuti prima dell'uso.
- Preparare pezzi freschi di strisce di spugna tagliandole a strisce sottili.
- Venti minuti prima dell'intervento chirurgico, iniettare per via intraperitoneale topi GLAST-CreER/GCaMP6f di 4-6 settimane con desametasone da 0,2 mg/kg per prevenire il gonfiore del cervello e 5 mg/kg di carprofene per ridurre l'infiammazione.
NOTA: Per indurre la ricombinazione e l'espressione di GCaMP6f in circa il 40% degli astrociti, ai topi GLAST-CreER/GCaMP6f sono stati iniettati 100 mg/kg di tamoxifene a 3 settimane per 5 giorni consecutivi.
2. Inizio dell'intervento chirurgico
- Dopo 20 min, anestetizzare i topi con il 3% di isoflurano con ossigeno ad una portata di 1 L/min per circa 1,5 min.
- Una volta anestetizzato, posizionare il mouse su una cornice stereotassica che si trova su una coperta di ricircolo dell'acqua per mantenere una temperatura corporea di 37 ° C durante l'intervento chirurgico. Fissare il mouse al telaio utilizzando il morsetto del muso e le barre auricolari. Assicurarsi che il morsetto del muso e le barre auricolari siano abbastanza stabili da non muovere la testa durante la procedura, ma non così stretti da danneggiare il cranio.
- Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-1,5% con ossigeno ad una portata di 1-2 L/min. Si noti che alcuni animali potrebbero aver bisogno di più o meno isoflurano per mantenere la sedazione. Monitorare la respirazione dell'animale e i suoi riflessi ai pizzichi della punta e della coda e regolare l'isoflurano in modo appropriato.
- Applicare l'unguento per gli occhi su ciascun occhio utilizzando un applicatore a punta di cotone per evitare che gli occhi si secchino durante la procedura.
- Usando i trimmer per roditori, radere i capelli dal collo a appena oltre gli occhi. Prestare attenzione per assicurarsi che i baffi dell'animale non vengano tagliati accidentalmente.
- Pulire l'area rasata con un tampone di preparazione allo iodio, seguito da un tampone di preparazione dell'alcol.
- Usando pinze tissutali sterili e forbici chirurgiche, tagliare e rimuovere la pelle dalle suture frontali anteriori al bregma fino posteriormente alla lambda.
- Una volta rimossa la pelle, aggiungere circa 0,1 ml di xilocaina all'1% (lidocaina con epinefrina 1:200.000) al cranio per ridurre al minimo il sanguinamento del cranio.
- Utilizzando una lama chirurgica sterile in acciaio al carbonio 11 attaccata a un manico, raschiare delicatamente il tessuto connettivo dal cranio. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il tessuto connettivo vicino al bordo del cranio, poiché qualsiasi tessuto rimanente potrebbe impedire una forte adesione del vetro o della piastra della testa in seguito.
- Utilizzare pinze di tessuto sterile per rimuovere il tessuto connettivo sciolto dal cranio.
- Utilizzando applicatori sterili a punta di cotone, pulire la xilocaina rimanente dal cranio.
- Una volta completato, sgrassare accuratamente il cranio utilizzando un applicatore sterile a punta di cotone imbevuto di acetone. Utilizzare aria compressa per asciugare immediatamente il cranio.
3. Craniotomia
- Utilizzando un marcatore a punto fine e un righello, misurare la dimensione appropriata per l'apertura nella posizione desiderata. Confermare la dimensione dell'apertura confrontandola con la dimensione del vetro di copertura (3 o 5 mm di diametro); assicurarsi che l'apertura sia leggermente più piccola della dimensione del vetro di copertura.
- Usando un trapano dentale, traccia gradualmente il contorno dell'apertura, assottigliando l'osso. Forare lentamente per evitare di perforare l'osso e forare in cerchi concentrici per facilitare anche l'assottigliamento dell'osso.
- Dopo ogni passaggio concentrico, aggiungere una goccia o due di soluzione salina sterile all'area perforata. Lasciare riposare la soluzione salina per almeno 10 s per evitare che l'osso si surriscaldi e danneggi la dura sottostante.
- Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per assorbire l'eventuale soluzione salina residua. Soffiare aria compressa sull'area per garantire che tutta la soluzione salina rimanente sia evaporata prima di riprendere la perforazione. Fallo per soffiare via i detriti ossei che rimangono.
- Ripetere i passaggi 3.2-3.4 fino a quando l'osso non è adeguatamente assottigliato per la rimozione.
- Assicurarsi che l'osso sia adeguatamente assottigliato per la rimozione spingendo delicatamente sulla zona centrale dell'osso con una pinza fine per verificare che il cranio assottigliato si muova. La vascolarizzazione sottostante dovrebbe essere visibile dove si è verificata la perforazione. Osserva che l'osso può apparire come se si rompesse dove si è verificato l'assottigliamento.
NOTA: L'allenamento in questa fase è fondamentale per identificare quando l'osso è stato assottigliato in modo appropriato. - Prima di tentare di rimuovere l'osso, controllare il mouse per assicurarsi che sia completamente sedato. In caso contrario, aumentare gradualmente il mantenimento dell'isoflurano per prevenire il gonfiore del cervello durante la rimozione dell'osso.
- Aggiungere un piccolo pezzo di schiuma gel satura di soluzione salina al cranio assottigliato. Aggiungere una o due gocce aggiuntive di soluzione salina al cranio assottigliato.
NOTA: Avere molta soluzione salina sopra il cranio assottigliato aiuta a ridurre il sanguinamento e proteggere la dura quando si rimuove il lembo osseo. - Utilizzando una lama in miniatura a 15 ° puntata, inserire con attenzione la lama nell'osso assottigliato e tagliare lungo l'osso assottigliato. Mantenere la schiuma gel imbevuta di soluzione salina, pronta a fermare eventuali sanguinamenti che possono verificarsi.
- Usando la pinza, sollevare e rimuovere con cura l'osso. Sii il più delicato possibile per evitare danni al tessuto sottostante e alla vascolarizzazione. Prestare estrema attenzione a non danneggiare la dura madre.
- Una volta rimosso il lembo osseo, aggiungere un nuovo pezzo di schiuma gel satura di soluzione salina alla corteccia. Aggiungere alcune gocce di soluzione salina per evitare che la schiuma gel si secchi, in quanto ciò causerà danni al tessuto sottostante.
4. Iniezioni virali
- Eseguire iniezioni virali utilizzando un apparato stereotassico.
- Preparare AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titolo di 3 × 1013 copie del genoma (GC)/mL) a 1:5.000 mediante diluizioni seriali in soluzione salina.
- Preparare la miscela di AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5.000) e AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titolo di 5 × 1012 GC/mL) su un piccolo pezzo di parafilm.
- Riempire una pipetta di vetro smussata sterile con una dimensione della punta di 20 μm con la miscela di virus posizionando delicatamente la pipetta sulla soluzione.
- Abbassare la pipetta in modo che tocchi solo la superficie del cervello e continuare ad abbassarsi per ulteriori 200-300 μm per le iniezioni L2/3. Utilizzando un sistema di erogazione di microiniezione intracellulare (vedere la Tabella dei materiali), iniettare a pressione 12-15 volte in 2 minuti (20 psi, durata dell'impulso di 9 ms). Osservare il menisco nella goccia della pipetta ad ogni iniezione per assicurarsi che la pipetta non sia bloccata.
- Una volta iniettato, lasciare la pipetta nel cervello per 4-5 minuti per evitare il riflusso. Ritrarre lentamente la pipetta.
- Ripetere le iniezioni in 2-3 siti (a circa 500 μm di distanza).
- Scartare le pipette di vetro usate, il parafilm, le punte delle pipette e i tubi di microfuga utilizzati per le diluizioni seriali del virus Cre in candeggina al 10%.
5. Impianto della finestra cranica
- Rimuovere qualsiasi schiuma di gel e utilizzare una piccola striscia di strisce di spugna per assorbire qualsiasi soluzione salina rimanente.
- Aggiungere alcune gocce dell'antibiotico enrofloxacina (22,7 μg / mL) all'apertura e lasciarlo rimanere lì per 1 minuto. Dopo 1 minuto, utilizzare un pezzo fresco di striscia di spugna per assorbire l'enrofloxacina rimanente. Ripeti questo processo altre due volte.
- Dopo il terzo lavaggio, aggiungere alcune gocce di soluzione salina all'apertura e lasciarla rimanere lì per 1 minuto. Dopo 1 minuto, utilizzare un pezzo fresco di striscia di spugna per assorbire l'eventuale soluzione salina rimanente. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte e dopo il terzo lavaggio, aggiungere una piccola goccia di soluzione salina all'apertura.
- Posizionare il vetro di copertura sopra l'apertura. Utilizzare una pinza per assicurarsi che il vetro sia a filo sopra l'apertura per ottenere immagini di buona qualità.
- Mentre si tiene delicatamente il vetro in posizione, applicare gel adesivo cianoacrilato (Table of Materials) attorno al perimetro del vetro per sigillare i bordi della finestra sul cranio. Assicurati di non lasciare che la colla penetri sotto il vetro di copertura e tieni quanta più colla possibile dalla superficie del vetro di copertura.
- Applicare uno strato di super colla sul gel adesivo. Aggiungere uno strato di liquido di cemento dentale sopra la colla per consentirne l'indurimento.
- Prendi una piastra di testa di tipo elicottero di dimensioni appropriate e applica un sottile strato di colla attorno all'apertura centrale. Posizionare la piastra di testa sopra il vetro di copertura e lasciare asciugare brevemente la colla.
- In un tubo di microfuga da 1,5 ml, aggiungere polvere di cemento dentale al segno di 0,1 ml sul tubo. Aggiungere 7-8 gocce di adesivo istantaneo a indurimento rapido e mescolare. Aspirare in una siringa da 1 mL con un ago da 19 G che è stato tagliato per creare un'apertura più grande.
- Iniettare la miscela attraverso i fori laterali della barra dell'elicottero fino a quando non filtra da entrambi i lati. Applicare la miscela di cemento dentale / adesivo sul resto del cranio esposto per fissare la piastra frontale al cranio, riducendo gli artefatti di movimento durante l'imaging.
- Lasciare asciugare la miscela all'aria per almeno 15 minuti.
- Iniettare il topo con 0,5 ml di soluzione salina per via sottocutanea per aiutare nel recupero.
6. Post operazione
- Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica e riportarlo nella sua gabbia.
- Posizionare una parte della gabbia su una coperta di ricircolo dell'acqua, piastre riscaldanti in gel per ambienti o cuscinetti isotermici per facilitare il recupero.
- Fornire all'animale un piccolo aiuto di pellet di cibo e cibo umido, oltre alla loro dieta regolare, per aiutare ulteriormente nel recupero. Aggiungi nuovo pellet alimentare e cibo umido ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per tutta la durata del recupero.
- Il giorno dopo l'intervento chirurgico, iniettare i topi una volta con 5 mg / kg di carprofene e 5 mg / kg di enrofloxacina.
- Nei giorni 2-6, iniettare i topi una volta con 5 mg/kg di carprofene e due volte con 5 mg/kg di enrofloxacina, in attesa dell'approvazione da parte della IACUC locale. Separare le iniezioni di enrofloxacina di almeno 8 ore.
- Nei giorni 7-20, iniettare i topi ogni giorno con 5 mg / kg di carprofene.
7. Assuefazione animale per l'imaging
- Il giorno 14 dopo l'intervento chirurgico, esaminare la finestra cranica per la chiarezza ottica. Non usare topi con finestre poco chiare o altrimenti danneggiate (ad esempio, angiogenesi eccessiva).
- Verificare l'espressione di tdTomato al microscopio a fluorescenza. Se le cellule etichettate possono essere identificate, procedere con l'assuefazione animale.
- Primo giorno di assuefazione (manipolazione)
- Tenere il mouse per alcuni minuti e riportarlo nella sua gabbia dopo la manipolazione. Ripeti la gestione tre volte con un intervallo di 15 minuti tra le sessioni.
- Dopo la terza prova, abituare il topo avvolgendo l'animale in un piccolo pezzo di stoffa.
- Tenere il mouse avvolto in un panno per circa 1 minuto.
- Dopo la prova, riportare il topo nella sua gabbia. Ripetere questo processo altre due volte, consentendo un intervallo di 15 minuti tra ogni prova.
- Secondo giorno di assuefazione
- Pesare e registrare il peso del mouse.
- Avvolgere il mouse in un panno e fissarlo tramite la piastra della testa al braccio di fissaggio della testa della gabbia domestica sollevata dall'aria.
- Lascia la gabbia domestica esposta alla luce.
- Lasciare che il mouse rimanga fissato nella gabbia della casa mobile per 15 minuti.
- Dopo l'assuefazione, rimuovere il mouse dalla gabbia domestica e spegnere il flusso d'aria.
- Pesare il mouse e riportarlo nella sua gabbia. Fai attenzione a includere solo i topi che non perdono più del 10% del loro peso corporeo. Escludere i topi che perdono più del 10% del loro peso durante qualsiasi giorno di assuefazione dagli esperimenti di imaging.
- Terzo giorno di assuefazione e oltre
- Pesare e registrare il peso del mouse prima di fissarlo alla gabbia domestica sollevata dall'aria.
- Fissare il mouse alla gabbia domestica sollevata dall'aria.
- Coprire la gabbia domestica con qualcosa che fornirà un interno scuro, come una scatola, e consentire al mouse di rimanere fissato per 30 minuti.
- Dopo 30 minuti, scopri la gabbia di casa, rimuovi il mouse e spegni il flusso d'aria.
- Pesare e registrare il peso del mouse dopo l'assuefazione.
- Ripeti questo processo ogni giorno, aumentando di 15 minuti la durata in cui il mouse è fissato alla gabbia domestica. Continuare questo processo fino a quando il mouse può essere fissato alla gabbia domestica per 1,5 ore poiché questa è la durata approssimativa di una sessione di imaging a due fotoni.
- Per abituare il mouse al rumore, eseguire alcune sessioni di assuefazione al microscopio per abituare il mouse ai suoni degli specchi di scansione laser. Escludere i topi che non riescono ad abituarsi sufficientemente (cioè vocalizzazioni e defecazione indotta dallo stress).
8. Imaging multifotonico
- Iniziare l'imaging 3 settimane dopo l'intervento chirurgico per consentire alla finestra di cancellarsi.
- Eseguire l'imaging su un microscopio multifotone personalizzato o disponibile in commercio dotato di un laser Ti:Sapphire. Acquisisci immagini utilizzando un obiettivo di immersione in acqua ad alta apertura numerica (NA).
NOTA: l'imaging a due canali si ottiene utilizzando uno specchio dicroico da 565 nm e due tubi fotomoltiplicatori esterni. Un filtro passa-banda 535/50 viene utilizzato per rilevare l'emissione di GCaMP6f e un filtro passa-banda 610/75 viene utilizzato per rilevare tdTomato. Un obiettivo di immersione in acqua 25x (1,05 NA) e scanner risonanti sono stati utilizzati per acquisire le immagini mostrate in Figura 1 e Figura 2. Ogni regione di interesse consisteva in una pila di immagini separate assialmente da 1 μm. Ogni sezione ottica è stata raccolta a 512 x 512 pixel, 0,18 μm/pixel. Le immagini sono state acquisite dalla regione dell'arto anteriore della corteccia motoria primaria come determinato dalle coordinate stereotassiche. - Impostare la lunghezza d'onda del laser su 920 nm (990 nm se si utilizza un GECI spostato verso il rosso).
- Posizionare il mouse sulla gabbia della casa mobile e fissare la piastra frontale al braccio di fissaggio della testa.
- Aggiungi qualche goccia d'acqua al centro della finestra.
- Utilizzando la modalità wide-field del microscopio, selezionare 2-3 posizioni di vascolarizzazione facilmente identificabile. Salva le immagini di questi vasi sanguigni e registra le coordinate X e Y che appaiono sul controller del motore per spostare i dendriti marcati con tdTomato per le successive sessioni di imaging. Regola le coordinate X e Y ogni volta per riallinearti con le immagini salvate dei vasi sanguigni.
- Una volta che la vascolarizzazione è stata ripresa e le posizioni registrate, individuare le regioni con neuroni che esprimono tdTomato (Figura 1). Immagine delle strutture sinaptiche (dendriti e assoni) dei neuroni e dell'attività di GCaMP6f negli astrociti.
NOTA: i dendriti serviranno come punti di riferimento per tornare in modo affidabile nelle stesse regioni e fotografare gli stessi dendriti e astrociti per giorni ripetuti. Non è stato osservato alcun cambiamento rilevabile nel piano di imaging con fissazione stabile della testa e dopo l'assuefazione alla fissazione della testa. Lo spostamento che si verifica nelle direzioni X e Y viene corretto dal movimento. - Dopo l'imaging, riportare il mouse nella sua gabbia.
NOTA: i mouse sono in genere tenuti sull'ambito per un massimo di 2 ore. Quando l'imaging dura a lungo, l'acqua sotto l'obiettivo può asciugarsi. L'acqua dovrebbe essere aggiunta durante gli esperimenti. In alternativa, un gel ad ultrasuoni può essere utilizzato al posto dell'acqua.
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Representative Results
La qualità della finestra cranica può essere valutata da quanto appaiono nitide le strutture neuronali. In una buona finestra, le spine dendritiche sono chiaramente visibili (Figura 1). Con i dati strutturali e posizionali memorizzati, lo stesso animale può essere ripreso ripetutamente per giorni, settimane o mesi per esaminare le stesse cellule (Figura 1). Le immagini nella Figura 1 sono state ottenute dalla regione dell'arto anteriore della corteccia motoria primaria (in una finestra di 5 mm). È possibile misurare una varietà di parametri, tra cui la densità e la dinamica delle spine dendritiche e dei bouton assonali per studiare la plasticità sinaptica strutturale. L'attività astrocitica può essere studiata analizzando la dinamica spaziotemporale della segnalazione del calcio (Figura 2). A seconda delle capacità del microscopio (ad esempio, scanner risonanti, motore piezoelettrico che controlla l'obiettivo) e della domanda sperimentale, l'imaging time-lapse può essere eseguito su un singolo piano focale o in un volume o multiregione per monitorare l'attività del calcio alla frequenza di acquisizione desiderata.
Figura 1: Imaging ripetuto di dendriti e astrociti nel corso di giorni. Un dendrite che esprime tdTomato (magenta) consente l'identificazione e l'imaging ripetuto di astrociti che esprimono GCaMP6f (bianchi) nelle immediate vicinanze. L'attivitàdi Ca 2+ all'interno degli astrociti viene mostrata in diversi punti temporali in giorni diversi. La plasticità strutturale sinaptica può essere ripresa contemporaneamente. Due nuove spine apparse il giorno 2 sono contrassegnate da frecce. Mentre una colonna vertebrale persisteva ed era visibile il giorno 5 (freccia blu), l'altra colonna vertebrale è stata eliminata (freccia verde). Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging della segnalazione astrocitica del calcio. Immagini che mostranol'attività di Ca 2+ da un astrocita che esprime GCaMP6f. I pannelli mostrano l'attività di Ca2+ registrata da un volume di 4 μm in diversi punti temporali durante l'acquisizione. La segnalazione del calcio nei processi e nei microdomini può essere osservata durante i periodi di riposo. Un evento globale che comprende l'intera cellula può essere osservato durante un incontro di locomozione a 188 s. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo presentato un protocollo per l'impianto di finestre craniche croniche per l'imaging in vivo di astrociti corticali e neuroni in topi svegli e trattenuti dalla testa su una gabbia domestica sollevata dall'aria. Sono stati forniti esempi specifici dell'applicazione della finestra cranica per l'imaging di astrociti che esprimono GECI e strutture sinaptiche neuronali. Con l'uso della microscopia multifotonica, la dinamica di segnalazione del calcio astrocitico e la dinamica sinaptica strutturale possono essere registrate ripetutamente nel corso dei giorni.
Una finestra cranica cronica fornisce una buona qualità di imaging ottico e consente di eseguire più sessioni di imaging delle stesse strutture neuronali e gliali. L'approccio consente inoltre di eseguire iniezioni virali intracraniche prima di coprire la craniotomia con un vetro di copertura.
Gli utenti devono essere consapevoli di una serie di limitazioni sostenute attraverso l'impianto di finestre craniche croniche. L'esperienza e molta pratica sono necessarie per ottenere una finestra di alta qualità e per garantire la sopravvivenza degli animali. Inoltre, l'intervento chirurgico è invasivo e può provocare una risposta infiammatoria. Il trattamento farmacologico durante l'intervento chirurgico e il recupero post-chirurgico comprende farmaci antinfiammatori e antibiotici31. L'uso di farmaci antinfiammatori potrebbe non essere appropriato negli studi che studiano modelli di neuroinfiammazione in quanto questi farmaci possono anche influenzare il fenomeno in studio.
Più recentemente, la linfangiogenesi meningea ha dimostrato di verificarsi in risposta all'impianto della finestra cranica32. Pertanto, la finestra cranica cronica potrebbe non essere accettabile per gli studi che indagano sui vasi linfatici meningei. È importante sottolineare che è necessario un periodo di attesa di 2-3 settimane dopo l'intervento chirurgico prima degli esperimenti di imaging31,33. Inoltre, l'età dei topi, così come il tempo di recupero post-operatorio, limita la capacità di visualizzare eventi di sviluppo molto precoci. Mentre le finestre craniche possono essere impiantate in topi più giovani (P15-21)34, è necessario considerare possibili effetti collaterali, come l'infiammazione.
In alternativa alla finestra cranica cronica, possono essere fatti anche preparati cranici assottigliati. Questo metodo provoca l'assottigliamento del cranio sulla regione di interesse prima dell'imaging. Una finestra cranica assottigliata è meno invasiva e supera la necessità di somministrazione di farmaci anti-infiammatori, rendendola una scelta negli studi che indagano modelli di neuroinfiammazione e interazioni neuroimmune. Tuttavia, se si desidera un'imaging ripetuto, il cranio deve essere ri-assottigliato prima dell'imaging e l'osso può essere ri-assottigliato solo un numero limitato di volte prima che la qualità dell'immagine si degradi35.
Sebbene sia stata descritta una versione modificata di un metodo a cranio sottile rinforzato che non richiede la rivisitazione36, uno spessore del cranio non uniforme può causare aberrazioni sferiche, con conseguente distorsione delle strutture fluorescenti37. Pertanto, quando vengono registrate misurazioni quantitative, come la dinamica di segnalazione del calcio38 o i livelli di proteine sinaptiche27, al contrario dell'identificazione di strutture come le spine dendritiche, la finestra cranica cronica fornisce una preparazione otticamente più stabile e affidabile. Pertanto, per l'imaging longitudinale in vivo, l'inserimento di finestre craniche è il metodo superiore per esaminare i cambiamenti a seguito del trattamento farmacologico39, l'addestramento in un paradigma comportamentale 4,25 e il rimodellamento sinaptico nei disturbi neurologici11,27.
La procedura descritta è tecnicamente impegnativa e fornisce una barriera per l'acquisizione di immagini di qualità. È necessario prestare estrema attenzione ad ogni passaggio per garantire che la finestra rimanga priva di infezioni e che si evitino danni al tessuto sottostante. Ciò include un delicato raschiamento del tessuto connettivo sul cranio, facendo pause adeguate per raffreddare l'osso durante la perforazione, garantendo un assottigliamento uniforme per facilitare la rimozione dell'osso, prevenendo il gonfiore del cervello e un'estrema cura per non danneggiare la dura madre durante l'intervento chirurgico. Solo le migliori preparazioni per finestre rimangono otticamente trasparenti per periodi più lunghi di imaging.
Mentre i cambiamenti nelle strutture sinaptiche possono essere ripresi nei topi anestetizzati nel corso dei giorni, questo non è preferito quando si esamina la segnalazione del calcio astrocitario poiché l'anestesia ha dimostrato di interrompere la segnalazione del calcio astrocitario in vivo40. Per eseguire l'imaging in vivo in topi svegli e trattenuti dalla testa, è essenziale abituare l'animale alle condizioni di imaging nella gabbia della casa mobile, nel tapis roulant fluttuante, nella palla di polistirolo sollevata dall'aria o in altri apparecchi. Una corretta assuefazione non solo ridurrà lo stress durante l'imaging, ma agirà anche per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante le sessioni di imaging.
In sintesi, la microscopia multifotonica in vivo attraverso una finestra cranica cronica è uno strumento utile per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali delle cellule nella corteccia. Utilizzando coloranti fluorescenti e reporter specifici per le cellule, è possibile studiare la morfologia, le interazioni e l'attività cellulare. Con l'imaging longitudinale consentito dalle finestre craniche croniche, è possibile esaminare come le strutture sinaptiche cambiano e si sviluppano nel tempo13,14. Utilizzando il protocollo qui presentato, è possibile esaminare la dinamica di segnalazione del calcio negli astrociti a causa della stimolazione sensoriale23,38, locomozione o startle 6,41, malattia15,42 o altri parametri di interesse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
