Summary
여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.
Abstract
행동하는 동물에서 뉴런과 글리아교의 세포 생리학을 완전히 이해하려면 행동 마우스에서 형태를 시각화하고 생체 내에서 활동을 기록해야합니다. 이 논문은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을 허용하기 위해 만성 두개골 창을 이식하는 방법을 설명합니다. 유전자 전략 및 바이러스 주사와 조합하여, 특정 세포 및 관심 영역을 구조적 또는 생리학적 마커로 표지할 수 있다. 이 프로토콜은 두개골 창을 통해 두 세포를 동시에 이미징하기 위해 피질에서 GCaMP6 발현 성상 세포 근처의 뉴런을 표지하기 위해 바이러스 주사를 결합하는 방법을 보여줍니다. 동일한 세포의 다중 광자 이미징은 깨어 있고 행동하는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 수행 될 수 있습니다. 이 접근법은 연구자들에게 실시간으로 세포 역학을 보는 방법을 제공하며 신경 과학의 여러 가지 질문에 답하기 위해 적용될 수 있습니다.
Introduction
마우스의 피질에서 생체 내 다광자 형광 현미경을 수행하는 능력은 세포 신호 전달 및 구조 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 질병 병리학 10,11 및 세포 발달 12,13에 대한 연구에 가장 중요합니다. . 만성 두개골 창문을 이식하면 종방향 이미징이 가능하여 살아있는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 피질 부위를 반복적으로 이미징 할 수 있습니다13,14. 다중 광자 현미경 검사는 적외선 레이저와 관련된 향상된 깊이 프로빙 및 감소 된 광손상으로 인해 생체 내에서 반복적 인 이미징에 이상적입니다. 이것은 다양한 피질 영역에서 특정 세포의 분자 및 세포 역학에 대한 연구를 가능하게합니다.
다중 광자 현미경 검사는 마우스 15,16,17,18,19,20에서 신경 및 신경교 세포의 생체 내 영상화에 사용되어 왔다. 특정 세포 유형 및 관심 영역을 라벨링하기 위해 다양한 전략이 구현될 수 있다. 하나의 일반적인 접근법은 Cre-Lox 재조합 시스템을 사용하여 세포 특이적 방식으로 유전적으로 코딩된 형광 단백질의 발현을 유도하는 것이다. 이는 유전적으로 변형된 마우스, 예를 들어, 관심있는 프로모터 21 하에 Cre-recombinase를 발현하는 마우스와 tdTomato "floxed" 마우스 (Ai14)를 교차시킴으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포- 및 부위-특이적 표지는 바이러스 주사로 달성될 수 있다. 여기서, Cre 재조합효소를 코딩하는 바이러스는 세포 특이적 프로모터 및 관심의 플록스 유전자를 코딩하는 바이러스 하에 정의된 영역에 주입된다. 두 바이러스 벡터 모두를 수용하는 적절한 세포 유형은 이어서 원하는 유전자(들)를 발현할 것이다. 이들 유전자는 tdTomato와 같은 구조적 마커로서 세포 형태학(22)의 변화를 보기 위해, 칼슘 역학(23)을 검사하기 위해 GCaMP 및/또는 RCaMP와 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECIs)일 수 있다. 유전적 재조합의 방법은 하나 이상의 세포 유형을 표지하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스 또는 바이러스 구축물(제한된 패키징 용량을 갖는)을 필요로 하지 않는 세 번째 접근법은 DNA 구축물(24)의 utero 전기천공에 있다. 전기천공의 타이밍에 따라, 상이한 셀 타입들이 표적화될 수 있다(25,26,27).
다중 광자 이미징을 수행 할 때, 마우스는 깨어 있거나 마취되는 동안 이미징 될 수 있습니다. 깨어 있는 마우스의 이미징은 부착된 헤드 플레이트(28)를 통해 마우스를 고정시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 자유 부유, 공기 지지형 스티로폼 볼(29), 자유 유동 러닝머신(1), 또는 마우스가 부착된 헤드 플레이트에 의해 고정되고 개방된 챔버(30)에서 이동하도록 허용하는 공랭식 홈 케이지 시스템과 같은 방법을 사용하여 동물의 비교적 자유로운 이동을 허용함으로써 스트레스를 덜 받는다. 이러한 각각의 이미징 조건에 대해, 먼저 이미징 셋업에 마우스를 습관화하는 것이 필요할 것이다. 이 백서에서는 공수 홈 케이지 시스템을 사용한 습관화 및 이미징 절차에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 피질에서 종방향 생체내 영상화를 위한 만성 두개골 창의 이식을 기술한다. 여기에서는 성상세포에서 GCaMP6f를 조건부로 발현하는 마우스를 사용하여 칼슘 신호 역학을 모니터링합니다. 또한,이 논문은 tdTomato를 뉴런의 라벨로 사용하는 바이러스 주사 절차를 설명합니다. 이것은 뉴런 시냅스 구조의 변화 및/또는 동일한 성상세포의 반복적인 이미징을 가능하게 하는 구조적 마커로서의 유용성을 결정할 수 있게 한다. 프로토콜 전반에 걸쳐 다중 광자 현미경에서 얻은 최상의 이미지 품질을 보장하기 위해 중요한 단계가 강조 표시됩니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 네브래스카 대학 의료 센터에서 IACUC가 승인 한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 수술 전
- 바이러스 주사를위한 피펫을 준비하십시오. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산염 유리 모세혈관을 당기고 피펫을 20° 각도로 비스듬히 기울입니다. 피펫을 밤새 살균하십시오.
- 멸균 젤 폼의 신선한 조각을 작은 사각형으로 절단하여 준비하십시오. 겔 폼을 0.5 mL의 식염수를 함유하는 멸균 마이크로퍼지 튜브에 잠수시킨다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 식염수에 젤 폼을 담그십시오.
- 스폰지 스트립의 신선한 조각을 얇은 스트립으로 절단하여 준비하십시오.
- 수술 20분 전에 4-6주령의 GLAST-CreER/GCaMP6f 마우스를 0.2mg/kg의 덱사메타손과 함께 복강내 주사하여 뇌부종을 방지하고 염증을 줄이기 위해 5mg/kg 카프로펜을 주사합니다.
참고: 성상세포의 약 40%에서 GCaMP6f의 재결합 및 발현을 유도하기 위해, GLAST-CreER/GCaMP6f 마우스에 100mg/kg 타목시펜을 3주에 5일 연속으로 주사하였다.
2. 수술 시작
- 20분 후, 마우스를 약 1.5분 동안 1L/min의 유속으로 산소로 3% 이소플루란으로 마취시킨다.
- 일단 마취되면, 마우스를 물 재순환 담요 위에 앉아있는 입체 택시 프레임 위에 올려 놓고 수술 내내 체온을 37 °C로 유지하십시오. 클램프와 이어 바를 사용하여 마우스를 프레임에 고정시킵니다. 클램프와 이어 바가 시술 중에 머리가 움직이지 않을 정도로 안정적이지만 두개골이 손상 될 정도로 단단하지 않은지 확인하십시오.
- 1-2 L / min의 유속으로 산소와 함께 1-1.5 % 이소플루란으로 마취를 유지하십시오. 일부 동물은 진정을 유지하기 위해 다소 이소플루란이 필요할 수 있습니다. 동물의 호흡뿐만 아니라 발가락과 꼬리 꼬집음에 대한 반사 신경을 모니터링하고 이소 플루란을 적절하게 조정하십시오.
- 시술 중에 눈이 마르지 않도록 면봉 도포기를 사용하여 각 눈에 눈 연고를 바르십시오.
- 설치류 트리머를 사용하여 목에서 머리카락을 면도하여 눈을 지나갑니다. 동물의 수염이 실수로 손질되지 않도록주의하십시오.
- 면도 된 부위를 요오드 준비 패드 하나로 닦은 다음 알코올 준비 패드 하나를 사용하십시오.
- 멸균 조직 포셉과 외과 용 가위를 사용하여 브레그마 앞쪽의 전두엽 봉합사에서 람다 (lambda)까지 후방으로 피부를 자르고 제거하십시오.
- 피부가 제거되면 두개골의 출혈을 최소화하기 위해 두개골에 약 0.1mL의 1% 크실로카인(에피네프린 1:200,000을 함유한 리도카인)을 추가합니다.
- 손잡이에 부착된 멸균 크기 11 탄소강 수술용 블레이드를 사용하여 두개골에서 결합 조직을 부드럽게 긁어냅니다. 두개골 가장자리 근처의 결합 조직을 제거 할 때 나머지 조직이 나중에 유리 또는 헤드 플레이트의 강한 접착을 방지 할 수 있으므로 특별한주의를 기울이십시오.
- 멸균 조직 포셉을 사용하여 두개골에서 느슨한 결합 조직을 제거하십시오.
- 멸균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골에서 남아있는 자일로카인을 닦아냅니다.
- 일단 완료되면, 아세톤에 담근 멸균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골을 완전히 탈지한다. 압축 공기를 사용하여 두개골을 즉시 불어 건조시킵니다.
3. 두개골 절제술
- 미세점 마커와 눈금자를 사용하여 원하는 위치에서 개구부에 적합한 크기를 측정합니다. 개구부의 크기를 커버 글라스의 크기 (직경 3 또는 5 mm)와 비교하여 확인하십시오. 개구부가 커버 글라스의 크기보다 약간 작은지 확인하십시오.
- 치과 드릴을 사용하여 점차적으로 개구부의 윤곽을 추적하여 뼈를 얇게합니다. 뼈를 통한 드릴링을 방지하기 위해 천천히 드릴링하고 동심원으로 드릴링하여 뼈가 얇아지는 것을 용이하게합니다.
- 각 동심원 통과 후, 뚫린 부위에 멸균 식염수 한 방울 또는 두 방울을 넣으십시오. 뼈가 과열되어 기본 두라를 손상시키는 것을 방지하기 위해 식염수를 적어도 10 초 동안 그대로 두십시오.
- 멸균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 남아있는 식염수를 흡수하십시오. 이 지역에 압축 공기를 불어 드릴링을 재개하기 전에 남아있는 모든 식염수가 증발했는지 확인하십시오. 남아있는 뼈 파편을 날려 버리기 위해이 작업을 수행하십시오.
- 뼈가 제거를 위해 적절하게 얇아질 때까지 3.2-3.4 단계를 반복하십시오.
- 뼈가 미세한 포셉으로 뼈의 중앙 영역을 부드럽게 밀어 넣어 뼈가 얇아져 두개골이 움직이는지 확인하십시오. 기저 혈관구조는 드릴링이 발생한 곳에서 볼 수 있어야 합니다. 뼈가 엷어지는 곳에서 갈라지는 것처럼 보일 수 있음을 관찰하십시오.
참고 :이 단계에서의 훈련은 뼈가 적절하게 얇아졌을 때를 식별하는 데 중요합니다. - 뼈를 제거하기 전에 마우스가 완전히 진정되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 뼈를 제거 할 때 뇌 붓기를 방지하기 위해 이소 플루란 유지를 점차적으로 증가시킵니다.
- 얇아진 두개골에 식염수에 포화 된 젤 폼의 작은 조각을 추가하십시오. 얇아진 두개골에 하나 또는 두 방울의 식염수를 추가로 첨가하십시오.
참고: 얇아진 두개골 위에 식염수를 충분히 섭취하면 출혈을 줄이고 뼈 플랩을 제거할 때 경막을 보호하는 데 도움이 됩니다. - 소형 15° 뾰족한 블레이드를 사용하여 얇은 뼈에 블레이드를 조심스럽게 삽입하고 얇아진 뼈를 따라 자릅니다. 젤 폼을 식염수에 담그고 발생할 수있는 출혈을 막을 준비를하십시오.
- 포셉을 사용하여 조심스럽게 뼈를 들어 올리고 제거하십시오. 기저 조직과 혈관 조직의 손상을 피하기 위해 가능한 한 부드럽게하십시오. 경막이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.
- 뼈 플랩이 제거되면 식염수에 포화 된 신선한 젤 폼 조각을 피질에 첨가하십시오. 젤 폼이 건조하지 않도록 식염수 몇 방울을 넣으면 기본 조직이 손상됩니다.
4. 바이러스 성 주사
- 입체 택시 장치를 사용하여 바이러스 성 주사를 수행하십시오.
- AAV1을 준비합니다. CaMKII.0.4.Cre (3 ×10,13 게놈 카피 (GC)/mL의 역가)를 식염수 중의 연속 희석에 의해 1:5,000에 .
- AAV1의 혼합물을 준비한다. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) 및 AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (5 × 1012 GC / mL의 역가)를 작은 파라 필름 조각에 담았습니다.
- 20 μm의 팁 크기를 갖는 멸균된 경사 유리 피펫을 용액 상에 피펫을 부드럽게 위치시켜 바이러스 혼합물로 채운다.
- 피펫을 내려 뇌 표면에 닿도록 하고 L2/3 주사를 위해 200-300 μm를 더 낮추십시오. 세포내 미세주입 분배 시스템을 사용하여( 표 자료 참조), 압력-주입은 2분에 걸쳐 12-15회(20psi, 9ms 펄스 지속시간)이다. 피펫이 막히지 않도록 각 주사와 함께 피펫 방울의 반월 연골을 관찰하십시오.
- 일단 주입되면 역류를 방지하기 위해 피펫을 4-5 분 동안 뇌에 두십시오. 피펫을 천천히 철회하십시오.
- 2-3 부위 (약 500 μm 간격)에서 주사를 반복하십시오.
- Cre 바이러스의 연속 희석에 사용되는 유리 피펫, 파라필름, 피펫 팁 및 미세 퍼지 튜브를 10% 표백제로 폐기합니다.
5. 두개골 창의 이식
- 젤 폼을 제거하고 스폰지 스트립의 작은 스트립을 사용하여 남아있는 식염수를 흡수하십시오.
- 항생제 enrofloxacin (22.7 μg / mL)을 개구부에 몇 방울 떨어 뜨리고 1 분 동안 거기에 그대로 두십시오. 1 분 후, 남아있는 enrofloxacin을 흡수하기 위해 스폰지 스트립의 신선한 조각을 사용하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
- 세 번째 세척 후, 개구부에 식염수 몇 방울을 넣고 1 분 동안 그대로 두십시오. 1 분 후, 남아있는 식염수를 흡수하기 위해 스폰지 스트립의 신선한 조각을 사용하십시오. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 작은 식염수 한 방울을 개구부에 넣으십시오.
- 덮개 유리를 개구부 위에 놓습니다. 포셉을 사용하여 유리가 개구부 위로 플러시되어 좋은 품질의 이미지를 얻을 수 있도록하십시오.
- 유리를 제자리에 부드럽게 고정시키면서 시아 노 아크릴레이트 접착 젤 (재료 표)을 유리 둘레 주위에 적용하여 창문의 가장자리를 두개골에 밀봉하십시오. 접착제가 커버 글라스 아래에 스며들지 않도록하고 가능한 한 많은 접착제를 커버 글라스 표면에서 떼어 내십시오.
- 접착 젤 위에 슈퍼 접착제 층을 바르십시오. 접착제 위에 치과 시멘트 액체 층을 추가하여 경화시킬 수 있도록하십시오.
- 적절한 크기의 헬리콥터 형 헤드 플레이트를 가져 와서 중앙 개구부 주위에 얇은 접착제 층을 적용하십시오. 커버 글라스 위에 헤드 플레이트를 놓고 접착제를 간단히 말리십시오.
- 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브에서 치과용 시멘트 분말을 튜브의 0.1 mL 마크에 첨가하십시오. 7-8 방울의 빠른 경화, 즉석 접착제를 넣고 혼합하십시오. 더 큰 구멍을 만들기 위해 절단 된 19G 바늘이있는 1 mL 주사기에 그립니다.
- 양쪽에서 스며들 때까지 헬리콥터 바의 측면 구멍을 통해 혼합물을 주입하십시오. 치과 시멘트 / 접착제 혼합물을 노출 된 두개골의 나머지 부분에 적용하여 헤드 플레이트를 두개골에 고정하면 이미징 중 움직임 아티팩트가 줄어 듭니다.
- 혼합물을 적어도 15 분 동안 공기 건조시킨다.
- 회복을 돕기 위해 마우스에 0.5 mL의 식염수를 피하 주사하십시오.
6. 포스트 조작
- 스테레오택시 프레임에서 마우스를 꺼내 케이지로 되돌립니다.
- 회복을 돕기 위해 케이지의 일부를 물 재순환 담요, 스페이스 젤 가열 패드 또는 등온 패드에 놓습니다.
- 회복을 돕기 위해 규칙적인식이 요법 외에도 음식 펠릿과 젖은 음식을 동물에게 작은 도움을 제공하십시오. 회복 기간 동안 수술 후 매일 새로운 음식 펠릿과 젖은 음식을 추가하십시오.
- 수술 다음 날, 마우스에게 5mg/kg 카프로펜과 5mg/kg 엔로플록사신을 한 번 주사합니다.
- 2-6 일째에 생쥐에게 5 mg / kg 카프로펜을 한 번, 5 mg / kg 엔로 플록사신으로 두 번 주사하여 현지 IACUC의 승인을 기다리고 있습니다. 엔로플록사신 주사를 적어도 8 h씩 분리한다.
- 7-20 일째에 매일 5mg / kg 카프로펜을 주사하십시오.
7. 영상화를 위한 동물 습관
- 수술 후 14 일째에 두개골 창문을 검사하여 광학 선명도를 확인하십시오. 창문이 불분명하거나 손상된 마우스(즉, 과도한 혈관신생)는 사용하지 마십시오.
- tdTomato 발현을 형광현미경으로 확인한다. 표지 된 세포가 확인 될 수 있다면, 동물 습관화를 진행하십시오.
- 습관화 첫날 (취급)
- 마우스를 몇 분 동안 잡고 취급 후 케이지로 되돌립니다. 세션 사이에 15분 간격으로 처리를 세 번 반복합니다.
- 세 번째 시험 후, 동물을 작은 천으로 감싸서 마우스를 습관화하십시오.
- 헝겊으로 싸인 마우스를 약 1분 동안 잡으십시오.
- 재판이 끝나면 마우스를 새장으로 돌려 보내십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하여 각 시행 사이에 15분 간격을 둡니다.
- 습관화의 둘째 날
- 무게를 측정하고 마우스 무게를 기록하십시오.
- 마우스를 천으로 감싸고 헤드 플레이트를 통해 공수 된 홈 케이지의 헤드 고정 암에 고정하십시오.
- 집 케이지를 빛에 노출시킵니다.
- 마우스를 15분 동안 모바일 홈 케이지에 고정시킨 상태로 두십시오.
- 습관화 후 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 공기 흐름을 끕니다.
- 마우스의 무게를 측정하고 케이지로 되돌립니다. 체중의 10 % 이상을 잃지 않는 쥐 만 포함하도록주의하십시오. 습관화 하루 동안 체중의 10 % 이상을 잃는 마우스를 이미징 실험에서 제외하십시오.
- 습관화와 그 너머의 셋째 날
- 마우스의 무게를 계량하고 기록한 후 공랭식 홈 케이지에 고정시킵니다.
- 마우스를 공수 들어 올린 홈 케이지에 고정시킵니다.
- 상자와 같은 어두운 내부를 제공하는 것으로 홈 케이지를 덮고 마우스를 30 분 동안 단단히 고정시킵니다.
- 30 분 후에 홈 케이지를 발견하고 마우스를 제거한 다음 공기 흐름을 끕니다.
- 습관화 후 체중을 계량하고 기록하십시오.
- 이 과정을 매일 반복하여 마우스가 홈 케이지에 고정되는 지속 시간을 15 분 연장하십시오. 마우스가 1.5 시간 동안 홈 케이지에 고정될 수 있을 때까지 이 과정을 계속하십시오, 이는 이광자 이미징 세션의 대략적인 지속시간이기 때문이다.
- 마우스를 소음에 습관화하려면 현미경에서 습관화 세션을 수행하여 마우스를 레이저 스캐닝 거울의 소리에 적응시킵니다. 충분히 습관화되지 않는 마우스를 배제하십시오 (즉, 발성 및 스트레스로 인한 배변).
8. 다중 광자 이미징
- 창문이 맑아질 수 있도록 수술 후 3 주 후에 이미징을 시작하십시오.
- Ti:사파이어 레이저가 장착된 맞춤형 또는 상용화된 다중 광자 현미경으로 이미징을 수행합니다. 높은 수치 조리개(NA) 침수 목표를 사용하여 이미지를 획득합니다.
참고: 두 채널 이미징은 565nm 이색성 미러와 두 개의 외부 광승수 튜브를 사용하여 수행됩니다. 535/50 대역 통과 필터는 GCaMP6f 방출을 감지하는 데 사용되며 610/75 대역 통과 필터는 tdTomato를 감지하는 데 사용됩니다. 25x 수침 목표(1.05 NA) 및 공진 스캐너를 사용하여 그림 1 및 그림 2에 표시된 이미지를 획득했습니다. 관심의 각 영역은 1 μm만큼 축 방향으로 분리된 이미지의 스택으로 구성되었다. 각 광학 섹션은 512 x 512 픽셀, 0.18 μm/픽셀에서 수집되었다. 이미지는 입체 택시 좌표에 의해 결정된 일차 운동 피질의 앞다리 영역으로부터 획득되었다. - 레이저의 파장을 920nm로 설정합니다(적색 편이된 GECI를 사용하는 경우 990nm).
- 마우스를 이동식 홈 케이지에 놓고 헤드 플레이트를 헤드 고정 암에 고정시킵니다.
- 창 중앙에 물 몇 방울을 넣으십시오.
- 현미경의 광역 모드를 사용하여 쉽게 식별 할 수있는 혈관 구조의 2-3 위치를 선택하십시오. 이러한 혈관의 이미지를 저장하고 모터 컨트롤러에 나타나는 X- 및 Y 좌표를 기록하여 후속 이미징 세션을 위해 tdTomato 라벨이 붙은 수상 돌기를 재배치합니다. 매번 X- 및 Y 좌표를 조정하여 혈관의 저장된 이미지와 다시 정렬하십시오.
- 혈관구조가 영상화되고 위치가 기록되면 tdTomato를 발현하는 뉴런이 있는 영역을 찾습니다(그림 1). 성상세포에서 뉴런과 GCaMP6f 활성의 시냅스 구조(수상 돌기 및 축색돌기)를 이미지화한다.
참고 : 수상 돌기는 동일한 지역으로 안정적으로 돌아가고 반복되는 날에 동일한 수상 돌기와 성상 세포를 이미지화하는 랜드 마크 역할을합니다. 이미징 평면에서 검출 가능한 이동은 안정적인 헤드 고정과 헤드 고정에 대한 습관화 후에 관찰되지 않았습니다. X 및 Y 방향에서 발생하는 변위는 동작 보정됩니다. - 이미징 후 마우스를 케이지로 되돌립니다.
참고: 마우스는 일반적으로 최대 2시간 동안 범위에 보관됩니다. 이미징이 오랫동안 지속되면 목표 아래의 물이 건조 될 수 있습니다. 실험 중에 물을 첨가해야합니다. 또는 물 대신 초음파 젤을 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
두개골 창의 품질은 신경 구조가 얼마나 선명하게 나타나는지에 따라 평가 될 수 있습니다. 좋은 창문에서는 수지상 척추가 명확하게 보입니다 (그림 1). 저장된 구조 및 위치 데이터를 사용하면 동일한 동물을 수일, 몇 주 또는 몇 달 동안 반복적으로 이미지화하여 동일한 세포를 검사할 수 있습니다(그림 1). 도 1 의 이미지는 일차 운동 피질의 앞다리 영역(5mm 윈도우에서)으로부터 얻어졌다. 구조적 시냅스 가소성을 연구하기 위해 수지상 척추 및 축삭 부톤의 밀도 및 역학을 포함한 다양한 매개 변수를 측정 할 수 있습니다. 성상세포 활성은 칼슘 신호전달의 시공간 역학을 분석함으로써 연구될 수 있다(도 2). 현미경 능력(즉, 공진 스캐너, 목표를 제어하는 압전 모터) 및 실험 질문에 따라, 타임랩스 이미징은 단일 초점면 또는 부피 또는 다중 영역에서 수행되어 원하는 획득 주파수에서 칼슘 활성을 모니터링할 수 있습니다.
그림 1: 수일에 걸친 수상 돌기와 성상세포의 반복 영상화. tdTomato (마젠타)를 발현하는 덴드라이트는 가까운 거리에서 GCaMP6f 발현 성상 세포 (흰색)의 확인 및 반복 이미징을 허용합니다. 성상세포 내의Ca2+ 활성은 상이한 날에 상이한 시점에서 보여진다. 시냅스 구조 가소성은 동시에 이미지화될 수 있다. 2 일째에 나타난 두 개의 새로운 척추는 화살표로 표시됩니다. 한 척추가 지속되어 5 일째 (파란색 화살표)에 보이는 반면, 다른 척추는 제거되었습니다 (녹색 화살표). 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성상세포 칼슘 신호 전달의 이미징. GCaMP6f를 발현하는 성상세포로부터의Ca2+ 활성을 나타내는 이미지. 패널은 획득 동안 상이한 시점에서 4 μm 부피로부터 기록된Ca2+ 활성을 보여준다. 과정 및 마이크로도메인에서의 칼슘 신호전달은 휴지 기간 동안 관찰될 수 있다. 전체 세포를 포괄하는 글로벌 이벤트는 188 초에서 운동 시합 중에 관찰 될 수 있습니다. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서, 우리는 공중 들어 올린 홈 케이지에 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 피질 성상 세포 및 뉴런의 생체 내 이미징을위한 만성 두개골 창문을 이식하기위한 프로토콜을 제시했습니다. 구체적인 예가 GECIs 및 뉴런 시냅스 구조를 발현하는 성상세포를 영상화하기 위한 두개골 창 응용의 제공되었다. 다중 광자 현미경을 사용하면 천체 칼슘 신호 역학 및 구조적 시냅스 역학을 며칠 동안 반복적으로 기록 할 수 있습니다.
만성 두개골 창은 우수한 광학 이미징 품질을 제공하며 동일한 신경 및 신경교 구조에서 여러 이미징 세션을 수행 할 수 있습니다. 이 접근법은 또한 두개골 절제술을 커버 글라스로 덮기 전에 두개내 바이러스 주사를 수행 할 수있게합니다.
사용자는 만성 두개골 창문의 이식을 통해 발생하는 여러 가지 제한 사항을 알고 있어야합니다. 고품질의 창을 달성하고 동물의 생존을 보장하기 위해서는 경험과 많은 연습이 필요합니다. 또한, 수술은 침습적이며 염증 반응을 일으킬 수 있습니다. 수술 중 약리학적 치료 및 수술 후 회복에는 항염증제 및 항생제(31)가 포함된다. 항염증제의 사용은 신경 염증 모델을 조사하는 연구에서 적절하지 않을 수 있습니다.이 약물은 연구중인 현상에도 영향을 줄 수 있습니다.
보다 최근에, 수막 림프관형성은 두개골 창 이식(32)에 반응하여 발생하는 것으로 나타났다. 따라서 만성 두개골 창은 수막 림프관을 조사하는 연구에 적합하지 않을 수 있습니다. 중요하게도, 영상화 실험 31,33 전에 수술 후2-3 주간의 대기 기간이 필요하다. 또한, 마우스의 나이뿐만 아니라 수술 후 회복 시간은 매우 초기 발달 사건을 이미지화하는 능력을 제한합니다. 두개골 창은 더 어린 생쥐 (P15-21)34에 이식 될 수 있지만 염증과 같은 가능한 부작용을 고려해야합니다.
만성 두개골 창의 대안으로, 얇은 두개골 준비가 또한 이루어질 수 있습니다. 이 방법은 이미징 전에 관심 영역에 걸쳐 두개골이 얇아지는 결과를 초래합니다. 얇아진 두개골 창은 덜 침습적이며 항염증제 투여의 필요성을 극복하여 신경 염증 및 신경 면역 상호 작용 모델을 조사하는 연구에서 선택됩니다. 그러나, 반복되는 이미징이 요구된다면, 두개골은 이미징 전에 다시 얇아질 필요가 있고, 뼈는 이미지 품질이 저하되기 전에 제한된 횟수로만 다시 얇아질 수 있다(35).
비록 재박화를 필요로 하지 않는 강화된 얇은 두개골 방법의 변형된 버전이 설명되었지만(36), 불균일한 두개골 두께는 구형 수차를 야기할 수 있고, 형광 구조(37)의 왜곡을 야기할 수 있다. 따라서, 수지상 척추와 같은 구조의 확인과는 대조적으로, 칼슘 신호전달 역학(38) 또는 시냅스 단백질(27)의 수준과 같은 정량적 측정이 기록될 때, 만성 두개골창은 보다 광학적으로 안정하고 신뢰할 수 있는 준비를 제공한다. 따라서, 종, 생체내 영상화의 경우, 두개골 창의 삽입은 약물 치료(39), 행동 패러다임(4,25)에서의 훈련, 및 신경 장애(11,27)에서의 시냅스 리모델링의 결과로서 변화를 조사하는 우수한 방법이다.
설명 된 절차는 기술적으로 까다 롭고 고품질 이미지 수집을위한 장벽을 제공합니다. 창문에 감염이 없도록 각 단계에서 극도의주의를 기울여야하며 기본 조직의 손상을 피할 수 있어야합니다. 여기에는 두개골의 결합 조직을 부드럽게 긁어내고, 드릴링 할 때 뼈를 냉각시키기위한 적절한 휴식을 취하고, 뼈를 쉽게 제거 할 수 있도록 균일 한 얇아짐을 보장하고, 뇌 붓기를 방지하고, 수술 중에 경막이 손상되지 않도록 극도의주의를 기울이는 것이 포함됩니다. 최상의 창 준비만이 더 오랜 기간 이미징을 위해 광학적으로 투명하게 유지됩니다.
시냅스 구조의 변화는 수일에 걸쳐 마취된 마우스에서 영상화될 수 있지만, 마취가 생체내40에서 성상세포 칼슘 신호전달을 방해하는 것으로 밝혀짐에 따라 성상세포 칼슘 신호전달을 조사할 때 바람직하지 않다. 깨어 있고 머리가 억제된 마우스 에서 생체 내 이미징을 수행하기 위해서는 이동 홈 케이지, 자유 부유 러닝 머신, 공랭 리프트 스티로폼 볼 또는 기타 장치의 이미징 조건에 동물을 습관화하는 것이 필수적입니다. 적절한 습관화는 이미징 중 스트레스를 줄일뿐만 아니라 이미징 세션 중 운동 아티팩트를 최소화하는 역할을합니다.
요약하면, 만성 두개골 창을 통한 생체 내 다광자 현미경 검사는 피질에서 세포의 구조적 및 기능적 변화를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 세포 특이적 형광 염료 및 리포터를 사용하여 세포 형태학, 상호 작용 및 활성을 연구 할 수 있습니다. 만성 두개골 창문에 의해 허용되는 종방향 이미징을 통해 시냅스 구조가 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하고 발전하는지 조사 할 수 있습니다13,14. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여, 감각 자극23,38, 운동 또는 깜짝 놀랄만한6,41, 질병 15,42, 또는 관심있는 다른 파라미터로 인한 성상세포에서 칼슘 신호전달 역학을 조사할 수 있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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