Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rask in Vivo-fiksering og isolering av translasjonskomplekser fra eukaryote celler

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62639
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1
1Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, 2Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, 3Victor Chang Cardiac Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en teknikk for raskt å stabilisere translasjonelle (proteinbiosyntese) komplekser med formaldehyd krysskobling i levende gjær og pattedyrceller. Tilnærmingen muliggjør dissekering av forbigående mellomprodukter og dynamiske RNA:proteininteraksjoner. De krysskoblede kompleksene kan brukes i flere nedstrømsapplikasjoner, for eksempel i dype sekvenseringsbaserte profileringsmetoder, mikroskopi og massespektrometri.

Abstract

Raske svar som involverer rask omfordeling av messenger(m)RNA og endringer av mRNA-oversettelse er relevante for pågående homeostatiske justeringer av cellene. Disse justeringene er avgjørende for eukaryotisk celleoverlevelse og "skadekontroll" under varierende nærings- og saltholdighetsnivåer, temperatur og ulike kjemiske og strålingsspenninger. På grunn av den svært dynamiske naturen til RNA-nivåresponsene, og ustabiliteten til mange av RNA: RNA og RNA: protein mellomprodukter, er det bare mulig å oppnå et meningsfullt øyeblikksbilde av den cytoplasmatiske RNA-tilstanden med et begrenset antall metoder. Transkripsjonsomfattende, RNA-seq-baserte ribosomeprofilerings-type eksperimenter er blant de mest informative datakildene for kontroll av oversettelse. Imidlertid kan fravær av en jevn RNA og RNA: protein mellomliggende stabilisering føre til forskjellige skjevheter, spesielt i de fartsfylte cellulære responsveiene. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for rask fiksering som gjelder for eukaryote celler med forskjellig permeabilitet, for å hjelpe til med RNA og RNA: protein mellomliggende stabilisering. Vi gir videre eksempler på isolasjon av de stabiliserte RNA:proteinkompleksene basert på deres co-sedimentering med ribosomale og poly (ribo)somale fraksjoner. Det separerte stabiliserte materialet kan senere brukes som en del av ribosomets profilerings-type eksperimenter, for eksempel i Translation Complex Profile sekvensering (TCP-seq) tilnærming og dets derivater. Allsidigheten til TCP-seq-stilmetodene er nå demonstrert av applikasjonene i en rekke organismer og celletyper. De stabiliserte kompleksene kan også i tillegg affinitetsrenses og avbildes ved hjelp av elektronmikroskopi, separert i forskjellige poly(ribo)somale fraksjoner og utsatt for RNA-sekvensering, på grunn av enkel krysskoblings reversering. Derfor kan metoder basert på snap-chilling og formaldehydfiksering, etterfulgt av sedimenteringsbasert eller annen type RNA: proteinkompleksberikelse, være av spesiell interesse i å undersøke finere detaljer om rask RNA: proteinkompleksdynamikk i levende celler.

Introduction

Levende organismer er utsatt for dynamiske intra- og ekstracellulære endringer gjennom hele levetiden, noe som krever raske svar for å opprettholde homeostase og sikre overlevelse. For å tillate miljøtilpasning justerer eukaryote celler stoffskiftet via genuttrykkskontroll. Genuttrykkskontroll kan utøves under transkripsjon og/eller oversettelse; oversettelsessvar som vanligvis forekommerraskere 1,2,3,4. For eksempel oppstår translasjonsendringer vanligvis innen 1-30 minutter etter stressde begynnelse, mens endringer på transkripsjonsnivå følger timer etter stresseksponering3,4,5. Endringer i oversettelsesutgangen oppnås raskere på grunn av vedvarende tilgjengelighet av messenger (m) RNA-molekyler i cytoplasma. Omvendt, på transkripsjonsnivå, må nye mRNA-molekyler syntetiseres, og i eukaryoter, behandles og eksporteres fra kjernen, og produserer omfattende forsinkelser i responstiden2,4,6,7,8.

Akutt translasjonell respons på stress er generelt preget av en generell reduksjon i oversettelsesproduksjonen, med selektiv oppregulering av proteiner som er nødvendige for celleoverlevelse1,3,4,9. Å redusere proteinproduksjonsproduksjonen antas å være avgjørende på grunn av den høye energikostnaden i prosessen.3,7. For å lette selektiv hemming og oppregulering, serveres translasjonsresponser av en rekke komplekse regulatoriske mekanismer. Regulering kan utøves på tvers av alle faser av oversettelsen: initiering, forlengelse, avslutning av polypeptidbiosyntese og ribosomal resirkulering10,11,12,13, men er utstilt sterkest i initieringsfasen5,7,9,10,13. Under initiering binder den lille ribosomale underenheten (SSU), assistert av eukaryote initieringsfaktorer (eIFer), til og skanner 5' uoversatt region (UTR) av mRNA til en startkodon gjenkjennes2,5,6,8,11,12,13. Forskriftsmessige mekanismer retter seg ofte mot e-filer som påvirker vedlegg, skanning og start kodongjenkjenning. For eksempel initieringsfaktoren eIF2, en viktig oversettelsesfaktor som hjelper til med rekruttering av en initiativtaker Met-tRNAiMet SSU, er ofte målrettet i eukaryoter under stressforhold4,6,11. I gjær kan fosforylering av denne faktoren induseres under næringsmangel og osmotisk stress1,4,11,14,15, og i pattedyrceller kan aminosyre sult, endoplasmatisk retikulum (ER) stress, UV-stress, virusinfeksjon og endret oksygennivå utløse denne responsen8,9,11. Rask oppregulering av spesifikk mRNA-oversettelse er tydelig i pattedyrcelleresponsen på hypoksi, som viser en global rask oversettelseshemming og selektiv oppregulering av hypoksi-induserbare faktorer (HIFs) biosyntese. HIFer er transkripsjonsfaktorer, som deretter fremkaller langsiktig cellulær omprogrammering på DNA-transkripsjonsnivå8,9,16. Lignende responser har blitt observert i gjær under varmestress, med raskt translasjonsuttrykk av varmesjokkproteiner (HSP-er) etterfulgt av forsinkede transkripsjonsnivåresponser17,18. I tillegg til næringsmangel og varmesjokk har translasjonsresponser i gjær blitt studert under varierende oksygen8,19salinitet5, fosfat, svovel20,21 og nitrogen22,23 Nivåer. Denne forskningen har utbredte implikasjoner for industriell bruk av gjær, som baking og gjæring.24,25. Translasjonelle responser kan også være medvirkende til å fremme forståelse av sykdommer som nevrodegenerative lidelser og hjertesykdom, som er preget av intracellulære påkjenninger som oksidativt stress. Samlet sett er translasjonsresponser integrert i genuttrykkskontrollen og legger til rette for rask tilpasning til et bredt spekter av stressforhold i eukaryote organismer.

For å studere oversettelsessvar kreves det metoder som gir minimalt forvrengte øyeblikksbilder av oversettelseslandskapet. Polysomprofilering er en klassisk tilnærming som brukes i studiet av oversettelse på tvers av mRNA, som involverer separasjon av poly (ribo)somalfraksjoner av mRNA via ultracentrifugation gjennom sukrose gradienter26,27. Tilnærmingen kan brukes til å utforske oversettelsesnivåer for individuelle mRNAer (med deteksjonsmetoder som omvendt transkripsjon og polymerasekjedereaksjon, RT-PCR26), eller globalt i forbindelse med teknikker med høy gjennomstrømning (mikroarray eller RNA-seq28,29). En mer utviklet tilnærming er ribosomprofilering, som tillater studiet av posisjoner av forlengelse av ribosomer langs et mRNA-molekyl i genomomskala, samt inferens av effektivitet av oversettelse på tvers av transkripsjon og utnyttelse av de viktigste og alternative startstedene30,31. Ribosomprofilering innebærer isolering og sekvensering av mRNA-fragmenter beskyttet av ribosomal tilstedeværelse over dem. Ribosomprofilering har gitt betydelig innsikt i oversettelsesdynamikk på tvers av en rekke forhold, inkludert hypoksisk stress, varmesjokk og oksidativt stress31,32. Teknikken er tilpasset flere kildematerialetyper, inkludert gjær og pattedyrceller.

Mens polysom- og ribosomprofilering har vært grunnleggende for å utvide forskningens evner i oversettelse, inkluderer oversettelsesprosessen ulike oversettelsesmessige mellomprodukter og komplekser som er vanskelige å fange opp med disse metodene11,13. En ekstra begrensning stammer fra mangel på evne til å studere raske responstyper, da translasjonskomplekser enten stabiliseres in vivo ved tilsetning av spesifikke oversettelseshemmere (antibiotika), noe som fører til visse ribosomefordelingsartefakter, eller ex vivo på cellelys spesielt (antibiotika) eller uspesifisert (høyt salt eller magnesiumioner), noe som fører til deprivasjon av de kortere levde eller mindre stabile mellomprodukter33, 34,35.

Formaldehyd er mye brukt til å krysslinke nukleinsyrer og proteiner, for eksempel i kromatinimmunoprecipitation (ChIP) og crosslinking immunoprecipitation (CLIP) studier. Den lille størrelsen og utmerket cellegjennomtrengelighet gir mulighet for en rask in vivo-handling 36. Basert på den raske formaldehyd-krysskoblingen er ribosomets profileringsmetode utvidet med Translation Complex Profile Sequencing (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, som først ble utviklet i gjær, gjør det mulig å fange opp alle mellomliggende oversettelser, inkludert skanning eller SSU-komplekser etter avslutning og flere ribosomale konfigurasjoner37,38,41,42. Metoden har blitt brukt i flere studier10,38,39,41,42, hvorav noen bruker en kombinatorisk tilnærming til både oversettelseshemmere og formaldehyd krysskobling for å lette arrestasjonen av oversettelse. En ytterligere modifisert versjon av teknikken, selektiv TCP-seq39, har nylig blitt brukt til å inkludere immunopurifisering av krysskoblede komplekser, noe som utvider omfanget av TCP-seq-applikasjonene. Formaldehyd-krysskoblingens raske, effektive og reversible natur gjør disse tilnærmingene egnet for å studere forbigående mRNA:translation komplekse interaksjoner, spesielt i sammenheng med svært dynamiske responsveier på oversettelsesnivå.

Her beskriver vi prosessene med in vivo formaldehyd crosslinking med det formål å omfattende oversettelseskompleksstabilisering og isolasjon. Vi tilbyr separate protokoller nyansert for gjær og pattedyrceller (Figur 1). Vi skisserer videre eksempler på etterfølgende bruk av krysskoblingstabilisert materiale (figur 1), for eksempel for korenset proteinfaktordeteksjon ved hjelp av immunoblotting (western-blotting), immunassistert rensing (eller 'immunrecipitation'; IP) og berikelse av translasjonskomplekser som inneholder spesifikke faktorer av interesse, elektronmikroskopi og RNA-sekvensering.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk som viser en oversikt over det vanlige eksperimentelle oppsettet. Hovedtrinnene i in vivo formaldehydstabilisering av translasjonskomplekser er avbildet som et flytskjema, supplert med informasjon om de viktigste nødvendige instrumentene. Potensielle nedstrømsapplikasjoner av det krysskoblede materialet er skissert, inkludert eksempler som har blitt brukt, men ikke direkte dekket i denne protokollen, for eksempel SPRI-perlerensing av RNA, RNA-sekvensering og massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Gjærcelleprotokoll

  1. Gjærcellekultur og fiksering
    MERK: Cellefiksering og høsting er tilpasset fra10,38med modifikasjoner.
    1. Sett opp 1 L gjærcellekultur (wild-type (WT) BY4741 er gitt som et eksempel) i en orbital shaker med start optisk tetthet på ikke mer enn 0,05 AU ved 600 nm (OD600) i egnede medier (1% m / v gjærekstrakt, 2% m/v pepton, 2% m/v dekstrose (glukose), 40 mg/l adeninsulfat (YPD) brukt som eksempel) under de ønskede forholdene (30 °C brukt i dette eksperimentet).
    2. Sett opp en forberedende sentrifuge med kompatibel rotor og sentrifugeflasker for pelleting av den flytende suspensjonskulturen til gjærceller. For glukose sult eksperimenter, pellet cellene når den optiske tettheten på 0,6-0,8 AU ved 600 nm (OD600) er nådd, ved hjelp av en kort sentrifugering ved 30 °C, 5000 x g i 1 min.
      MERK: Hold oversikt over OD for vekstcellene og la cellene vokse til OD600 når 0,6-0,8 AU, hvis den eksponentielle vekstfasen er av interesse.
    3. Resuspend pellet umiddelbart i varm (30 °C) YP-medier som inneholder nei eller lav (0,25% m/v) tilsatt glukose og inkuberer kulturen i ytterligere 10 minutter ved 30 °C i en orbital shaker-inkubator.
      MERK: Mediesammensetning kan påvirke påfølgende krysskoblingseffektivitet. Denne protokollen ble bare testet ved hjelp av YPD. Når du utfører sulteksperimenter, er det viktig å følge timingen og minimere forsinkelsene mellom prosedyrene.
    4. Når cellene er klare, setter du opp en isboks inne i avtrekkshetten med et beger som inneholder 250 g rent knust vannis. Sørg for at 25 ml stripetter og nyinnkjøpte metanolstabiliserte 37 % m/v formaldehydløsning er tilgjengelige inne i hetten. Hell 1 L-kulturen i begeret som inneholder 25 % m/v knust vannis.
      MERK: Hold cellene på is gjennom alle etterfølgende operasjoner til cellene er frosset, med mindre annet er angitt.
    5. Tilsett 75 ml 37 % m/v formaldehydoppløsning i en endelig konsentrasjon på 2,2 % m/v og rør blandingen intenst til isen smelter.
    6. Når isen er smeltet, sett opp en timer i 10 min.
      MERK: Følg de anbefalte tidspunktene og temperaturregimet for å oppnå reproduserbare fikseringsresultater.
    7. Etter inkubering i 10 min, overfør kulturen til de forhåndskjølte sentrifugeflaskene og pellet cellene ved sentrifugering ved 4 °C, 5000 x g i 5 minutter. Mens dette spinnet er på, forkjøl et 50 ml rør og hold nylaget buffer A (som inneholder glycin for å nøytralisere gjenværende formaldehyd) på is.
      MERK: Se den medfølgende tabellen for nøyaktige buffersammensetninger.
    8. Etter sentrifugering plasserer du sentrifugerørene på isen med pelletssiden i kontakt med isen. Før rørene inn i avtrekkshetten og kast supernatanten i en formaldehydavfallsbeholder.
    9. Resuspend cellepellet fra alle rør i 20 ml buffer A ved hjelp av en 25 ml stripette og overføring til et 50 ml rør.
      MERK: Denne vasken er avgjørende for å unngå uopprettelig krysskobling, og buffertilsetningen må ikke overstige 20 minutter fra cellenes høsting.
    10. Gjør volumet opp til 40 ml med buffer A og samle de vaskede cellene ved sentrifugering ved 4 °C, 5000 x g i 5 minutter.
    11. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 40 ml buffer A1, som er buffer A som ikke inneholder glycin, for å fjerne glycinforurensning.
    12. Pelletsceller igjen ved sentrifugering ved 4 °C, 5000 x g i 5 minutter.
    13. Gjenta vaskene med buffer A1 en gang til. Kast supernatanten og legg cellepelleten på is. Vei røret med pellets (våt cellemasse skal være ~ 1 g per 1 L av cellekulturen).
  2. Gjærcelleforstyrrelser og cytosolkolleksjon
    1. Fyll en polystyrenskumboks foret med aluminiumsfolie med flytende nitrogen til en dybde på ca. 3 cm. Plasser et 50 ml rør oppreist i esken.
    2. Resuspend pellets (~ 1 g våt cellemasse) i 550 μL buffer A2 ved pipettering og virvel i 10 s. Tilsett 10 μL 40 U/μL RNase-hemmer og virvel igjen i 10 s.
      FORSIKTIG: Bruk egnet verneutstyr, for eksempel termisk isolerte hansker, ved håndtering av flytende nitrogen. Påse at alle beholdere som brukes til å holde flytende nitrogen ikke lekker, og at rørstativet på innsiden ikke vil flyte opp eller falle på siden. Arbeid i et godt ventilert område for å unngå oksygennedbrytning.
    3. Bruk en 1 ml pipette og drypp cellefjæringen inn i 50 ml-røret som inneholder det flytende nitrogenet.
      MERK: Dryppingen må utføres sakte og forsiktig for å unngå aggregering av dråpene. Sørg for at dråpene fryser før du introduserer nye dråper.
    4. Overfør 50 ml-røret med de frosne celleopphengsdråpene til romtemperatur og vent til det flytende nitrogenet fordampes helt. Forsegle røret med hetten og oppbevar cellepellets ved -80 °C eller fortsett umiddelbart videre.
      FORSIKTIG: Påse at det flytende nitrogenet fordampes helt før du forsegler røret. Rester av flytende nitrogen i et forseglet rør kan forårsake en farlig trykkoppbygging.
    5. For å forberede seg på neste trinn, precool 1,5 ml nukleasefrie rør og 10 ml slipeglass i rustfritt stål på tørris.
    6. Overfør de frosne celleopphengsdråpene i krukkene ved hjelp av en ren, steril spatel.
      FORSIKTIG: Påse at slipeglassene er tett forseglet.
    7. Senk slipeglassene ned i det flytende nitrogenet i 1 min, og sørg for at væskefasen forblir under krysset. Sett opp en kryoblandermølle på 27 Hz for agitasjon i 1 min.
      MERK: Balanser alltid slipebeholderen med en annen av samme modell, selv om prøven bare krever én beholder for behandling.
    8. Rør de forseglede slipeglassene på 27 Hz i 1 min i mikserfresen.
    9. Avkjøl slipeglassene i flytende nitrogen som før og rist på 27 Hz i 1 min videre i mikserfresen.
    10. Overfør glassene til isboksen som inneholder tørris sammen med de 1,5 ml nukleasefrie rørene. Bruk en liten stålspatel, overfør den resulterende pulveriserte prøven inn i rørene i ~ 100 mg aliquots, og lagre rørene ved -80 °C.
      MERK: Det anbefales å bruke ~ 600 mg av prøven per eksperiment som består av polysom sedimenteringsprofilanalyse, separasjon av cytosolen i oversatte og ikke-oversatte fraksjoner, og ytterligere separasjon av den oversatte fraksjonen til SSU, ribosom og disome fraksjoner på RNase fordøyelse.
  3. Separasjon av de faste (poly)ribosomale kompleksene fra de ikke-oversatte fraksjonene av cytosolen
    MERK: Prosedyren som ble etablert tidligere10,38følges vanligvis for å berike oversatt RNA basert på ko-sedimentering med (poly)ribosomer. En mer raffinert tilnærming til å skille de oversatte og ikke-oversatte cytosolfraksjonene introduseres her, eliminerer behovet for å utfelle og deretter løse materialet på nytt.
    1. Forbered 2,5 ml lineære 10%-20% m/v sukrose gradienter med buffer B ved hjelp av fryse-tine-metoden43 i tynne vegg ultracentrifuge rør (5 ml, 13 x 51 mm).
      MERK: Fryse-tine-metoden utføres ved sekvensiell tilsetning og frysing av bufrede sukroselag med lineær regresjonskonsentrasjoner oppå hverandre. Se supplerende tabell 1 for mer informasjon.
    2. For å lage en diskontinuerlig 50% m / v sukrosepute, på de lineære gradientene som tiner og stabiliserer, dispenserer du sakte 0,5 ml 50% sukrose i buffer B direkte på bunnen av rørene ved hjelp av en 1 ml sprøyte festet til 19 G x 1,5" nål eller en glasskapillær av lignende / passende dimensjoner. Før dispensering, kjør forsiktig og sakte spissen av nålen eller kapillæren fra toppen til bunnen av de forformede sukrosegradientene, unngå forstyrrelser, til den når rørbunnen.
      MERK: Se supplerende tabell 1 for instruksjoner om klargjøring av buffer B.
    3. Balanser gradientene forsiktig ved å fjerne de øverste delene eller legge mer enn 10 m/v sukrose i buffer B og hold dem iskalde eller ved 4 °C.
      MERK: Den diskontinuerlige gradienten med det nederste 50% sukroselaget er nødvendig for å samle materiale med høyere sedimenteringshastighet uten å utløse det på rørveggen.
    4. Tin ~100 mg av den frosne cellepulverprøven ved romtemperatur og legg straks på is. Bland inn 150 μL buffer A2 ved pipettering, tilsett RNase-hemmer til 1 U/μL og bland ved virveling (unngå overdreven skumming og blanding med gassformfasen) i 10 s.
      MERK: Fortsett alle operasjoner mens du holder materialet på is, med mindre annet er angitt.
    5. Pellet cellerester ved å sentrifugere rørene ved 4 °C, 13 000 x g i 5 minutter og gjenvinne det klargjorte supernatantrøret (~150 μL) i et nytt 1,5 ml lavt proteinbindingsrør.
    6. Last den resulterende klargjorte blandingen på de diskontinuerte sukrose gradientrørene fra trinn 1.3.3 og balanser dem forsiktig.
    7. Ultracentrifuge rørene i en middels volum swing-bucket rotor ved 4 °C, med gjennomsnittlig g-force 287,980 x g (k-faktor 49) i 1 t 30 min.
      MERK: Disse forholdene er forhåndsoptimalisert (ved hjelp av etter-ultracentrifugation gradient UV-absorbanssporingsanalyse) for å beholde gratis (ikke-(poly)ribosomale) SSUer og LSUer (stor ribosomal underenhet) i den øverste (10%-20% sukrose) delen av gradienten mens du konsentrerer (poly)ribosomal brøkdel i bunnen (50%) sukrose pute uten pelleting materialet.
    8. Bruk en ny steril 1 ml sprøyte utstyrt med en 19 G x 1,5" nål for å samle den oversatte cytosolfraksjonen. Plasser 5 ml-gradienten på et stabilt stativ som sikrer at bunnen av røret er synlig.
    9. Fra toppen av røret stikker du nålen rett inn i bunnen av gradienten (uten å punktere røret) og forsiktig, uten å lage noen bobler, tegn nøyaktig 0,5 ml av bunnløsningen som inneholder det oversatte RNA-bassenget.
      MERK: Sørg for at dette trinnet utføres i et kaldt rom, og at røret holdes godt fast. Det anbefales å tegne hele 0,5 ml i en enkelt upstroke-bevegelse for å unngå forstyrrelser i gradienten.
    10. Bekreft (poly)ribosomal tilstedeværelse og uttømming av SSU, LSU og lettere fraksjoner i den resulterende blandingen ved absorbansavlesning av sukrosegradienten ved ultracentrifugation run.
    11. Konsentrer det innsamlede oversatte RNA-bassenget fra forrige trinn til 100 μL ved hjelp av ultrafiltrering i en mikrokonsentrasjonsenhet med 10 kDa avskåret regenerert cellulosemembran.
      MERK: Forvask mikrokonsentrasjonsenhetens membran med 0,5 ml buffer 1 (se figur 2a) og bruk spinnforhold (g) anbefalt av produsenten.
    12. Fortynn materialet ytterligere fra forrige trinn fem ganger (tilsett 400 μL) med buffer 1 og konsentrer deg tilbake til 200 μL, for å tillate et mindre volum samt delvis fjerning av sukrose.
      MERK: Det anbefales å lagre de resulterende blandingene ved -80 °C i opptil 6 måneder og bruke det som inngangsmateriale for den 'totale oversatte RNA' RNA-seq bibliotekkonstruksjonen, eller RNase-fordøyelsestrinnet til TCP-seq-bibliotekkonstruksjonen. Den "ikke-oversatte" cytosolfraksjonen kan gjenvinnes fra toppen av gradienten ved hjelp av en lignende prosedyre og lagres ved -80 °C.
  4. RNase fordøyelsen av de faste (poly)ribosomale komplekser og separasjon av fordøyd materiale i små ribosomale subenhet (SSU), monoribosomale (ribosomer, RS) og diribosomale (disomer, DS) fraksjoner
    MERK: Prosedyren følger vanligvis en fremgangsmåte som er beskrevet tidligere10,38men en modifisert gradienttype, separasjonstid, akselerasjon og RNase fordøyelsesforhold brukes, for å oppnå best mulig oppløsning på tvers av alle tre isolerte brøker.
    1. Forbered nøye balanserte 12,5 ml lineære 10%-40% m/ v sukrose gradienter laget med buffer 1 i 13 ml tynnvegg polypropylenrør, 14 x 89 mm, ved hjelp av fryse-tinemetoden43 som beskrevet i trinn 1.3.1 og legg merke til det.
    2. Tine ved romtemperatur og overfør umiddelbart prøvene på is eller ta den konsentrerte og sukrose-utarmede oversatte cytosolfraksjonen fra trinn 1.3.12.
      MERK: Fortsett alle prosedyrer på is med mindre annet er angitt.
    3. Fordøye den oversatte cytosolfraksjonen ved å blande i 4,5 U E. coli RNase I per 1 OD260-enhet av fraksjonen i 30 min ved 23 °C. Tilsett og bland umiddelbart inn ved å pipettere RNase-hemmeren som er i stand til å inaktivere RNase I til 0,25 U / μL til blandingen, for å inaktivere RNase I.
      MERK: Bruk RNase inhibitor som er i stand til å hemme RNase I. Derive AU260 ved å bruke AU260 = (Absorbans ved 260 nm standardisert til optiske tetthetsenheter tilsvarende 1 cm optisk bane x volum av lysatet i μL) / 1000.
    4. Overfør straks prøvene til is.
      FORSIKTIG: Det er viktig å følge de anbefalte fordøyelsesbetingelsene og nøye måle mengden av den tilsatte RNase I. RNase I-enheten som det refereres til her, er definert som mengden av enzymet som kreves for å produsere 1 μg syreløselig materiale fra muselever RNA i 30 min ved 37 °C. RNase I-partier kan ha udokumenterte variasjoner i aktivitet og kan kreve eksperimentering for å oppnå optimale fordøyelsesforhold. Hvis enzymbestanden er for konsentrert, anbefales det å fortynne den med buffer 1 for å unngå pipettering av svært små mengder av løsningen.
    5. Last reaksjonsblandingene på 10%-40% m/ v sukrose gradienter fra trinn 1.4.1.
      MERK: Bruk endelige volumer i området 150-300 μL per gradient. Hver rensing krever minimalt to graderinger. Bruk forskjellige inngangsvolumer av materialet (lavere AU260, 10-11 AU260, for DS og relativt høyere AU260, 13-14 AU260, for SSU eller RS) for å oppnå optimal separasjon.
    6. Ultracentrifuge rørene i en middels volum swing-bucket rotor ved 4 °C med gjennomsnittlig g-force 178,305 x g (k-faktor 143,9) i 3 t 30 min.
      FORSIKTIG: Hvis det er behov for ekstra balanserør, må du utjevne masse- og massefordelingen med prøveholdige rør. Bruk ekstra sukrosegradienter lagt over med en mengde buffer som tilsvarer prøveoverlegget og ikke rør med jevn sukrosekonsentrasjon.
    7. Sett opp en gradientfraksjonatorenhet minst 30 minutter før ultracentrifugation spin-fullføringen, inkludert å fylle ut den 0,2 μm filtrerte tunge jaktløsningen (f.eks. 60% sukrose i deionisert vann som brukes her) i forskyvningspumpen.
      MERK: Det anbefales å dekontaminere ledningene og slangene til fraksjonatoren ved hjelp av deionisert vann, etterfulgt av 1% -2% SDS-løsning i deionisert vann, deionisert vann og til slutt 80% etanol i deionisert vannoppløsning før og etter løpene.
    8. Juster grunnlinjen for absorberingsavlesning ved først å fylle systemet med avionisert vann og nullstille optikken i henhold til produsentens anbefalinger, og kompenser deretter grunnlinjeskiftet ved hjelp av en ekstra losset 14 x 89 mm sukrosegradient laget med en buffer som er identisk med prøverørene (f.eks. buffer 1).
      MERK: Bruk samme forskyvningshastighet til å foreta justeringene som for prøveavlesningen, for eksempel 1,5 ml/min.
    9. Mål dødvolumet i forskyvningssystemet ved å telle tiden mellom løsningen som først kom inn i detektorens optiske bane og først vises ved brøksamlerutgangen.
      MERK: Med den anbefalte hastigheten på 1,5 ml/min kan fraksjoneringen utføres ved romtemperatur. Det anbefales å umiddelbart overføre de oppsamlede fraksjonene på is.
    10. Utfør fraksjonering ved hjelp av levende absorbansavlesning ved 254 nm, 1,5 ml/min forskyvningshastighet og in-line fraksjonsdeteksjon basert på forventet sedimenteringsposisjon og absorbansprofil for prøvene. Bruk brytere for oppsamlingsrør med en tidsforsinkelse som tilsvarer det døde volumet som målt tidligere.
    11. Isoler fraksjoner som tilsvarer posisjonene og mobiliteten til SSU-, RS- og DS-kompleksene og samle dem i nye lavproteinbindingsrør på 1,5 ml mikrocentrifuge; umiddelbart overføre de isolerte fraksjonene på is og fryse hvis de ikke behandles videre med en gang.
      MERK: Det anbefales å umiddelbart blinke de oppsamlede fraksjonene i tørris eller flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C eller lavere i opptil 6 måneder.
  5. Av-krysskobling av ribosomale komplekser og isolering av RNA for å konstruere RNA-seq biblioteker
    1. For å de-blokkere/reversere krysskoblingene og isolere RNA vekk fra de tilknyttede proteinene, overfør omtrent halvparten av hele sukrose gradientfraksjonene til nye lavkjernebindende nukleasefrie polypropylen 1,5 ml mikrocentrifugerør (350 μL per rør) med lokksikkerhet / låseanordninger.
    2. Suppler blandingene med 40 μL 100% stoppløsning (10% SDS m/v og 100 mM EDTA), 4 μL 1 M Tris-HCl pH 2 ved 25 °C (til 10 mM), 1,6 μL 2,5 M glycin (til 10 mM) og deionisert nukleasefritt vann for å oppnå det endelige volumet på 400 μL.
    3. Bland innholdet i rørene ved pipettering og overfør rørene ved romtemperatur.
    4. Tilsett lik volum av den sure fenol:kloroform:isoamylalkohol 125:24:1 (pH 4,0-5,0) blandingen til hvert rør. Rist blandingene kraftig i 2 minutter ved hjelp av en virvelblander satt til maksimal hastighet.
      FORSIKTIG: Fenol og kloroform er etsende og giftige. Unngå fysisk kontakt med væskene og arbeid i et godt ventilert område eller under en avtrekkshette. Bruk alltid hansker, labfrakk og vernebriller eller ansiktsskjerm når du arbeider med fenol eller kloroform.
    5. Plasser rørene i en termoshaker og rist kontinuerlig ved 65 °C, 1400 o/min i 30 minutter.
    6. Legg til rette for faseaggregering ved å sentrifugere blandingen ved 12.000 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    7. Samle de øvre vandige fasene og overfør dem til friske lave nukleinsyrebinding 1,5 ml rør.
      MERK: For å unngå krysskontaminering må du ikke forsøke å gjenvinne de vandige fasene helt. Et rimelig gjenopprettingsvolum er 300-350 μL.
    8. Suppler de oppsamlede vandige fasene med 0,1 volumer 3 M natriumacetat (pH 5 ved 25 °C), 20 μg glykogen (ved bruk av 5 μg/μL lager) og 2,5 volumer absolutt etanol. Bland løsningene forsiktig ved å virvelere rørene i 1 min.
    9. Utfell RNA ved å inkubere prøvene ved -20 °C i minst 2 timer (anbefales over natten).
    10. Varm rørene til romtemperatur og bland ved virveling.
      MERK: Forvarming av rørene og påfølgende sentrifugering ved romtemperatur (uten tvungen kjøling) bidrar til å redusere salt og fenolko-nedbør og overføring. Disse forholdene bør ikke føre til materialtap eller ineffektivitet av RNA-samlingen hvis de utføres som beskrevet og ved bruk av tilstrekkelig rent etanol.
    11. Pellet RNA utfelles ved å sentrifugere rørene ved 12.000 x g i 30 minutter ved romtemperatur.
    12. Kast supernatanten og vask pellet to ganger med 80% v / v etanol, samle den hver gang ved sentrifugering ved 12.000 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    13. Tørk RNA-pelletsene ved å åpne rørlokkene og plassere de åpne rørene i en tørrblokkvarmer satt til 45 °C i 10 minutter. Løs opp den resulterende tørkede pelletsen i 20 μL 1x HE-buffer.
    14. Beregn den resulterende RNA-konsentrasjonen ved hjelp av UV-absorbansspektrummåling.
      MERK: RNA-fragmentlengde og total mengde kan vurderes nærmere ved hjelp av denaturering av gelelektroforese, for eksempel i et automatisert fluorescensbasert kapillærgelelektroforeseapparat.
  6. Selektiv koimmunopurifisering av SSU-ene ved de taggede eIK-ene og vestlig blotanalyse av selektiv SSU-berikelse
    MERK: Bruk ~15 AU (260 nm) av den fordøyde og sedimenteringsdelte SSU-fraksjonen fra trinn 1.4.11 for å utføre affinitetsrensing ved hjelp av magnetiske IgG-perler. Lagre ~5% av SSU-brøken som inndatakontroll (Input brøk, I). eIF4A-merket (TIF1-TAP; Tandem affinitetsrensingsmerke) gjærstamme ble brukt som også gjør det mulig å oppdage eIF4A ved å undersøke TAP-taggen ved hjelp av anti-TAP-antistoff.
    1. Overfør 100 μL magnetisk IgG perler suspensjon (1 mg perler ble brukt for hver 15 AU (260 nm) av lysate eller brøkdel) til en ny lav protein binding 1,5 ml rør; samle perlene ved hjelp av magnetisk stativ og aspirere dem.
    2. Vask de magnetiske perlene to ganger med 1 ml buffer 1 ved hjelp av sekvensiell resuspensasjon ved pipettering og oppsamling ved hjelp av magnetstativet.
    3. Etter vask, samle og dekantere perlene, mens du holder dem på magnetstativet.
    4. Tilsett SSU-fraksjonen til de vaskede perlene og inkuber blandingen i 4 timer med rotasjon ved 4 °C i et cyclomixersett ved ~20 o/min.
    5. Samle perlene ved hjelp av magnetstativet ved 4 °C og lagre supernatanten (Flow-through fraksjon, FT).
    6. Vask perlene to ganger ved 4 °C med buffer 1 supplert med 4 mM DTT, hver gang du roterer i 10 min i syklomixen og samler og dekanterer perlene på magnetstativet. Lagre vaskene (W1 og W2 brøker).
    7. For en analytisk applikasjon som vestlig blotting, elute det bundne materialet under denaturering og redusere forhold ved å legge til LDS (litium dodecyl sulfat) polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) prøvebuffer med pH 8,5 til 1x og DTT til 2 mM.
    8. Varm blandingen ved 95 °C i 5 minutter i en termisk blokk for å fullføre elutionen.
    9. Samle perlene ved hjelp av det magnetiske stativet og gjenopprett denaturerte eluate (E-fraksjonen) i et friskt lavt proteinbindingsrør på 1,5 ml mikrocentrifuge.
    10. Bruk E-fraksjonen fra forrige trinn til å kjøre en denaturering natrium dodecyl sulfat (SDS) SIDE umiddelbart, eller lagre E-fraksjonen ved -20 °C.
      MERK: For en forberedende samling av TAP-tag-berikede oversettelseskomplekser for senere bruk, bruk en alternativ elution tilnærming ved bruk av Tobacco Etch Virus (TEV) protease. Se tilleggstabell 1 hvis du vil ha mer informasjon.
    11. For å konsentrere de fortynnede FT-, W1- og W2-fraksjonene, utfeller du materialet ved å tilsette 3x mengder iskald aceton. Inkuber prøve-acetonblandingen ved -20 °C i 3 timer.
    12. Pellet utfellingen ved å sentrifugere rørene ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    13. Kast den supernatante og lufttørke pelletsen i de åpne rørene ved romtemperatur i 30 min.
    14. Løs opp pelletsen i 7 μL 1x LDS-lastebuffer supplert med 2 mM DTT. Varm prøvene i en termisk blokk satt til 95 °C i 5 minutter.
    15. Legg alle I-, FT-, W1-, W2- og E-prøver på en 4%-12% m/v akrylamidgradient, Bis-Tris polyakrylamid denaturing gel. Kjør gelen med 1x MES SDS (2- [N-mopholino]etanesulfonsyre, natriumdodecylsulfat) løpebuffer ved 80 V, til proteinmarkøren (10-250 kDa) løser seg godt og blyfargen når bunnen av gelen.
      MERK: Det anbefales å laste serielle fortynninger av WCL (hele cellelyset) (2-10 μg) på gelen som en kontroll. Det kan ta flere forsøk å oppnå sammenlignbar lasting av gelen over brøkmaterialet.
    16. Overfør proteininnholdet i gelen til en polyvinylliddifluoridmembran (PVDF) ved våt overføringsmetode ved 100 V i 1 time i et kaldt rom som anbefalt av produsenten av western-blottingutstyr.
    17. Blokker membranen ved hjelp av en passende blokkeringsbuffer (Fosfat bufret saltvannsbasert) ved romtemperatur i 1 time under konstant risting.
    18. Etter produsentens instruksjoner for antistofffortynning, sonde membranen med anti-TAP-antistoff for å oppdage det taggede eIF4A-proteinet, anti-Pab1p-antistoffet eller anti-β-aktin-antistoffet (eller noe annet ønskelig mål) ved over natten inkubasjon av membranen med blokkeringsbuffer (PBS) -fortynnet antistoff (1:1,000 fortynning) i et cyclomixer i et
      MERK: 1:1000 antistofffortynning er et godt utgangspunkt.
    19. Vask membranen tre ganger med 1x fosfat bufret saltvann, 0,2% v / v Tween 20 (PBST) i 10 minutter hver.
    20. Sonder membranen med fluorescerende merkede sekundære antistoffer etter produsentens instruksjoner ved å inkubere i en syklomixer ved romtemperatur i 1 time.
      MERK: 1:20,000 antistoff fortynning er et godt utgangspunkt.
    21. Vask membranen tre ganger med 1x PBST i 10 min hver. Skyll membranen kort med deionisert vann, og deretter med absolutt metanol. Tørk og visualiser membranen i et fluorescerende bildebehandlingssystem i henhold til produsentens instruksjoner.
      MERK: Farging for andre proteiner kan oppnås ved å bruke sekundære antistoffer med fargestoffer som matcher forskjellige fluorescerende kanaler (for eksempel i eIF4A-TAP vs. β-aktinparet som brukes her), ved sekvensiell farging eller stripping og farging av samme membran eller kutting av membranen fra en gel lastet med repeterende mønster av fraksjoner og separat probing hvert stykke med respektive antistoffer (som i Pab1p-eksemplet som brukes her).

2. Pattedyr celle protokoll

  1. Pattedyr cellekultur og fiksering
    1. I 2 T-175 kolber, vokse HEK293 celler til 60%-70% samløp i Dulbecco Modifisert Eagle Medium og 10% v / v Fetal Bovine Serum ved 37 ° C og 5% v / v karbondioksid.
      MERK: De komplette mediene er laget ved å legge til 55 ml kommersiell FBS i en 500 ml kommersielt kjøpt DMEM med høy glukose, som inneholder L-glutamin, fenolrød og natriumbikarbonat, men ingen HEPES eller natriumpyuvat. Celleantall per T-175 kolbe ved 70 % samløp bør være i området 1,7-2,0 x 107.
    2. Minst 3 timer før ønsket fikseringstid, erstatt mediet på T-175-kolber med nøyaktig 30 ml forvarmede komplette medier og erstatt kolber i en celleinkubator.
      MERK: Sørg for at det ferske mediet pipettes på motsatt side av kolben til cellemonolayeren for å unngå celleavløsning. Forsøk på å gjennomføre medieutvekslingen så raskt som mulig, og innføre minimal gass- og temperaturbalanseforstyrrelse.
    3. Når cellemediet er byttet ut, klargjør du buffere og kjemikalier som kreves for fiksering. Forbered Dulbeccos fosfatbuffer-saltvann (DPBS) med 50 mM glycin ved å tilsette 10,2 ml 2,5 M glycinlager til en 500 ml flaske DPBS og blanding.
    4. Forbered en flaske DMEM supplert med 10% FBS som i trinn 2.1.1 som skal brukes under ikke-sterile forhold og en 100 ml aliquot på 0,25% Trypsin-EDTA. Kilde en ekstra flaske kommersiell DPBS pre-formulert med kalsiumklorid (CaCl2) og magnesiumklorid (MgCl2).
      MERK: Oppløsningene kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
    5. Forbered en isboks til randen med knust vannis slik at en T-175 kolbe kan passe jevnt på toppen og holde i avtrekkshetten sammen med de forberedte bufferne, også på is.
      MERK: På grunn av de raske svarene på oversettelsen av eventuelle miljøendringer, må alle tidspunkter mellom fjerning av celleflaskene fra inkubatoren og tillegg av formaldehydløsningen minimeres.
    6. For å slå av cellene, fjern T-175-kolben fra inkubatoren og trykk den godt mot isen og sørg for maksimal overflatekontakt. Inne i den kjemiske avtrekkshetten vipper du kolben på siden slik at mediene samler seg på siden motsatt av cellene. Pipette 168 μL 37% m/v formaldehyd direkte inn i de samlede mediene (til en endelig konsentrasjon på 0,2% m/v). Bland straks ved å gynge kolben forsiktig frem og tilbake, lukk og omplasser kolben på is, sørg for at den er horisontal og cellene er dekket jevnt.
      FORSIKTIG: Formaldehyd er et skadelig stoff med potensielle langsiktige bivirkninger og også irriterende for både luftveiene og huden. Den skal kun håndteres i en egnet kjemisk avtrekkshette. Beholdere med formaldehyd må alltid forsegles når de er utenfor avtrekkshetten.
      MERK: Pass på at formaldehyden legges direkte inn i cellemediet og ikke til kolbeveggen. Trinn 2.1.6 bør ta mindre enn 1 min.
    7. Inkuber kolbe på is i ytterligere 10 minutter. Hell av mediet i en passende avfallsbeholder gjennom kolbesiden motsatt av cellene.
    8. Ved hjelp av en stripette, pipette i 30 ml av Dulbeccos fosfat bufret saltvann uten kalsium- og magnesiumioner og i tillegg inneholder 50 mM glycin, forsiktig på siden motsatt av cellene. Bland ved å gynge kolben; sett kolben tilbake i horisontal stilling og inkuber i 10 minutter mer på is.
    9. Hell av oppløsningen gjennom kolbesiden motsatt av cellene og tilsett forsiktig 7 ml av standard 0,25% m / v Trypsin-EDTA-løsning for å løsne og resuspendere cellene. Inkuber kolben ved romtemperatur i 5-10 min.
      MERK: Sørg for at Trypsin-EDTA-løsningen dekker alle cellene jevnt. Bruk periodisk skånsom tilting og gynging for å fremme celleavløsning.
    10. Flytt kolben vertikalt og bruk en stripette samle de frittliggende cellene ved å forsiktig vaske eventuelle gjenværende celler fra kolbeveggene. Overfør suspensjonen til et 50 ml rørsett på is.
      MERK: Faste celler kan bli mer skjøre; Ikke pipette intenst eller mer enn det som kreves for å løsne cellene fra kolbeveggen.
    11. Suppler umiddelbart den innsamlede cellefjæringen med 20 ml komplette medier (det ikke-sterile iskalde mediet med 10% FBS) og bland ved å snu røret forsiktig.
      MERK: Hele cellekulturmediet (inkludert 10% FBS) legges til for å nøytralisere trypsin, og forhindrer ytterligere skade på cellemembranene og cellesløsingen.
    12. Pellet cellene ved å sentrifugere røret ved 100 x g i 5 min og 4 °C. Cellepellet må være tydelig synlig.
    13. Hell av media og forsiktig resuspend cellepellet i 10 ml iskald DPBS med Ca2 +, Mg2 +, og uten glycin.
    14. Gjenta trinn 2.1.12.
    15. Hell av vaskebufferen og resuspender cellepellet forsiktig i 800 μL iskald DPBS med Ca2+, Mg2+, uten glycin, på is. Overfør de resuspenderte cellene til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 ml mikrocentrifuge.
    16. Sentrifuger røret ved 100 x g i 3 min og 4 °C. Kast forsiktig supernatanten med en 1 ml pipettor. På dette stadiet kan cellepellet fryses ved -80 °C eller fortsette til cellelystrinnet.
      MERK: Frosne cellepellets kan oppbevares ved -80 °C i opptil 1 år. Vi fant ut at cellepelletsfrysing letter påfølgende lysis og anbefaler frysing selv om lengre lagring ikke er planlagt.
  2. Pattedyrcelleforstyrrelser og cytosolsamling
    1. I et biosikkerhetsskap tilsettes 300 μL av lysisbufferen basert på ikke-ionisk, nondenaturing vaskemiddel og 7 μL 40 U/μL RNase-hemmer. Bland godt ved å pipettere med en 1 ml spiss.
    2. Fest forsiktig en 25 G nål til en 1-3 ml sprøyte og rør blandingen kraftig, ved hjelp av minst syv langsomme inntak og raske eksosstrøk nedover.
    3. Kast sprøyten og kanylen i en slipeskuff og gjenta prosedyren ved hjelp av en 0,3 ml sprøyte utstyrt med en 31 G nål.
    4. Kast sprøyten og kanylen i en papirkurv. Sentrifuger rørene ved 4 °C, 12 000 x g i 5 minutter for å pellet cellerester.
    5. Overfør supernatanten til et nytt lavproteinbindingsrør på 1,5 ml mikrocentrifuge. Oppbevar begge, cellerester (for kontrollformål) og den resulterende klargjorte cellelyset ved -80 °C.
      MERK: Den optiske tettheten til lysatet varierer mellom 25-30 AU260 når to T-175-kolber kombineres og de anbefalte volumene følges. Lysates og cellerester kan lagres ved -80 °C opp til 1 år.
  3. Separasjon av de faste (poly)ribosomale kompleksene fra de ikke-oversatte fraksjonene av cytosolen
    1. Forbered lineære 15%-45% m/ v sukrose gradienter i 13 ml tynnvegg polypropylenrør, 14 x 89 mm, ved hjelp av fryse-tine-metoden generelt som beskrevet i trinn 1.3.1 i gjærprotokollen, men ved hjelp av buffer 2 (Figur 2a).
      MERK: Tine gradientene over natten i et kaldt rom ved 4 °C natten før fraksjoneringen.
    2. Last 150-250 (maksimalt 300) μL av cellelyset fra forrige trinn 2.2.5 på de balanserte gradientene. Oppbevar det gjenværende lysatet ved -80 °C og bruk det til kontrollformål.
      MERK: Her er et eksempel på sedimenteringsbasert segregering i polysomale, ribosomale og "frie" SSU-fraksjoner gitt. Se den medfølgende tilleggstabellen 1 for en alternativ tilnærming.
    3. Ultracentrifuge rørene i en middels volum swing-bucket rotor ved 4 °C, gjennomsnittlig g-force 178,305 x g (k-faktor 143,9) i 1 t 45 min.
    4. 30 min før spinnet er fullført, sett opp og grunnlinje gradientfraksjonatoren, som beskrevet i gjærprotokollen trinn 1.4.7-1.4.9.
    5. Fraksjoner graderinger generelt som beskrevet i gjærprotokollen trinn 1.4.10-1.4.11.
      MERK: Dette trinnet vil skille polysomale, ribosomale og "frie" SSU-fraksjoner. Polysomale fraksjoner kan brukes i polysome profileringsforsøk.
    6. Overfør umiddelbart de innsamlede fraksjonene på is og hvis de ikke behandles videre, oppbevares ved -80 °C i opptil 6 måneder.
      MERK: Hvis fraksjonssamlerrørskiftet synkroniseres med online brøkidentifikasjon og segregering, anbefaler vi at du bruker opptil 800 μL fraksjoner (oppsamlingstid på 32 s per brøkdel ved 1,5 ml/min). Hvis fraksjoneringen utføres uten å bruke in-line absorbansavlesning, anbefales det å bruke 250-500 μL brøker (10-20 s per brøkdel ved 1,5 ml / min). Etter separasjon kan fraksjonene brukes til immunopurifisering, elektronmikroskopi, denaturering av SIDE og vestlig blotting med en gang, eller utsatt for krysskoblings reversering for påfølgende RNA- og/eller proteomikkanalyser.

Representative Results

Translasjonskomplekser er følsomme for bufferens ioniske sammensetning, noe som er spesielt viktig under ultracentrifugation der sedimenteringsegenskaper vurderes. Vi testet dermed flere sedimenteringsbuffere ved hjelp av klargjort lysat ekstrahert fra jordet ikke-fast gjærmateriale, for å velge forhold som er best egnet til å løse translasjonskomplekser og separate ribosomale underenheter (SSU, LSU), monosomer (RS) og polysomer over gradienten. Alle buffere var basert på kjernesammensetningen som inneholdt 25 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 2 mM DTT. Konsentrasjonene av KCl, MgCl2, CaCl2og EDTA ble ytterligere endret på tvers av bufferne (figur 2a), og disse komponentene ble lagt til lysatene før graderingslasting og til sukrosegradientbufferne før stigningsstøping, tilsvarende.

I buffere ble det oppnådd 1 og 2 velavklarte oversettelseskomplekser. Buffer 1 resulterte i noe bedre separasjon av de små ribosomale underenhetene (SSUer) (Figur 2a). Utelattelse av MgCl2 og tilsetning av EDTA (buffere 3,4) forårsaket tap av de høye sedimenteringsegenskapene for de fleste polysomene og sannsynligvis deres delvise demontering (figur 2a). Mens tillegg av 2,5 mM CaCl2 resulterte i noe mer homogene polysomale topper, var forbedringen marginal og den totale mengden av polysomalt materiale redusert i dette tilfellet (Figur 2a) sammenlignet med buffere 1 og 2. Vi valgte dermed buffer 1 som arbeidsbuffer.

Figure 2
Figur 2: Bufferforhold for translasjonell kompleks utvinning og vurdering av stabiliseringseffekten av fikseringen. Vist er UV-absorbansprofiler samlet på 260 nm for den totale gjærcellen lysat separert i 10% -40% m / v sukrose gradienter. (a) Effekter av mono- og divalente salter og magnesiumionfangst på sedimentering av materiale ekstrahert fra ikke-faste gjærceller. Røde og grå linjer representerer en vanlig replikering. (b,c) Sammenligning av lysater avledet fra ikke-fast (grå linje), 2,2% (svart linje) og 4,4% (svart prikket linje) m / v av formaldehydfaste gjærceller. (d) Stabilisering av polysomer med optimalisert 0,2% m/v formaldehydfiksering (svart stiplet og prikket linje) av HEK 293T celler, sammenlignet med materialet fra samme ikke-faste celler (grå linje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi sjekket deretter effekten av polysomal stabilisering ved fiksering med forskjellige formaldehydkonsentrasjoner. Ved hjelp av ellers samme cellemateriale, buffere, cellehåndtering og timing tilnærminger, sammenlignet vi materiale hentet fra ikke-faste celler og celler festet med 2,2% og 4% m / v av formaldehyd (Figur 2b,c). Vi fant at 2,2% m / v av formaldehyd var bedre egnet for fiksering som mens det utmerket bevart polysomene som kan bedømmes av polysome-til-monosome forholdet (Figur 2b), det reduserte ikke det totale utbyttet av ribosomalt materiale sammenlignet med 4% w / v av formaldehyd, som viste klare tegn på overfiksering (Figur 2c).

For materialet avledet fra pattedyrceller, på grunn av det større lysis buffer-til-celle-volumforholdet som kreves av vaskemiddelbasert ekstraksjon, ble buffer 2 (figur 2a) brukt. Dette produserte veldrevne translasjonskomplekser ved sedimentering i sukrosegradienter (figur 2d). Spesielt ble en mye lavere konsentrasjon av formaldehyd på 0,2% m / v brukt, da høyere konsentrasjoner resulterte i betydelig polysomalt og ribosomalt materialtap (data ikke vist). I likhet med resultatene oppnådd med gjærceller, viste krysskoblingstabilisert materiale bedre bevaring av polysomene og høyere polysom-til-monosomforhold (Figur 2d).

Vi testet deretter om de valgte formaldehydfikseringsforholdene er effektive nok til å stabilisere aktivt oversatt mRNA innenfor de polysomale fraksjonene som følge av krysskobling, og det forbedrede polysomale utbyttet er ikke bare en konsekvens av å hemme enzymfunksjon og translasjonsforlengelsesprogresjon. Vi brukte EDTA og høyt monovalent salt (KCl) for å destabilisere polysomer og ribosomer. Disse reagensene ble lagt til de avklarte gjærcellelysene, og inkludert i alle etterfølgende buffere og sukrosegradienter på toppen av buffer 1-sammensetningen.

Faktisk viste 15 mM EDTA en mindre destabiliseringseffekt på polysomale fraksjoner avledet fra de faste cellene (figur 3a), som bekrefter at de krysskoblede kompleksene er mer robuste. De destabiliserende effektene av EDTA kan overvinnes noe ved å øke konsentrasjonen av formaldehyd, da materiale fra 4% m / v av formaldehydfaste celler motsto å utfolde seg bedre (Figur 3a). Økende EDTA-konsentrasjon til 50 mM resulterte imidlertid i destabilisering av de fleste oversettelseskompleksene under både faste og ikke-faste forhold, som kan utledes fra langsommere sedimentering av materialet og fravær av velformede topper (Figur 3b). Dette kan forklares ved delvis utfoldelse av strukturer og generelt tap av kompaktitet, i stedet for ved fullstendig dissosiasjon av polysomale komponenter fra mRNA. Selv i dette tilfellet har det krysskoblede materialet vist raskere sedimentering (Figur 3b).

Figure 3
Figur 3: Effekter av in vivo gjær formaldehydfiksering på stabiliteten av polysomer. Buffer 1 (se tekst og figur 2a) ble brukt i alle eksperimenter. Datatype og plotting som beskrevet i figur 2-forklaringen. (a) Sammenligning av tilsetningen av 15 mM EDTA til cellelysene og påfølgende buffere på stabiliteten til polysomene avledet fra ikke-faste (grå linje), 2,2% (svart linje) og 4% (svart prikket linje) m / v av formaldehydfaste celler. (b) samme som (a), men for tillegg av 50 mM EDTA og unntatt 4 % m/v av formaldehydfaste celler. (c) samme som (a), men for tillegg av 500 mM KCl og unntatt 2,2 % m/v av formaldehydfaste celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I likhet med EDTA-effektene, ved 500 mM KCl, fant vi stor forbedring av stabiliteten med 4% m / v av formaldehydfiksering (Figur 3c). Det tilsynelatende tapet av kompaktitet i dette tilfellet kan også forklares ved delvis løsrivelse av bestanddelene i ribosomale komplekser, i stedet for deres fullstendige dissosiasjon fra RNA. Samlet sett viste polysomer avledet fra formaldehydfaste celler høyere motstand mot utfoldelse og strukturell destabilisering, i samsvar med å danne ytterligere kovalente bindinger innenfor disse kompleksene.

Under stimulerende vekstforhold kan mRNAer raskt initieres, noe som resulterer i opphopning av flere ribosomer på de samme mRNA-molekylene, som danner strukturer kjent som polyribosomer eller polysomer. Polysomer kan skilles ved ultracentrifugation i sukrose gradienter, hvor de sedimenterer basert på deres rekkefølge (antall samtidig vedlagte ribosomer på mRNA). Når oversettelsen undertrykkes, klarer ikke ribosomer å delta i en ny oversettelsesrunde snart nok, noe som resulterer i (delvis) "demontering" av polysomer, som er utstilt som et modalt skifte mot polysomene i lavere rekkefølge og akkumulering av monosomer4,26.

En modell for translasjonell respons som kan visualiseres på polysome ordrefordelingsnivå, kan leveres ved glukose sult. Glukoseuttømming fremkaller en av de mest dramatiske og raske translasjonshemmende effektene på gjær1,3,40. Tidligere studier beviste at innen 1 min glukoseuttømming, tap av polysomer, akkumulering av monosomer og inhibering av oversettelsesstart kan forekomme4. Innen 5 min glukose re-supplement, oversettelse gjenopprettes raskt med tydelig økning i polysomer3,4. Det ble også observert at oversettelse ble hemmet når celler ble eksponert for medier som inneholder glukose på 0,5% (w / v) eller lavere, og det var ingen effekt sett i glukosenivåer på 0,6% (w / v) eller høyere.

Vi ønsket derfor å avgjøre om våre fikseringsbetingelser er egnet for bevaring av oversettelsesforskjellene innenfor dynamikken i glukosestressrespons, som kan vurderes av polysome-til-monosom-forholdet. Vi sammenlignet materialet fra cellene som vokste i midteksponentiell fase på høy glukose (2,00% m / v lagt til) med de som ble overført i 10 minutter til media uten eller lav tilsatt (henholdsvis 0,00% eller 0,25% m / v) glukose. Fikseringen er utført ved hjelp av 2,2% m/v formaldehyd parallelt i kontrollen (ikke-sultet, rask medieerstatning med samme standardmedie som inneholder 2% m/v ekstra glukose, etterfulgt av inkubasjon i 10 minutter og fiksering) og 10 min sultet (rask medieerstatning med samme medium, men lav 0,25 m/v eller ingen ekstra glukose, etterfulgt av inkubasjon i 10 min og fiksering) celler.

I samsvar med de tidligere funnene observerte vi at gjærceller sterkt undertrykker oversettelse på glukose sult stress (Figur 4a). Begge, ingen tilsatte og lave glukoseforhold induserte polysom demontering, med litt, men tydeligvis flere polysomer beholdt i tilfelle av lavt tilsatt glukose. Dermed kan gjærglukosefjerningsresponsen ikke være av en all-on eller all-off type og er gradvis innstilt. Ved å bekrefte forventningene til den stabiliserende virkningen av formaldehydkrysskoblingen, har polysomalt materiale fra de faste cellene vist et høyere skille mellom de sultne og ikke-sultne cellene, uten tvil bevare et høyere dynamisk område av responsen (Figur 4b). Interessant, når det gjelder materiale fra de faste cellene, resulterte lav tilsatt glukosekonsentrasjon i den spesifikke polysomale overfloden som er mye bedre differensiert fra den ikke-tilsatte glukosetilstanden, sammenlignet med de ikke-faste cellene (Figur 4a). Dette er en sterk indikasjon på egnetheten av formaldehydfikseringstilnærming for å bevare og fange relativt små og forbigående forskjeller i likevekten av svært dynamiske prosesser, for eksempel under oversettelsesresponser.

Figure 4
Figur 4: Fange raske endringer i gjæroversettelse ved glukose sult. Buffer 1 (se tekst og figur 2a) ble brukt i alle eksperimenter. Datatype og plotting som beskrevet i figur 2-forklaringen. (a) Cellelysater hentet fra ikke-sultet (grå linje), begrenset glukose-sultet (0,25% m / v tilsatt glukose i 10 min; brun linje) og glukose-utarmet (ingen ekstra glukose i 10 min; rød linje) ikke-faste gjærceller. (b) samme som (a), men for 2,2 % m/v formaldehydfaste celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Overvåking av translasjonsstatus av ribosomene forbundet med aktivt oversettelse av mRNA ved hjelp av sukrose gradient sedimentering ('polysome profilering') er en mye anvendt teknikk26,27,28. I kombinasjon med kvantitativ mikroarrayanalyse og mer nylig med høy gjennomstrømningssekvensering28,44, gir polysomprofilering informasjon om ribosole-assosiert mRNAs transcriptome-wide. Med flere forutsetninger har det tradisjonelt blitt argumentert innen proteinbiosynteseforskning at polysomal tilstedeværelse er en indikasjon på aktivt engasjement i oversettelsen av de respektive mRNAene. En ytterligere konklusjon er ofte (men ikke alltid) berettiget, at jo flere ribosomer er til stede på en mRNA av en gitt lengde (jo høyere rekkefølgen av polysomene), jo mer aktivt at mRNA er involvert i oversettelse. Dermed kan det være nyttig å skille den polysomale fraksjonen fra resten av materialet fra ståpunktet for å isolere den aktivt oversatte RNA. Innenfor fotavtrykksprofileringsmetodene, og spesielt TCP-seq10,38,39 som genererer en egen populasjon av de frigjorte SSUene som er avledet fra skanningen, start- og stoppkodonkompleksene, kan det i tillegg være innsiktsfullt å fjerne ribosomale underenheter som ikke er co-sedimentert med de komplette monosomene eller polysomene.

Vi har derfor brukt separasjon av de "ikke-oversatte" mRNPene som gratis SSU-er (mRNA bundet til single SSU- eller SSU-er uten vedlagt mRNA) vekk fra det "aktivt oversettende" utvalget av mRNAer. For å oppnå dette antok vi at mRNAer involvert i interaksjoner med enten en (mono-) eller flere ribosomer (polysomer) kan oversettes aktivt. Slike komplekser kan skilles fra de andre ved deres høyere sedimenteringskoeffisient. Vi foreslo også å dele det "aktivt oversatte" bassenget av mRNAer i en sukrosepute (50% m / v sukrose) i stedet for direkte pelleting av materialet på rørveggen. Sentrifugering av hurtigsedimenterende komplekser i puten tillot oss å overvåke separasjonen ved hjelp av absorbansprofilavlesning og for å oppnå en høyere effekt av det solubiliserte, ikke-aggregerte og ikke-denaturerte materialet, sammenlignet med pelletering og re-solubilisering10,38.

Totalt sett, for å rense de enkelte SSO-ene, ribosomene, disomene og potensielt kompakt pakkede polysomer av høyere rekkefølge, ble faste klargjorte lysater utsatt for en totrinns ultracentrifugation-prosess (figur 5). I den første sukrosegradienten resulterte ultracentrifugationen i separerte gratis SSUer og LSUer i toppen (10% -20% m / v av sukrose) del av gradienten, mens det krysskoblede oversatte bassenget inkludert polysomer og mRNAer forbundet med ett komplett ribosom var konsentrert nederst (50% w / v av sukrose) av gradienten (Figur 5a ). De nederste 50 % m/v av sukroselaget som inneholder det oversatte mRNA-bassenget, ble deretter konsentrert og RNA fordøyd med RNase I, etterfulgt av en annen sukrosegradient ultracentrifugation for å oppnå separate SSU-, LSU-, RS-, RNase-resistente disomer (DS) og mindre brøkdel av høyere ordens nukleaseresistente polysomer (Figur 5b). Negativ farging med uranylacetat og avbildning med transmisjonselektronmikroskop bekreftet identiteten til kompleksene isolert i hvert sedimenteringsstadium (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Isolering av de totale oversatte RNA-fraksjonene vekk fra den uoversatte RNA. (a,c) Skjematisk (venstre) og de respektive representative resultatene (høyre, datatype og plotting som beskrevet i figur 2-legenden) av (a) første diskontinuerte sukrosegradientseparasjon av de ikke-oversatte cytosolfraksjonene, inkludert frie SSUer og det oversatte mRNA-bassenget identifisert ved kosedimentering med ribosomer og polysomer, og (c) separasjon av de enkelte ribosomale kompleksene frigjort fra det oversatte mRNA-bassenget av kontrollert RNase I-fordøyelse og ultracentrifugation gjennom en annen lineær sukrosegradient til SSU, LSU, ribosomal (RS) og nukleaseresistente disomale (DS) fraksjoner. Høye (15 AU260) og lave (8 AU260) mengder av det ikke-sultne fordøyde materialet ble inkludert for å demonstrere en mulighet for å øke ultracentrifugation belastningen når mindre brøkdeler er av interesse. Nukleaseresistente polysomer med høyere rekkefølge kan også identifiseres (f.eks. trekanter i de medfølgende eksemplene). (b,d) Representative TEM-bilder av uranylacetatkontrastfraksjoner fra henholdsvis (a,c) som merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å sjekke egnetheten til fikseringsregimet for oppbevaring av forbigående ribososomrelaterte proteiner (spesielt eIFer), testet vi for co-sedimentering av eIF4A, en labil eIF dynamisk bundet til ribosomet, over ribosomale fraksjoner. Vi benyttet oss av eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) tagget gjærstamme (TIF1-TAP) og undersøkte eIF4A-tilstedeværelse i materiale avledet fra de faste vs. ikke-faste cellene ved hjelp av anti-TAP-antistoff, sammenlignet med overflod av Pab1p som en ekstra RNA-bindende kontroll, ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av vestlig blotting (Figur 6).

Figure 6
Figur 6: Stabilisering av forbigående proteiner i translasjonskompleksene ved in vivo formaldehydfiksering. (a,b) (toppplott) Helcellelyse (WCL) av (a) ikke-fast og (b) 2,2 % formaldehydfast eIF4A-TAP gjærceller atskilt med ultracentrifugation og visualisert som beskrevet i figur 2-legenden. (nederste plott) Western-blot avbildning av de respektive sukrose gradientfraksjoner ved separasjon av materialet analysert i de tilsvarende gradientene (toppplott) og WCL som en kontroll. (c) Gjennomsnittlig forhold mellom eIF4A eller Pab1p overflod i brøker av fast og ikke-fast materiale. Relative proporsjoner (normalisert til signalet fra alle 2-7 brøker) av eIF4A (svarte stolper) og Pab1p (grå stolper) ble beregnet over 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, lyse polysomer) og 6,7 (tunge polysomer) fra dataene til (a,b) (bunnplott), og deres faste til ikke-faste forhold tatt. Feilfelt angir standardavviket for forholdet fra gjennomsnittet med de grupperte brøkene (stiplede bokser) behandlet som replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I samsvar med deres høye overflod i cellene, observerte vi en høy intensitet av signalet fra begge proteinene i hele cellelysatet (WCL) og langsommere sedimenterende fraksjoner avledet fra ikke-faste celler (Figur 6a, bunnpanel). Vi har også oppdaget betydelige mengder av disse proteinene i WCL avledet fra de faste cellene og beroliger effektiviteten til krysskoblet materialutvinning og fravær av uventede tap (Figur 6b, bunnpanel). I motsetning til de ikke-faste cellene viste imidlertid materiale fra de faste cellene forhøyet relativ tilstedeværelse av eIF4A i de raskere sedimenterende ribosomale fraksjonene, sammenlignet med Pab1p (figur 6c). Dette resultatet antyder at eIF4A forblir mer fast forbundet med polysomene i formaldehyd-krysskoblet materiale.

Etter å ha bekreftet den positive og spesifikke stabiliseringseffekten av krysskobling på eIF4A-tilstedeværelse i ribosomale fraksjoner, brukte vi det faste materialet fra eIF4A-merket (TIF1-TAP) gjærstamme for å fange og berike eIF4A-inneholdende komplekser ved affinitetsrensing med magnetiske IgG-perler. Vi har affinitetsberiket WCL, fri SSU- og polysomal (oversatt mRNA-basseng) fraksjoner etter den første sedimenteringen gjennom sukrosegradient (f.eks. gjærprotokollens § 1.3), samt SSU-, LSU- og RS-fraksjoner fra den andre sedimenteringen ved demontering av det oversatte bassenget til individuelle komplekser med RNase I (f.eks. ). I alle tilfeller, bortsett fra LSU-fraksjonen, var vi i stand til å observere selektiv berikelse av eIF4A i de rensede fraksjonene (eluate, E), i forhold til tilstedeværelsen av β-aktin i kildematerialet (input, I) (Figur 7).

Figure 7
Figur 7: Selektiv immunopurifisering av in vivo formaldehydstabiliserte translasjonskomplekser ved forbigående assosiert eIF4A. Skjematisk illustrerer kilden til forskjellige translasjonskomplekser og eIF4A-epitop, inkludert den ikke-fraksjonerte klargjorte WCL av eIF4A-TAP gjærcellene; gratis SSUer og oversatt RNA basseng (polysomer) segregert i den første ultracentrifugation; SSU-, LSU- og RS-brøker frigjort fra den oversatte RNA av RNase I-fordøyelsen og segregert ved hjelp av andre ultracentrifugation (se tekst). Vestlig blot bilde gir en visualisering av eIF4A overflod i fraksjonene sammenlignet med overflod av samtidig farget β-actin kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Formaldehydfiksering er en praktisk og populær metode for å oppnå rask in vivo-krysskobling av biomolekyler10,36,45,46,47,48. Sammenlignet med de andre potensielle biomolekylmålene, krever vellykket fangst av translasjonskomplekser en umiddelbar fiksering under snap-kjøling av cellene eller annet materiale. Uten den ubelagte stabiliseringen er det et potensial for at forskjellige oversettelsesrelaterte prosesser kan fortsette, og flytte den komplekse fordelingen bort fra den uforstyrrede in vivo-tilstanden 49. Sammenlignet med de andre metodene for translasjonell arrestasjon og ribosomal kompleks stabilisering, lover hurtigheten av formaldehydvirkning på tvers av cellemembraner og krysskoblingenes ukritiske natur bevaring av det maksimale mangfoldet av oversettelseskompleksets mellomprodukter nærmere deres opprinnelig distribuerte tilstander50.

Tilnærmingen som presenteres her er etablert og optimalisert i både gjær og pattedyrceller, og metoder er nå avledet av andre grupper for bruk på tvers av mer mangfoldig biologisk materiale, for eksempel i hele vertebrater (f.eks. sebrafiskembryoer)10,38,39,49,51,52 . Selv om disse verkene samlet beroliger allsidigheten og den brede anvendbarheten av tilnærmingen, kan rask formaldehyd krysskobling av oversettelseskomplekser betraktes som noe vanskelig å transponere til nye typer biologisk materiale på grunn av behovet for optimaliseringer og justeringer.

Et fremst krav til metodens suksess er reoptimalisering av konsentrasjonen av formaldehyd og cellesamlings- og forstyrrelsesteknikken. Mindre gjennomtrengelige, små og runde gjærceller krever mye høyere (minst 10 ganger) formaldehydkonsentrasjon og fysisk forstyrrelse av de faste cellene. I kontrast kan store og flate tilhengerpattedyrceller i kulturen lett overfaste og kreve skånsom håndtering ved fiksering, mens utvinningen av de faste kompleksene kan utføres kjemisk med membranforstyrrelser ved hjelp av vaskemidler. Under-crosslinking kan tillate mindre stabile eller mer kortvarige mellomprodukter å dissosiere eller lekke inn i en senere tilstand. Over-crosslinking kan påvirke evnen til å isolere og studere ribosomale fraksjoner negativt og kan skape selektive fordommer som dypere uttømming av tunge komplekser. I vår observasjon kan selv mindre endringer, for eksempel typen tilhenger av menneskelige celler som brukes, påvirke utbyttet av de gjenopprettede krysskoblede kompleksene og kan kreve reoptimalisering av krysskoblingsregimet. Vi kan også forutse at celler med vesentlig forskjellige permeabilitetsegenskaper, for eksempel planteceller, vil kreve ytterligere omfattende optimalisering av fikseringsbetingelsene52. Likevel er det vanskelig å forestille seg en type biologisk materiale som ville være helt uforenlig med tilnærmingen.

En vurdering som er relevant for pattedyrfikseringsprotokollen er tettheten og mengden cellemateriale som brukes som inngang. Det anbefales å la cellene kontinuerlig vokse uten re-seeding eller andre perturbasjoner i minst 2 dager for å unngå ytre påvirkninger på cellulær oversettelsesdynamikk. Gjelder for de fleste celletyper, men for de fleste tilhengerceller som konsekvent oppnås samløpsnivåer på ikke mer enn 70%, vil det sikre fravær av store kontakthemmingseffekter som kan påvirke oversettelsesraten negativt og uforutsigbart.

En annen interessant, og potensielt unikt praktisk, funksjon av formaldehydfiksering som stammer fra dens ukritiske reaktivitet, er stabiliseringseffekten på translasjonskomplekser i systemer med blandet taksonomi. Bakterielle, og enda mer så translasjonelle komplekser av mitokondrier, kloroplaster og forskjellige intracellulære parasitter, har vært notorisk vanskelig å målrette mot med spesifikke oversettelseshemmere. I TCP-seq-dataene er derimot fotavtrykk som tilordnes mitotranscriptomet, lett observerbare i dataene38,39,50. En interessant påfølgende utvikling kan være bruken av tilnærmingen til å undersøke oversettelse i hele mikrokommuniteter, for eksempel i jord-, vann- eller tarmprøver, der pålitelig rask translasjonell arrestasjon og kompleks stabilisering med andre midler ville være problematisk.

Det bør også nevnes at for det mest kompliserte materialet (som hardt og / eller klumpete vev), forhindrer ingenting bruk av formaldehydstabilisering umiddelbart ved celleforstyrrelser og materiell homogenisering. Denne tilnærmingen brukes allerede ofte for å fjerne celleinngangsforsinkelsen når du stabiliserer translasjonskomplekser med spesifikke små molekylhemmere33,53,54,55. Gitt at formaldehydfiksering tradisjonelt har blitt brukt med gode resultater for ex vivo / in vitro prøvestabilisering i applikasjoner som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi forvente enda mindre negative effekter i dette tilfellet, spesielt de som er forbundet med dårlig utvinning av translasjonskompleksene fra de grundig faste cellene.

Våre funn bekrefter brukervennligheten til rask formaldehydfiksering for å stabilisere svært forbigående komplekser, for eksempel de som inkluderer eIF4A. Det er bemerkelsesverdig at gjær eIF4A i motsetning til pattedyr er mye mer svakt forbundet med hettebindingskomplekset eIF4F og som et resultat oversettelseskomplekser generelt. eIF4A går vanligvis tapt under omfattende rensing av ribosomalt materiale i gjær29,59,60,61,62,63. Likevel, i det in vivo-fastegjærmaterialet, er det mulig å oppnå pålitelig berikelse av eIF4A i alle brøkdeler av oversettelseskomplekser der dets tilstedeværelse ville forventes. De tidligere publiserte Sel-TCP-seq-dataene har vist berikelsen av eIF2 og eIF3 som sterkere forbinder med ribosomene (men også avslørt forbigående forekommende co-translational protein kompleks montering)39. Dermed er metoden egnet for påvisning av både sterkere og svakere tilknyttede bestanddeler av oversettelseskompleksene.

For å oppsummere har vi presentert en tilnærming som er nyttig for å få innsikt først og fremst i endringene som skjer i startfasen av oversettelsen, og når minimalt perturbert ribosomal distribusjon over mRNA er nødvendig. Det er viktig at tilnærmingen er egnet for stabilisering av relativt labile og dynamiske komponenter av translasjonskomplekser, for eksempel eIF4A, og kan brukes bredt utsatt for nødvendige optimaliseringer. Vi har også gitt bevis på nytten av formaldehydfiksering i scenariene for rask dynamisk oversettelsesendring, og åpner opp undersøkelsesområder som raske cellulære responser på miljøendringer eller stressforhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 til T.P. and N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 til N.E.S.) og Research Fellowship (APP1135928 til T.P.). Forfatterne anerkjenner fasilitetene til Microscopy Australia ved Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, et anlegg som er finansiert av Universitetet og den føderale regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Merck, Sigma-Aldrich 70161
Peptone Merck, Sigma-Aldrich 70178
D-Glucose (Dextrose) Merck, Sigma-Aldrich 49139
Adenine sulphate Amresco 0607-50G
Formaldehyde solution Merck Sigma-Aldrich F11635-500ML ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific 10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail COEDTAF-RO Roche by Merck 11873580001
Magnesium chloride solution (Merck/Sigma-Aldrich) M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (Merck/Sigma-Aldrich) E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL Ambion AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) (Merck/Sigma-Aldrich) P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) 11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9740
Glycogen (5 mg/ml) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9510
Ethyl alcohol, Pure Merck; Sigma Aldrich E7023
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF Merck GE10600023 PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific NW04120BOX Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific B0007  LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards BioRad 1610375 Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer ThermoFischer Scientific B0002 PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer LI-COR 927-70001 Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific CAB1001
Anti-beta Actin antibody Abcam ab8227
Sucrose (Merck/Sigma-Aldrich) 84097 BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution (Merck/Sigma-Aldrich) 43816 BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
Terumo Syringe 1CC/mL Terumo Syringe 878499
Potassium chloride (Merck/Sigma-Aldrich) 60128
HEPES (Merck/Sigma-Aldrich) H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich 12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium Sigma-Aldrich D8662
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Tris hydrochloride Merck/Sigma-Aldrich 10812846001
Sodium dodecyl sulfate Merck/Sigma-Aldrich 436143
IGEPAL CA-630 Merck/Sigma-Aldrich I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111
Stainless steel grinding jar Retsch 02.462.0059
MM400 mixer mill Retsch 20.745.0001
Gradient Fractionator Brandel BRN-BR-188
Thermomixer R Eppendorf Z605271
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices Eppendorf Safe-Lock 30121023
Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific) A25977 PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm Beckman-Coulter 344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk Beckman-Coulter 331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices Merck UFC5030 Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge Cambridge Scientific 15566
Beckman Coulter Optima L-90K GMI 8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2 Thermofisher Scientific 159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermofisher Scientific 14-432-22
25 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1250
10 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1100
DNA lobind tubes Eppendorf 30108051
Cold Centrifuge 5810 R Eppendorf EP022628188 for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator Ratek OM11
Frezco 17 Microcentrifuge Thermofisher Scientific 75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor Beckman-Coulter 331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L Thermofisher Scientific 51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe BD Medical 328822
3 mL syringe with Luer Lok tip BD Medical 302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle Terumo TUAN2516R1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043 (2019).
  2. Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
  3. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  4. Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
  5. Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
  6. Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528 (2012).
  7. Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
  8. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
  9. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
  10. Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
  11. Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
  12. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706 (2012).
  13. Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473 (2018).
  14. Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219 (2013).
  15. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  16. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  17. Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416 (2017).
  18. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  19. Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
  20. Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
  21. Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
  22. Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406 (2018).
  23. Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
  24. Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
  25. Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30 (2016).
  26. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  27. Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
  28. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  29. Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
  30. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  31. Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
  32. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  33. Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732 (2015).
  34. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  35. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  36. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  37. Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
  38. Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
  39. Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
  40. Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
  41. Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
  42. Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212 (2019).
  43. Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
  44. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  45. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
  46. Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636 (2009).
  47. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  48. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  49. Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
  50. Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
  51. Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534 (2020).
  52. Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
  53. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134 (2014).
  54. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  55. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  56. Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
  57. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  58. Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
  59. Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
  60. Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
  61. Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
  62. Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
  63. Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Tags

Biologi utgave 178 øyeblikksbilde av proteinbiosyntese oversettelseskompleksstabilisering raske celleresponser cellulær stress ribosomale komplekser affinitetsrensing av oversettelses-mellomprodukter translasjonskontroll oversettelseskompleksprofilsekvensering TCP-seq ribosom (oversettelse) profilering ribo-seq ribosomsedimentering ved ultracentrifugation i sukrose gradient
Rask <em>in Vivo-fiksering</em> og isolering av translasjonskomplekser fra eukaryote celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., … More

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., Rug, M., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (178), e62639, doi:10.3791/62639 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter