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Biology

ड्रोसोफिला न्यूरल स्टेम सेल में सेल साइकिल प्रोग्रेशन एनालिसिस के लिए 5-एथिनाइल-2'-Deoxyuridine/फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 ड्यूल-लेबलिंग प्रोटोकॉल

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/62642
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

Summary

5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (एडयू) और फॉस्फो-हिस्टोन एच3 (पीएच3) लेबलिंग के साथ सेल चक्र विश्लेषण एक बहु-चरण प्रक्रिया है जिसके लिए व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में कोशिकाओं को अलग करने के लिए छवि विश्लेषण और मात्राकरण सहित इस प्रक्रिया के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है।

Abstract

वीवो सेल चक्र प्रगति विश्लेषण में नियमित रूप से माइटोसिस और डीएनए प्रतिकृति को विनियमित करने वाले जीन पर अध्ययन में किया जाता है। 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (एडयू) का उपयोग प्रतिकृति/एस-चरण प्रगति की जांच करने के लिए किया गया है, जबकि फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग माइटोटिक नाभिक और कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया गया है । दोनों लेबलों के संयोजन से जी0/जी1 (गैप चरण), एस (प्रतिकृति), और एम (माइटोटिक) चरणों का वर्गीकरण संभव होगा और कोशिका चक्र प्रगति पर मिटोटिक जीन नॉकडाउन या नल म्यूटेंट के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम करेगा । हालांकि, एडू-लेबल कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर् थ कई माध्यमिक एंटीबॉडी-फ्लोरोसेंट टैग के साथ असंगत हैं। यह इम्यूनोस्टेपिंग को जटिल बनाता है, जहां प्राथमिक और टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग पीएच 3-सकारात्मक माइटोटिक कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। यह पेपर ड्रोसोफिला लार्वा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में एडु और पीएच3 की दोहरी लेबलिंग के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मिटोटिक कारकों का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग की जाने वाली प्रणाली है। इसके अतिरिक्त, छवि विश्लेषण और मात्राकरण के लिए 3 अलग-अलग श्रेणियों, G0/G1, S, S>G2/M (एस से G2/M तक प्रगति) और एम चरणों में लेबल कोशिकाओं को आवंटित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है ।

Introduction

सेल डिवीजन चक्र में एक G1 चरण (पहला अंतर चरण), एक प्रतिकृति/एस-चरण, एक जी-2 (दूसरा अंतर चरण), और एक एम (माइटोटिक) चरण शामिल है । इन चरणों से गुजरते हुए, सेल सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन, अनुवाद और साइटोस्केलेल मशीनरी1,2के पुनः संगठन में नाटकीय परिवर्तन से गुजरता है। विकासात्मक और पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में, कोशिकाएं अस्थायी रूप से विभाजित हो सकती हैं और शांत (G0) बन जाती हैं या अंतर करती हैं और स्थायी रूप से3विभाजित करना बंद कर सकती हैं। डीएनए क्षति जैसे अन्य परिदृश्यों से समय से पहले भेदभाव या एपोप्टोसिस3,4हो सकता है। इस तरह के संकेतों के जवाब को सेल चक्र चौकियों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो विभाजन चक्र5के अगले चरण के लिए सेल द्वारा किए जाने से पहले आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए एक निगरानी प्रणाली के रूप में कार्य करती है। इसलिए, डीएनए प्रतिकृति, चौकियों, और माइटोटिक मशीनरी को विनियमित करने वाले जीन पर अध्ययन के लिए संभावित सेल चक्र प्रगति दोषों का विश्लेषण करने की आवश्यकता है जो उत्परिवर्ती कोशिकाओं में या इन जीनों के सिरना नॉकआउट पर हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, इस तरह के विश्लेषण समग्र सेल स्वास्थ्य के साथ ही दवा उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

5-ब्रोमो-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (BrdU) एक थायमिडीन एनालॉग है जिसे प्रतिकृति 6 के दौरान डीएनए में शामिल कियाजाताहै। एस-चरण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस विधि का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया था। हालांकि, कोशिकाओं को तब कठोर डीएनए डेनैचेशन प्रक्रियाओं के अधीन किया जाता है ताकि एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी6के उपयोग के माध्यम से BrdU का पता लगाने की अनुमति दी जा सके। यह कठोर उपचार सेलुलर एपिटोप को नुकसान पहुंचा सकता है और इम्यूनोस्टेपिंग के माध्यम से नमूने के आगे लक्षण वर्णन को रोक सकता है। एडू निगमन और बाद में एक तांबे उत्प्रेरक द्वारा पता लगाने, छोटे, सेल पारगम्य, फ्लोरोसेंटी टैग अज़ाइड रंगों के साथ ' क्लिक प्रतिक्रिया ' कठोर विकृति प्रक्रियाओं7की आवश्यकता को समाप्त करता है । इसलिए यह विधि बीआरडीयू निगमन के लिए अधिक व्यावहारिक विकल्प के रूप में उभरी ।

इसके अलावा, पीएच3 को माइटोटिक/एम चरण कोशिकाओं8के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में वर्णित किया गया है । हिस्टोन एच 3 एक डीएनए से जुड़ा कोर हिस्टोन प्रोटीन है जो देर से जी2 चरण के आसपास एम चरण में फॉस्फोरिलेटेड हो जाता है और एनाफेज 8 के अंत की ओर डी-फॉस्फोरिलेटेडहोताहै। मानक इम्यूनोस्टेपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीएच3 का पता लगाने के लिए कई वाणिज्यिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। इसलिए एडू और पीएच3 के दोहरे धुंधला होने से एस-फेज के साथ-साथ एम-फेज में कोशिकाओं का पता लगाने में मदद मिलेगी । इसके अतिरिक्त, G1 और जल्दी G2 चरण में कोशिकाओं को मार्कर में से किसी के लिए सकारात्मक दाग नहीं होगा ।

ड्रोसोफिला न्यूरल स्टेम सेल या न्यूरोब्लास्ट (एनबीएस) एक अच्छी तरह से विशेषता वाले स्टेम सेल मॉडल प्रदान करते हैं जिसमें कोशिकाएं विषम रूप से विभाजित होती हैं ताकि एक समान आत्म-नवीनीकरण एनबी और एक गैंगलियन मदर सेल (जीएमसी) का उत्पादन किया जा सके, जो भेदभाव9के लिए होता है। इसके अतिरिक्त, कई आनुवंशिक उपकरण और एनबी-विशिष्ट एंटीबॉडी इस प्रणाली को आनुवंशिक हेरफेर और लाइव-सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त बनाते हैं। नतीजतन, कई अध्ययनों ने एनबीएस का उपयोग असममित विभाजन और कोशिका भाग्य निर्धारण9को विनियमित करने वाले जीनों का अध्ययन करने के लिए किया है । एनबीएस की अलग-अलग आबादी केंद्रीय मस्तिष्क (सीबी) और लार्वा मस्तिष्क9के ऑप्टिक पालि (ओएल) में मौजूद है; सीबी एनबीएस का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था। ये तीसरा इंस्टार लार्वा सीबी एनबीएस बड़ी कोशिकाएं हैं जो माइटोटिक स्पिंडल असेंबली को विनियमित करने वाले कारकों का अध्ययन करने के लिए भी उपयुक्त हैं। सेल चक्र प्रगति दोषों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल ऐसे अध्ययनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा।

पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में वाणिज्यिक किट नियोजित थे, जैसे क्लिक-आईटी ईडू एलेक्सा फ्लोर सेल प्रसार किट, जो एडू निगमन और डिटेक्शन10के लिए एलेक्सा फ्लोर रंगों की एक किस्म के साथ टैग किए गए कई प्रतिक्रिया घटक और एजाइड रंग प्रदान करते हैं। हालांकि, इस तरह की किट के साथ आपूर्ति किए गए अभिवाक अक्सर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उपयोग किए जाने वाले कुछ फ्लोरोसेंट टैग के साथ संगत नहीं होते हैं। इस EdU डिटेक्शन किट (क्लिक करें-iT EdU Alexa सेल प्रसार किट Alexa Fluor ६४७-conjugated azide डाई के साथ आपूर्ति) Drosophila तीसरे इंस्टार लार्वा एनबीएस में परीक्षण किया गया था, और सह धुंधला pH3 और मिरांडा, एनबीए के लिए एक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ का प्रयास किया गया । इसके अलावा, एलेक्सा फ्लोर 568- या Cy3-टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग एनबीएस11की प्लाज्मा झिल्ली पर मिरांडा लेबलिंग का पता लगाने के लिए किया गया था। हालांकि, एडू डिटेक्शन के बाद इम्यूनोदाता किए जाने पर इन माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अपेक्षित सिग्नल तीव्रता और धुंधला पैटर्न (अप्रकाशित परिणाम) नहीं देखा गया।

एडू निगमन के लिए, दौल और सहयोगियों द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल में एडू और ब्रोमोफेनॉल ब्लू (बीपीबी)10के साथ मिश्रित कंकाल-सफेद माध्यम के साथ लार्वा को खिलाने की आवश्यकता थी। एडू और बीपीबी-नुकीला भोजन पर खिलाया गया लार्वा, जिसे लार्वा आंत में घूस पर इसके नीले रंग से देखा जा सकता है। यद्यपि इस विधि का उपयोग Mms19 हानि-ऑफ-फ़ंक्शन(Mms19P)तीसरे इंस्टार लार्वा में एडू निगमन के लिए किया गया था, लेकिन एमएमएस 19पी लार्वा ने स्पष्ट रूप से फ़ीड नहीं किया क्योंकि लार्वा आंत (अप्रकाशित परिणाम) में शायद ही कोई नीला रंग पाया गया था। Mms19पी लार्वा कठोर विकासात्मक विकृति दिखाते हैं और अंततः तीसरे इंस्टार चरण में गिरफ्तार होते हैं। यह किसी भी तरह तीसरे इंस्टार लार्वा के खिला व्यवहार को प्रभावित कर सकता है और ऐसे मामलों के लिए एडू-फीडिंग प्रोटोकॉल अनुपयुक्त प्रदान कर सकता है।

उपलब्ध साहित्य का अध्ययन करने और आवश्यक कदमों के मानकीकरण पर बड़े पैमाने पर काम करने के बाद, ड्रोसोफिला एनबीएस में एडयू/पीएच3 दोहरी लेबलिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया था, जिसमें लार्वा को एडु खिलाने की आवश्यकता नहीं है । एक पिछले अध्ययन दोहरी EdU कार्यरत/pH3 NBs में सेल चक्र का विश्लेषण करने के लिए धुंधला है, लेकिन एक विस्तृत प्रोटोकॉल4पेश नहीं किया । यह इस विधि को लागू करने की कोशिश कर प्रयोगशालाओं के लिए एक अनावश्यक बाधा प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, एडू किट के साथ विभिन्न अभिकर्मकों की अनुकूलता का मूल्यांकन करना और आगे अनुकूलन करना एक समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है। यह पत्र एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो विच्छेदित लार्वा दिमाग में एडू निगमन को शामिल करता है और एंटी-पीएच3 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसटेनिंग करता है, जिसके बाद चार अलग-अलग श्रेणियों में एनबी आवंटित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण किया जाता है: G0/G1 चरण, एस चरण, एस>G2/M (एस से जी2/एम तक प्रगति), और एम चरण । अनुकूलन की आवश्यकता वाले चरणों को रेखांकित किया जाता है और बड़े डेटासेट के छवि विश्लेषण के लिए दिए गए सुझाव दिए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, जंगली प्रकार के एनबीएस में EdU/pH3 readout का विश्लेषण किया जाता है और Mms19पी एनबीएस के साथ तुलना की जाती है, जिसे हाल ही में सेल चक्र देरी11दिखाने की सूचना दी गई थी ।

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Protocol

1. क्लिक-आईटी एडु परख के लिए रिएजेंट्स और स्टॉक्स की तैयारी

नोट: किट के साथ आपूर्ति की किट और अभिकर् ता के बारे में विवरण के लिए सामग्री और तालिका 1 की तालिका को देखें।

  1. समाधान तैयार करने से पहले शीशियों को कमरे के तापमान पर लाएं।
  2. डिमेथिल्सुफऑक्साइड (डीएमएसओ, कंपोनेंट सी) के 2 एमएल जोड़कर 10 एमएम एडु (कंपोनेंट ए) स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. डीएमएसओ (घटक सी) के 70μL जोड़कर एलेक्सा फ्लोर 647-एजाइड (घटक बी) का एक कार्य समाधान तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. इस समाधान के 4 एमएल को 36 एमएल डिवोनाइज्ड वॉटर के साथ मिलाकर क्लिक-विट एडयू रिएक्शन बफर (कंपोनेंट डी) का 1x घोल तैयार करें। शेष समाधान को 2-6 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. क्लिक-iT EdU बफर एडिटिव (कंपोनेंट एफ) का 10x स्टॉक (200 मिलीग्राम/एमएल) डिओनाइज्ड वॉटर का 2 एमएल डालकर बनाएं। अच्छी तरह से मिलाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. स्टोर Hoechst 33342 (घटक जी) 2-6 डिग्री सेल्सियस पर। -20 डिग्री सेल्सियस पर एक डिसिकेटर में डीएमएसओ (कंपोनेंट सी) स्टोर करें।
    नोट: दस्ताने DMSO और Hoechst को संभालने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

2. तीसरे इंस्टार लार्वा दिमाग और एडू निगमन का विच्छेदन

नोट: मस्तिष्क विच्छेदन के लिए प्रोटोकॉल पहले12वर्णित किया गया है । विच्छेदन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि एडू और पीएफए समाधानों की पर्याप्त मात्रा तैयार की जाती है और 2.6 और 3.1 में वर्णित के रूप में गल जाती है।

  1. 25.6 ग्राम एनए 2 एचपीओ 4 .7H2 0,80ग्राम एनएसीएल, 2 ग्राम केसीएल, और 2 ग्राम केएच2पीओ4 से 1 एल डिओनाइज्ड पानी जोड़कर10xफॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) तैयार करें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, और बाद में डिएक्रिड पानी में 1x समाधान तैयार करें।
  2. एक गिलास (3 या 9) अवसाद ग्लास स्पॉट प्लेट के लगातार दो अवसादों के लिए श्नाइडर्स विच्छेदन माध्यम (एसएम) जोड़ें। लगातार अगले डिप्रेशन में 1x पीबीएस जोड़ें।
  3. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, तीसरे इंस्टार लार्वा भटक उठाओ और पीबीएस के साथ गीला एक ऊतक पर जगह के लिए बंद मक्खी खाद्य अवशेषों को साफ । लार्वा को पीबीएस के साथ डिप्रेशन में रखें और फिर एसएम के साथ लगातार डिप्रेशन में रखें।
  4. ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, लार्वा के निचले शरीर के3/4 को हटा दें।
    1. धीरे-धीरे एक जोड़ी संदंश के साथ लार्वा मुंह हुक पकड़ो, और दूसरे छोर पर दूसरे छोर पर चित करने वाले को पकड़ें।
    2. लार्वा सिर को अंदर की ओर मुंह के हुक की ओर धकेलकर और साथ ही दूसरे छोर पर ऊतक को छीलने से बाहर की ओर मोड़ें।
  5. संलग्न कल्पनाशील डिस्क के साथ लार्वा मस्तिष्क का निरीक्षण करें। मस्तिष्क से जुड़े अन्य ऊतकों को हटा दें, और मस्तिष्क को एसएम के साथ लगातार अगले अवसाद में स्थानांतरित करें।
  6. 10 mM EdU स्टॉक समाधान गल। एसएम में इस 10 एमएम स्टॉक को कमजोर करके 100 माइक्रोन घोल तैयार करें।
  7. पाइरेक्स प्लेट पर एक और अवसाद में इस 100 μM EdU + SM समाधान के 100 μL जोड़ें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 100 माइक्रोन के 100 माइक्रोन में ~ 5-10 विच्छेदित दिमाग।
    नोट: चूंकि एनबीएस ~ 2 एच में एक बार विभाजित होते हैं, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक पूर्ण सेल चक्र का विश्लेषण करना है। केवल आगे के चरणों के लिए बरकरार दिमाग का उपयोग करें। विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त दिमाग को त्यागें।

3. फिक्सेशन और इम्यूनोदाता

  1. धूम हुड में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें।
    1. एक चुंबकीय उभारकर और 60 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गर्मी पर रखा एक बीकर में 1x पीबीएस के 80 मिलीएल करने के लिए पैराफॉर्मल्डिहाइड पाउडर के 4 ग्राम जोड़ें। पीएफए को भंग करने के लिए, 1 एन नाओएच की कुछ बूंदें जोड़ें। पीएच की जांच करें, और यदि आवश्यक हो तो 1 एम एचसीएल की कुछ बूंदों के साथ 7.0 पर समायोजित करें।
    2. वॉल्यूम को 1x पीबीएस के साथ 100 एमएल में एडजस्ट करें। पीएफए समाधान को अलीकोट करें और 1 महीने तक 2-6 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लार्वा मस्तिष्क जैसे बड़े ऊतकों के कुशल निर्धारण के लिए पीएफए समाधान में 0.3% गैर-आयनिक डिटर्जेंट (सामग्रीकी तालिका देखें) जोड़ें।
  2. एडू निगमन के बाद, दिमाग को 4% पीएफए युक्त 0.6 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 15 मिनट के लिए एक अखरोट पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। प्रयोगशाला बेंच पर ट्यूब टैप करें ताकि दिमाग ट्यूब के नीचे बस जाए।
  3. पीएफए निकालें और कमरे के तापमान पर पीबीएस + 0.3% गैर आयनिक डिटर्जेंट (पीबीएसटी) के साथ 3 बार धोएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक धोने एक नटेटर पर कम से कम 10 मिनट के लिए रहता है। आखिरी वॉश के बाद, पीबीएएसटी को हटा दें, अवरुद्ध समाधान (पीबीएएसटी + 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन) जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. तनु विरोधी मिरांडा एंटीबॉडी (1:250) और विरोधी pH3 एंटीबॉडी (1:200) PBST में (दोनों एक ही ट्यूब में एंटीबॉडी) । अवरुद्ध बफर को हटा दें, और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। एक नटेटर पर 2-6 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: मिरांडा सीबी एनबीएस पर मौजूद एक झिल्ली प्रोटीन है । यह सीबीक्षेत्रमें इन बडी गोल कोशिकाओं की पहचान करने का कार्य करता है .
  5. प्राइमरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन निकालें और पीबीएएसटी के साथ 3 बार धोएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक धोने कमरे के तापमान पर एक नटेटर पर 10 मिनट तक रहता है।
  6. पीबीएएसटी में 1:500 पतला एलेक्सा फ्लोर 488 एंटी-रैबिट और एलेक्सा फ्लोर 568 एंटी-रैट जोड़कर सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन तैयार करें। पीबीएएसटी निकालें, और विच्छेदित दिमाग में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। रात भर अंधेरे में 2-6 डिग्री सेल्सियस पर, एक नटेटर पर, और पीबीएएसटी (चरण 3.5) के साथ 3 बार धोएं।

4. एडू का पता लगाना, डीएनए धुंधला, और बढ़ते

  1. एडू डिटेक्शन कॉकटेल तैयार करने के लिए, 1.5 एमएल ट्यूब में घटकों (टेबल 2देखें) को मिलाएं।
  2. अंतिम धोने (चरण 3.6) के बाद, पीबीएएसटी को हटा दें, और विच्छेदित दिमाग में एडू डिटेक्शन कॉकटेल जोड़ें। एक नटेटर पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। अंधेरे में, प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएएसटी के साथ 2 बार धोएं।
  3. डीएनए धुंधला के लिए, तनु Hoechst ३३३४२ (घटक जी) 1:2,000 PBST में एक 5 μg/mL समाधान तैयार करने के लिए ।
  4. दूसरे धोने (चरण 4.2) के बाद पीबीएसएल निकालें, और विच्छेदित दिमाग में 5 μg/mL Hoechst समाधान के 500 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। Hoechst निकालें, और 10 मिनट के लिए PBST के साथ एक बार धो लें।
  5. लैब बेंच पर ट्यूब टैप करें, और दिमाग को बसने दें। ट्यूब से पीबीएएसटी निकालें, लेकिन केवल 50-100 माइक्रोन को पीछे छोड़ दें।
  6. एक 200 माइक्रोपिपेट टिप के अंत में कटौती करें, और ध्यान से दिमाग को एक साफ ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें। फिल्टर पेपर स्ट्रिप्स के साथ ब्लॉटिंग करके स्लाइड से अतिरिक्त पीबीएसटी निकालें। फिल्टर पेपर को दिमाग को न छूने दें, इसका ध्यान रखें।
  7. दिमाग पर पानी में घुलनशील, गैर-फ्लोरेस्किंग बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखो, और दिमाग को इस तरह उन्मुख करें कि वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड स्लाइड का सामना करे, और लोब्स ऊपर की ओर चेहरा हों। एक ही फाइल में दिमाग को व्यवस्थित करें ताकि दिमाग को क्रमिक रूप से छवि बनाना आसान हो।
  8. धीरे-धीरे दिमाग के ऊपर एक कवरलिप रखें। स्लाइड को रात भर 2-6 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: बढ़ते माध्यम रात भर भंडारण पर कठोर इतना है कि वहां कोई नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप सील करने की जरूरत है ।

5. इमेजिंग

नोट: लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और तेल विसर्जन इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल उद्देश्य पर विवरण के लिए सामग्री की मेज देखें ।

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से, 63x उद्देश्यका चयन करें ।
  2. बस घुड़सवार दिमाग के ऊपर कवरस्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखो यह आसान आंखों के माध्यम से ऊतक का पता लगाने के लिए बनाने के लिए ।
  3. DAPI/Hoechst ३३३४२ चैनल का उपयोग करना, आंखों के माध्यम से मस्तिष्क को खोजने के लिए, और फिर सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण मोड पर स्विच ।
  4. छवि Hoechst 33342 (डीएनए), एलेक्सा फ्लोर 488 (पीएच3), एलेक्सा फ्लोर 568 (मिरांडा), और एलेक्सा फ्लोर 647 (EdU) के लिए 4 चैनलों की स्थापना की। डाई-सहायक उपकरण का उपयोग करें, जो स्वचालित रूप से चयनित रंगों के लिए उत्तेजन लेजर और उत्सर्जन फिल्टर सेट करता है।
  5. देखने के क्षेत्र को इस तरह सेट करें कि इसमें पूरे मस्तिष्क पालि शामिल हैं। छवि जेड प्राप्त करके मस्तिष्क पालि की पूरी मात्रा-ढेर 0.8 माइक्रोन के अलावा दूरी पर। एक इमेजिंग सत्र से सभी छवियों को एक *.lif पुस्तकालय प्रारूप में स्टोर करें।

6. छवि विश्लेषण

नोट: निम्नलिखित कदम अधिग्रहीत छवियों के विश्लेषण का वर्णन करते हैं और कोशिकाओं को G0/G1 चरण, एस चरण, एस>G2/M (एस से G2/M तक की प्रगति) और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एम चरण में कैसे सॉर्ट करें।

  1. निम्नलिखित यूआरएल से फिजी (फिजी इमेजजे है) डाउनलोड करें: https://fiji.sc/। फिजी खोलें, फिर .lif फ़ाइलों को फिजी में खींचें और छोड़ दें।
    नोट: फिजी इमेजजे का एक संस्करण है जो कई प्लगइन्स 14 के साथपूर्व-स्थापित आताहै। फिजी में .lif फ़ाइलों को स्थानांतरित करने से बायो-फॉर्मेट प्लगइन खुलेगा, जो .lif फ़ाइलों को संसाधित करने के लिए आवश्यक है। कुछ अन्य माइक्रोस्कोप ब्रांडों से उत्पन्न छवि फ़ाइलों को खोलने के लिए जैव-प्रारूप प्लगइन की भी आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, निकॉन माइक्रोस्कोप से उत्पन्न एनडी2 फाइलें। यह प्लगइन फिजी के साथ पूर्व-स्थापित आता है।
  2. स्टैक व्यूइंग टैब से डेटा ब्राउज़र का चयन करें, और बायो-फॉर्मेट प्लगइन में मेमोरी मैनेजमेंट टैब से वर्चुअल स्टैक का उपयोग करें।
    नोट: 8-10 दिमाग से जेड-स्टैक के साथ Lif फ़ाइलें अक्सर आकार में 300-400 मेगाबाइट होती हैं। कम रैम वाले कंप्यूटरों पर, ऐसी कुछ फाइलें खोलने से इमेजजे पर उपलब्ध रैम तेजी से कम हो सकती है और आगे की छवि प्रसंस्करण को रोका जा सकता है। वर्चुअल स्टैक 'रीड-ओनली' है, प्रसंस्करण के लिए उच्च रैम की आवश्यकता नहीं है, और फिजी पर बड़े डेटासेट लोड करने के लिए एक आदर्श विकल्प है।
  3. इमेजजे में प्रदर्शित मल्टीचैनल इमेज का निरीक्षण करें। इमेज | रंग | चैनल टूल का उपयोग करके मेनू बार से चैनलों का रंगबदलें। सीबी क्षेत्र में बड़े गोल कोशिकाओं के रूप में मिरांडा लेबल एनबीएस का निरीक्षण करें ।
  4. दो बार एनबी की गिनती से बचने के लिए प्रत्येक एनबी पर एलिप्से टूल का उपयोग करके ब्याज (आरओआई) का एक क्षेत्र ड्रा करें।
    1. ImageJ मेनू बारसे, | उपकरणों का विश्लेषण | का चयन करें आरओआई प्रबंधक। वर्तमान जेड-सेक्शन में सभी एनबीएस को चिह्नित करें, और प्रत्येक सेल को चिह्नित करने के बाद टी दबाएं।
  5. एक बार वर्तमान जेड-सेक्शन में सभी एनबीएस चिह्नित हो जाते हैं, चैनलों को पीएच 3 और एडू में बदल दें, और मैन्युअल रूप से एडू-पॉजिटिव एनबीएस, पीएच3-पॉजिटिव एनबीएस की संख्या गिनें, एनबीएस दोनों EdU और pH3 के लिए सकारात्मक रूप से धुंधला हो जाते हैं, और एनबीए दोनों मार्कर के लिए धुंधला नहीं होते हैं।
  6. बाद के जेड-सेक्शन में एनबीएस की खोज करें, पुराने आरओआई को हटाएं, और विभिन्न ढेरों में एनबीए को गिनने के लिए नए आरओआई जोड़ें।
  7. निम्नलिखित स्तंभों के साथ एक स्प्रेडशीट तैयार करें: 1. EdU-pH3-: यह अनुभाग कोशिका चक्र के G0/G1 चरण में होने वाली दोहरी-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है; 2. EdU +: इस श्रेणी में कोशिकाओं ने EdU को शामिल किया है और डीएनए प्रतिकृति (एस-चरण) से गुजर रहे हैं; 3. EdU + pH3 +: इन दोहरी सकारात्मक कोशिकाओं ने एस चरण पूरा कर लिया है और जी 2 या एम चरण में प्रगति की है; 4. pH3 +: ये एनबीएस माइटोसिस से गुजर रहे हैं।
  8. प्रत्येक पालि के लिए उपरोक्त 4 श्रेणियों में से सभी में मौजूद एनबीएस के प्रतिशत की गणना करें। प्रत्येक श्रेणी में एनबीए के प्रतिशत के लिए पूल किए गए डेटा को दिखाने वाले स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक बार ग्राफ तैयार करें।

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Representative Results

द्वि-लोबेड ड्रोसोफिला थर्ड इंस्टार लार्वा मस्तिष्क को मौलिक सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग किया गया है9। वर्तमान अध्ययन का ध्यान एडू में सेल चक्र प्रगति के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करना था- और सीबी क्षेत्र के पीएच 3-लेबल वाले एनबीएस(चित्रा 1)। सीबी एनबीएस टाइप I और टाइप II में उप-विभाजित हैं, और वे विशेषता असममित डिवीजन पैटर्न9प्रदर्शित करते हैं। प्रत्येक प्रकार का आई एनबी डिवीजन एक एनबी उत्पन्न करता है, जो आत्म-नवीकरण करने में सक्षम है, और एक अन्य जीएमसी जो भेदभाव9के लिए मोटा है। इसके विपरीत, टाइप II एनबीएस पारगमन-बढ़ाना, अपरिपक्व तंत्रिका जनक कोशिकाओं (आईपीएस) उत्पन्न करते हैं जो स्वयं-नवीनीकृत होते हैं और 2 जीएमसी 9 उत्पन्नकरतेहैं। हालांकि एक अलग एनबी आबादी राजभाषा क्षेत्र में मौजूद है, इस अध्ययन सीबी एनबीए, जो बड़े और आसानी से एनबी विशिष्ट मार्कर के साथ पहचाने जाने योग्य है पर ध्यान केंद्रित किया ।

इस अध्ययन के लिए मिरांडा का इस्तेमाल सीबी एनबीएस(चित्रा 2)की पहचान और विश्लेषण करने के लिए किया गया था । हालांकि मिरांडा भी राजभाषा में अन्य सेल आबादी दाग, सीबी एनबीए अपने बड़े आकार और सीबी स्थान13के कारण मिरांडा के साथ पहचाना जा सकता है । अन्य अधिक विशिष्ट मार्कर का उपयोग सीबी एनबीएस को लेबल करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे डेडपैन, जो एनबी आत्म-नवीकरण को विनियमित करने वाला एक प्रतिलेखन कारक है। हालांकि, जैसा कि पीएच 3 और एडु दोनों क्रोमेटिन को चिह्नित करते हैं, झिल्ली मार्कर मिरांडा का उपयोग पीएच 3 और ईडीयू के साथ चिह्नित एनबीएस की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए आसान बनाने के लिए किया गया था। एडू निगमन, बाद में पता लगाने, और इम्यूनोसटेनिंग और छवि विश्लेषण द्वारा आगे लक्षण वर्णन एक जटिल प्रक्रिया है। इष्टतम धुंधला और इमेजिंग स्थितियों को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक चरण को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है। हालांकि कुछ प्रकाशित रिपोर्ट EdU/pH3 लेबलिंग रणनीतियों वर्तमान, इन रिपोर्टों अनुकूलन और छवि विश्लेषण कदम पर विस्तृत नहीं है । चित्र 1 में उल्लिखित कार्यप्रवाह छवि विश्लेषण तक एडू निगमन के चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है।

हमने हाल ही में Mms19 जीन की विशेषता है, जो सामान्य माइटोटिक प्रगति11के लिए एनबीए द्वारा आवश्यक है। लाइव-सेल इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से, कार्यात्मक Mms19 की कमी वाले एनबीएस को माइटोसिस को खत्म करने के लिए जंगली प्रकार के एनबीए के रूप में दो बार लेने के लिए दिखाया गया था। यह स्पष्ट रूप से EdU/pH3 विश्लेषण में परिलक्षित हुआ था जिसमें एमएमएसएस19पी एनबीएस का काफी अधिक अनुपात जंगली प्रकार के एनबीएस (चित्रा 3 ए)की तुलना में एम-फेज में पाया गया था । Mms19 की अभिव्यक्ति:: mms19पी पृष्ठभूमि में eGFP संलयन प्रोटीन11, 15फेनोटाइपिक दोषों को बचाने के लिए दिखाया गया था । यह कोशिका चक्र प्रगति विश्लेषण के परिणामों के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है जिसमें एम-चरण में कोशिकाओं के अनुपात को Mms19 पर जंगली प्रकार के स्तर तक बचाया गया था:: Mms19पी पृष्ठभूमि में eGFP अभिव्यक्ति (चित्रा 3A,बी)।

Figure 1
चित्रा 1:EdU/pH3 दोहरी लेबलिंग के लिए एक सरलीकृत कार्यप्रवाह । तीसरे इंस्टार लार्वा दिमाग को विच्छेदन किया गया और 2 घंटे के लिए 100 माइक्रोनएम एडू के साथ इनक्यूबेटेड किया गया। बाद में, मस्तिष्क के ऊतकों को पीएफए और इम्यूनोडांडारे के साथ मिरांडा और पीएच3 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ तय किया गया था। दागदार दिमाग की छवियां एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर प्राप्त की गई थीं और विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में कोशिकाओं को आवंटित करने के लिए इमेजजे/फिजी के साथ आगे संसाधित की गई थीं। संक्षिप्त रूप: एडु = 5-एथिनिल-2'-डिऑक्सीरिडीन के साथ; pH3 = फॉस्फो-हिस्टोन H3; पीएफए = पैराफॉर्मल्डिहाइड; एसएम = श्नाइडर्स विच्छेदन माध्यम; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर नमकीन; पीबीएसटी = पीबीएस + 0.3% गैर-आयनिक डिटर्जेंट; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:G1/G0 के लिए कोशिकाओं का आवंटन; S; S>G2/M और एम चरणों । कोशिकाओं जी 1, एस, जी 2, और एम चरणों के माध्यम से प्रगति के लिए एक पूर्ण सेल चक्र को पूरा । तीसरे इंस्टार लार्वा दिमाग भटक से सीबी एनबीएस मिरांडा (लाल), EdU (ग्रे), pH3 (ग्रीन), और डीएनए Hoechst ३३३४२ (नीला) के साथ लेबल किया गया था के साथ चिह्नित किया गया । लेबल एनबीएस ImageJ में विश्लेषण किया गया और 4 अलग चरणों के आधार पर आवंटित किया गया कि क्या वे(क) के लिए सकारात्मक दाग और न ही EdU (G1/G0),(बी)केवल EdU (एस चरण),(सी)दोनों EdU और pH3 (S>G2/M), और(डी)केवल pH3 (एम चरण) । केवल जंगली प्रकार के दिमाग से व्यक्तिगत एनबीए के उदाहरण यहां दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 5 माइक्रोन। संक्षिप्त: सीबी = केंद्रीय मस्तिष्क; एनबीएस = न्यूरोब्लास्ट; एडू = 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीरिडीन के साथ; pH3 = फॉस्फो-हिस्टोन H3। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-एनबी सेल चक्र चरण वितरण पर Mms19P का प्रभाव। (A)वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यू;+;+) एनबीएस के विश्लेषण पर ~ 25% एनबीएस एम-फेज में पाए गए । Mms19पी एनबीए में, हालांकि, यह अनुपात लगभग 40% तक बढ़ गया। Mms19:: Mms19पी पृष्ठभूमि में eGFP अभिव्यक्ति Mms19पी फेनोटाइप को बचाने के लिए जाना जाता है, और इस पृष्ठभूमि में एम चरण एनबीए का अनुपात जंगली प्रकार के बराबर था। (B)सेल चक्र चरणों G1/G0, S, S>G2/M, और एम के अनुरूप 4 विभिन्न श्रेणियों में एनबीए के प्रतिशत जंगली प्रकार भर में तुलना की गई; Mms19पी, और Mms19:: eGFP, Mms19पी जीनोटाइप। जंगली प्रकार के एनबीएस की तुलना में एमएमएसएस19पी एनबीएस में एम-फेज और जी-1/जी0 चरणों का अनुपात काफी अलग है । इसके विपरीत, Mms19 में एनबीएस के सेल चक्र वितरण:: eGFP, Mms19पी दिमाग जंगली प्रकार में पाया एक के बराबर हैं । डन के पोस्ट-टेस्ट का उपयोग करके क्रुस्कल-वालिस परीक्षण और कई स्तंभों का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व की गणना की गई थी; (पी<0.001) । इस आंकड़े को 11से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त नाम: एनबीएस = न्यूरोब्लास्ट; eGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; WT = जंगली प्रकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) राशि/मात्रा
एडू (घटक ए) 5 मिलीग्राम
एलेक्सा फ्लोर 647 - अज़ाइड (घटक बी) 1 शीशी
डिमेथाइल्सुमोक्साइड (डीएमएसओ, घटक सी) 4 एमएल
क्लिक करें-iT EdU प्रतिक्रिया बफर (घटक डी) 4 एमएल (10x समाधान)
कॉपर सल्फेट (CuSO4,घटक ई) 100 mM; 1 शीशी
क्लिक करें-iT EdU बफर योजक (घटक एफ) 400 मिलीग्राम
Hoechst 33342 (घटक जी) पानी में 10 मिलीग्राम/एमएल, 35 माइक्रोन

तालिका 1: EdU किट घटक। क्लिक-आईटी एडु एलेक्सा फ्लोर सेल प्रसार किट और संबंधित मात्रा/वॉल्यूम के साथ प्रदान किए गए घटक। संक्षिप्त नाम: एडु = 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीरिडीन के साथ।

रिएक्शन कंपोनेंट्स वॉल्यूम (एमएल)
1x क्लिक-iT प्रतिक्रिया बफर (चरण 1.4 में तैयार) 430
CuSO4 (घटक ई) 20
एलेक्सा फ्लोर 647 - azide (घटक बी, चरण 1.3 में तैयार) 1.2
रिएक्शन बफर योजक (घटक एफ, चरण 1.5 में तैयार) 50
कुल मात्रा ~500

तालिका 2: एडू डिटेक्शन कॉकटेल की तैयारी। एडू डिटेक्शन कॉकटेल किट घटकों (धारा 2 में तैयार) की संकेत मात्रा को मिलाकर तैयार किया गया था। संक्षिप्त नाम: एडु = 5-एथिनाइल-2'-डिऑक्सीरिडीन के साथ।

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Discussion

EdU निगमन और इसके बाद सेल-पारमी azide के साथ प्रतिक्रिया BrdU विधि पर इस तकनीक के व्यावहारिक लाभ प्रस्तुत करता है7पहले इस्तेमाल किया । हालांकि, इस प्रतिक्रिया को Cu (I) आयनों द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, और कई रंग इस तांबे उत्प्रेरक की उपस्थिति में अस्थिर हो सकते हैं, जैसा कि क्लिक-आईटी एडु किट निर्माता द्वारा स्पष्ट रूप से सलाह दी जाती है। जब एडु डिटेक्शन स्टेप को निष्पादित करने के बाद इम्यूनोदाता प्रयोग किए गए थे, तो लाल चैनल रंगों, एलेक्सा फ्लोर 568 और Cy3 के साथ अपेक्षित सिग्नल तीव्रता नहीं देखी गई थी। हालांकि, प्रोटोकॉल काम किया जब इम्यूनोदाता प्रतिक्रियाओं एडू का पता लगाने के कदम से पहले पूरा किया गया । इस प्रोटोकॉल के साथ, चार चैनलों का उपयोग Hoechst, pH3, मिरांडा और एडू की कल्पना करने के लिए किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में एक और अनुकूलित कदम लार्वा को एडू-नुकीला फ्लाई फूड खिलाने के विपरीत विच्छेदित दिमाग द्वारा एडू का तेज था। जैसा कि पूर्ण ड्रोसोफिला एनबी सेल चक्र लगभग 2-2.5 एच16के लिए रहता है, इस प्रोटोकॉल के रूप में 2.5 घंटे के लिए दिमाग द्वारा एडू तेज, एनबीएस के एक पूर्ण सेल चक्र की ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है। कोशिकाएं जो या तो एडू या पीएच 3 के लिए सकारात्मक रूप से दाग नहीं होती हैं कोशिकाओं को आराम कर रही हैं। एक तिहाई इंस्टार लार्वा के मामले में जिसमें एनबीएस सक्रिय रूप से विभाजित होते हैं, ये आराम कोशिकाएं कोशिका चक्र के G1 चरण में सबसे अधिक संभावना होगी। हालांकि, देर से भ्रूण से शुरुआती दूसरे इंस्टार चरणों तक, एनबीएस अस्थायी रूप से17शांत हो जाते हैं। इन प्रारंभिक विकास के चरणों में, डबल नकारात्मक धुंधला सबसे अधिक संभावना एक G0/शांत चरण का प्रतिनिधित्व करेंगे ।

डीएनए प्रतिकृति के दौर से गुजर एनबीएस EdU के लिए सकारात्मक दाग चाहिए, जबकि कोशिकाओं है कि एस चरण (EdU निगमन) से देर से G2 या एम चरण के लिए प्रगति की है दोनों EdU और pH3 के लिए सकारात्मक दाग चाहिए । हालांकि, जी 2 चरण का लक्षण वर्णन इस प्रोटोकॉल के साथ मुश्किल होगा क्योंकि जल्दी G2 कोशिकाएं ईडीयू या पीएच3 के लिए सकारात्मक रूप से दाग नहीं देती हैं। हालांकि, कोशिकाओं है कि EdU शामिल किया है और जल्दी G2 के लिए प्रगति की है भी EdU के लिए सकारात्मक दाग और G2 चरण के विश्लेषण जटिल सकता है । डीएनए प्रतिकृति को बाधित करने वाली कई दवाएं एस- चरण 18,19,20में कोशिका चक्र की गिरफ्तारी का कारण बनती हैं । यह प्रोटोकॉल एस-चरण-अवरुद्ध कोशिकाओं के रूप में ऐसी दवा उपचारों के प्रभाव का विश्लेषण और पहचान करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण हो सकता है, जो एम-चरण में प्रगति नहीं करेगा और एडू का अंश, पीएच3 डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को इस मामले में कम या अनुपस्थित भी किया जाएगा।

हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन में, हमने एनबीएस11में मिटोटिक प्रगति पर Mms19 जीन के प्रभाव का मूल्यांकन किया । लाइव-सेल इमेजिंग के माध्यम से, हमने एम-चरण प्रगति में Mms19पी एनबीएस की नाटकीय देरी का प्रदर्शन किया। जबकि जंगली प्रकार के एनबीएस ~ 10 मिनट में एम-चरण को पूरा करते हैं, Mms19पी एनबीएस ने एम-चरण11को खत्म करने के लिए लगभग दो गुना अधिक समय लिया । तदनुसार, इस EdU/pH3 दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल भी एक मिटोटिक देरी परिलक्षित के रूप में हम लगभग 1.5x के रूप में कई एनबीएस Mms19पी दिमाग में pH3 के लिए सकारात्मक धुंधला देखा के रूप में जंगली प्रकार के दिमाग की तुलना में । इस एडू प्रोटोकॉल से डेटा इस प्रकार प्रत्यक्ष लाइव-सेल इमेजिंग परिणामों के साथ तुलनीय है। इस तरह के प्रत्यक्ष, लाइव-सेल दृष्टिकोण समय लेने वाले होते हैं और व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विशिष्ट चरणों में दोषों को समझने के लिए ऐसे सेल चक्र म्यूटेंट की तेजी से प्रारंभिक स्क्रीनिंग करने के लिए किया जा सकता है। एक बार ब्याज के एक चरण की पहचान की है, यह तो प्रत्यक्ष सेल दृश्य परख द्वारा पीछा किया जा सकता है ।

सेल चक्र चरणों की अवधि विभिन्न सेल प्रकारों और विकासात्मक चरणों के बीच काफी भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला भ्रूण विकसित करने में, माइटोटिक किनेस के डाउनरेगुलेशन के परिणामस्वरूप एस चरण की विस्तारित अवधि होती है, जबकि कोशिकाओं में भेदभाव के लिए वसा होता है, जैसे फेरेट(मुसेला पुटोरियस फ्यूरो)मस्तिष्क तंत्रिका जनक, एस चरण की अवधि स्पष्ट रूप से कम21,22है। इस प्रकार दिए गए सेल प्रकार में एस और जी चरणों की लंबाई के आधार पर एडू पल्स लेबलिंग समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए। एडू पल्स की अवधि भी प्रायोगिक उद्देश्यों पर निर्भर करेगी, उदाहरण के लिए, एस-चरण में वर्तमान में कोशिकाओं के अंश को मापने के लिए एक छोटी नाड़ी पर्याप्त है, जबकि एक लंबी नाड़ी एस चरण के माध्यम से कोशिकाओं की प्रगति के विश्लेषण को सक्षम बनाती है।

एडू पल्स का व्यापक अनुकूलन भी एस चरण के अनुमान की अनुमति दे सकता है, जैसा कि परेरा और सहयोगियों द्वारा सुंदर ढंग से प्रदर्शित किया गयाथा। इन शोधकर्ताओं ने एक उपन्यास, प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का प्रदर्शन किया जिसमें एचसीटी 116 कोशिकाओं को वृद्धिशील समय अवधि के लिए एडू के साथ पल्स-लेबल किया गया था। लेखकों ने दर्शाया कि एडु की अधिकतम फ्लोरोसेंट तीव्रता तब प्राप्त की जाती है जब स्पंदन का समय एस चरण23की लंबाई से मेल खाता है । इसके अलावा, एडू-लेबल कोशिकाओं की लौकिक प्रगति के विश्लेषण ने जी 1 और जी-2/एम चरणों के परिमाणीकरण को भी सक्षम किया । यद्यपि EdU/pH3 दोहरी लेबलिंग के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल एस और एम चरण दोषों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है, यह इस प्रोटोकॉल के साथ चरणों की सटीक अवधि को मापने के लिए संभव नहीं है । परेरा और सहयोगियों द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल परख के लिए एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है जिसके लिए सेल चक्र चरण लंबाई के निर्धारण की आवश्यकता होती है। एक अतिरिक्त pH3 लेबलिंग के साथ इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने से एम चरण कोशिकाओं का पता लगाने में उच्च संवेदनशीलता भी हो सकती है।

एडू/पीएच3 दृष्टिकोण के अलावा, चलुओर्सेंट यूबाइक्विटिन-आधारित सेल चक्र संकेतक (FUCCI) विधि का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं के साथ-साथ ड्रोसोफिला ऊतकों24,25में सेल चक्र प्रगति का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है । यह प्रणाली दो फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन, जेमिनियन और सीडीटी 1 का उपयोग करती है, जिसमें एपीसी/सी और एससीएफएसकेपी 2द्वारा क्रमशः विशिष्ट सर्वव्यापकता और प्रोटेसोमल क्षरण के लिए रूपांकन होते हैं । जैसा कि एपीसी/सी जी 1 के माध्यम से माइटोसिस के अंत से ही सक्रिय है और एससीएफSkp2 एस और जी2 चरणों में सक्रिय है, सेल-चक्र-चरण-फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए मिथुन और सीडीटी1 का विशिष्ट क्षरण सेल चक्र चरण24के निर्धारण को सक्षम बनाता है। ड्रोसोफिला ऊतकों के लिए थोड़ा संशोधित 'फ्लाई-फोची' विधि, इसके बजाय, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए साइक्लिन बी और ई 2एफ 1 पर निर्भर करती है, जो एपीसी/सी (माइटोसिस के दौरान) और CRL4Cdt2 (एस-चरण शुरुआत के दौरान) द्वारा अपमानित किया जाता है, क्रमशः25। एन्यूप्लाइडी के जवाब में ड्रोसोफिला लार्वा एनबीएस के समय से पहले भेदभाव की विशेषता वाले पिछले अध्ययन में फ्लाई-एफयूसीआई और एडयू/पीएच3 विधियों4दोनों द्वारा कोशिका चक्र दोषों का विश्लेषण किया गया । एन्यूप्लाइडी एनबीएस के समय से पहले भेदभाव को प्रेरित करता है, और इसलिए, एनबीएस का एक उच्च अंश सेल चक्र से बाहर निकलता है।

यह फ्लाई-एफसीआई और एडयू/पीएच3 डेटा4दोनों में सही रूप से परिलक्षित हुआ था । इसलिए, एडू/पीएच3 विधि से प्राप्त आंकड़े फ्लाई-एफयूसीआई जैसे अन्य सेल चक्र-ट्रैकिंग विधियों के साथ भी तुलनीय हैं । फ्लाई-FUCCI एक शक्तिशाली उपकरण है, और ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों के लिए सर्वव्यापी रूप से संचालित फ्लोरोसेंट मार्कर या मार्कर के साथ सभी फ्लाई स्टॉक स्टॉक केंद्रों से उपलब्ध हैं। हालांकि, इन निर्माणों का उपयोग करने के लिए नल म्यूटेंट में सेल चक्र दोषों का विश्लेषण करने के लिए या सिराना नॉकडाउन के साथ आनुवंशिक पुनर्संयोजन शामिल करने के लिए एक मक्खी स्टॉक है कि FUCCI तत्वों, ऊतक विशिष्ट ड्राइवरों, एक विशिष्ट उत्परिवर्तन, या ब्याज की एक सिराना किया जाता है बनाने के लिए होगा । इस प्रक्रिया को कई हफ्तों के लिए वास्तविक प्रयोग में देरी होगी, जबकि EdU/pH3 विधि आसानी से एक आनुवंशिक नल पृष्ठभूमि के साथ लाइनों उड़ान भरने के लिए लागू किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, सिरना नॉकडाउन के लिए, एक ड्राइवर स्टॉक और एक सिराना स्टॉक के बीच एक कदम क्रॉस का उपयोग एडू/पीएच3 विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण की एक खामी इमेजिंग और छवि विश्लेषण पाइपलाइन है, जिसमें मस्तिष्क के कई नमूनों से बड़ी संख्या में कोशिकाओं का मैनुअल मात्राकरण शामिल है। हाल ही में, सेल चक्र विश्लेषण26के लिए पारंपरिक माइक्रोस्कोपी-आधारित परख के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विकल्प के रूप में एक प्रवाह साइटोमेट्री दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है। इस दृष्टिकोण के साथ एक ही समय में हजारों कोशिकाओं का तेजी से विश्लेषण लाभप्रद है, और कई मार्कर का पता लगाने की क्षमता विशिष्ट कोशिका प्रकारों के मात्राकरण को सक्षम बनाती है। हालांकि सुसंस्कृत सेल लाइनों के साथ आसानी से उपयोग करने योग्य, इस प्रोटोकॉल को ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क जैसे बड़े ऊतक नमूनों पर लागू करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, कुछ प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं जो मस्तिष्क के ऊतकों के वियोजन और अलग लार्वा एनबीएस के प्रवाह साइटोमेट्री27, 28द्वारा विश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस दिशा में और भी अभिनव दृष्टिकोण ड्रोसोफिला ऊतकों में उच्च-थ्रूपुट सेल चक्र विश्लेषण के लिए उपन्यास के अवसर प्रस्तुत कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (प्रोजेक्ट ग्रांट 31003A_173188; www.snf.ch) और यूनिवर्सिटी ऑफ बर्न (www.unibe.ch) से बी एस को फंडिंग से सपोर्ट मिला । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, पांडुलिपि को प्रकाशित करने या तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) Bloomington stock center #15477 P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19p Generated in house eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118 Bloomington stock center #3605 wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies Dilution
Rat anti-Miranda Abcam Ab197788 1/250
Rabbit anti-pH3 Cell Signaling 9701 1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3 Jackson Immuno 112-165-167 1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A27034 1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium Polysciences Inc 18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 Thermo Fischer Scientific C10340
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fischer Scientific 21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V Merck 10735078001
Triton X-100 Fischer Scientific 9002-93-1 non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej) https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X) Leica microsystems
PRISM Graph pad software Version 5
Microsoft Excel Microsoft office 2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

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References

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जीव विज्ञान अंक 171
<em>ड्रोसोफिला</em> न्यूरल स्टेम सेल में सेल साइकिल प्रोग्रेशन एनालिसिस के लिए 5-एथिनाइल-2'-Deoxyuridine/फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 ड्यूल-लेबलिंग प्रोटोकॉल
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Chippalkatti, R., Suter, B.… More

Chippalkatti, R., Suter, B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62642, doi:10.3791/62642 (2021).

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