Summary
Cellesyklusanalyse med 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) og fosfo-histon H3 (pH3) merking er en flertrinnsprosedyre som kan kreve omfattende optimalisering. Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver alle trinnene for denne prosedyren, inkludert bildeanalyse og kvantifisering for å skille celler i forskjellige cellesyklusfaser.
Abstract
In vivo cellesyklusprogresjonsanalyse utføres rutinemessig i studier på gener som regulerer mitose og DNA-replikasjon. 5-Ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) har blitt brukt til å undersøke replikerings-/S-faseprogresjon, mens antistoffer mot fosfo-histon H3 har blitt brukt til å markere mititotiske kjerner og celler. En kombinasjon av begge etikettene vil gjøre det mulig for klassifiseringen av G0/G1 (Gap fase), S (replikeringsmiddel) og M (mitotic) faser og tjene som et viktig verktøy for å evaluere effekten av mititotiske gen knockdowns eller null mutanter på celle syklus progresjon. Reagensene som brukes til å markere EdU-merkede celler er imidlertid inkompatible med flere sekundære antistoff-fluorescerende koder. Dette kompliserer immunstaining, der primære og taggede sekundære antistoffer brukes til å markere pH3-positive mititotiske celler. Dette dokumentet beskriver en trinnvis protokoll for dobbeltmerking av EdU og pH3 i Drosophila larval nevrale stamceller, et system som brukes mye til å studere mititotiske faktorer. I tillegg er det gitt en protokoll for bildeanalyse og kvantifisering for å tildele merkede celler i 3 forskjellige kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-faser.
Introduction
Celledelingssyklusen består av en G1-fase (første gapfase), en replikerings-/S-fase, en G2 -fase (andregapfase) og en M-fase (mitotisk). Gjennom disse fasene gjennomgår cellen dramatiske endringer i cellulær transkripsjon, oversettelse og reorganisering av cytoskeletal maskiner1,2. Som svar på utviklings- og miljøsignaler kan celler midlertidig slutte å dele seg og bli passiv (G0) eller differensiere og permanent slutte å dele3. Andre scenarier, for eksempel DNA-skade, kan forårsake for tidlig differensiering eller apoptose3,4. Respons på slike signaler formidles av cellesykluskontrollpunkter, som fungerer som et overvåkingssystem for å sikre integriteten til essensielle cellulære prosesser før cellen forplikter seg til neste fase av divisjonssyklusen5. Derfor må studier på gener som regulerer DNA-replikasjon, sjekkpunkter og mitotiske maskineri analysere mulige cellesyklusprogresjonsfeil som kan oppstå i mutantceller eller ved siRNA-nedslag av disse genene. I tillegg kan slike analyser brukes til å teste generell cellehelse samt cellulær respons på narkotikabehandling.
5-bromo-2'-deoksyuridin (BrdU) er en tymidanalog som er innlemmet i DNA under replikasjon6. Denne metoden ble mye brukt til å identifisere celler i S-fase. Cellene blir imidlertid utsatt for harde DNA-denatureringsprosedyrer for å tillate deteksjon av BrdU ved bruk av anti-BrdU-antistoffer6. Denne harde behandlingen kan skade cellulære epitoper og forhindre ytterligere karakterisering av prøven gjennom immunstaining. EdU-inkorporering og påfølgende deteksjon av en kobberkaalysert, "klikkreaksjon" med små, cellegjennomtrengelige, fluorescerende merkede azidefarger eliminerer behovet for harde denatureringsprosedyrer7. Denne metoden dukket derfor opp som et mer praktisk alternativ til BrdU-innlemmelse.
Videre har pH3 blitt beskrevet som en pålitelig markør for mititotiske / M faseceller8. Histone H3 er et DNA-assosiert kjerne histone protein som blir fosforylatert rundt slutten av G2-fasen til tidlig M-fase og er de-fosforilert mot slutten av anafase8. Flere kommersielle antistoffer kan brukes til å oppdage pH3 ved hjelp av standard immundempende protokoller. Dobbel farging av EdU og pH3 vil derfor muliggjøre deteksjon av celler i S-fase så vel som M-fase. I tillegg vil celler i G1 og tidlig G2-fase ikke farge positivt for noen av markørene.
Drosophila nevrale stamceller eller nevroblaster (NBs) tilbyr en godt karakterisert stamcellemodell der cellene deler seg asymmetrisk for å produsere en identisk selvfornyende NB og en ganglion morcelle (GMC), som er skjebnebestemt for differensiering9. I tillegg gjør flere genetiske verktøy og NB-spesifikke antistoffer dette systemet egnet for genetisk manipulasjon og levende celleavbildning. Følgelig har flere studier brukt NBs til å studere gener som regulerer asymmetriske divisjoner og celle skjebnebestemmelse9. Distinkte populasjoner av NBs eksisterer i den sentrale hjernen (CB) og den optiske loben (OL) i larvalhjernen9; CB NBs ble brukt til den nåværende studien. Disse tredje instar larval CB NBs er store celler som også er egnet for å studere faktorer som regulerer mitotisk spindelmontering. En protokoll for å analysere cellesyklusprogresjonsfeil ville være et viktig verktøy i slike studier.
Protokoller publisert tidligere brukte kommersielle sett, for eksempel Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som gir flere reaksjonskomponenter og azidefarger merket med en rekke Alexa Fluor-fargestoffer for EdU-inkorporering ogdeteksjon 10. Reagensene som leveres med slike sett er imidlertid ikke kompatible med noen fluorescerende koder som ofte brukes med sekundære antistoffer. Dette EdU-deteksjonssettet (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit levert med Alexa Fluor 647-konjugert azidefarge) ble testet i Drosophila tredje instar larval NBs, og co-farging ble forsøkt med antistoffer mot pH3 og Miranda, en markør for NBs. Videre ble Alexa Fluor 568- eller Cy3-taggede sekundære antistoffer brukt til påvisning av Miranda-merking på plasmamembranen til NBs11. Forventet signalintensitet og fargingsmønster (upubliserte resultater) ble imidlertid ikke observert med disse sekundære antistoffene da immunstaining ble utført etter EdU-deteksjon.
For EdU-inkorporering krevde protokollen beskrevet av Daul og kolleger fôring av larver med Kankel-White medium blandet med EdU og bromophenol blå (BPB)10. Larvene matet på EdU og BPB-spiked mat, som kunne ses av sin blå farge ved inntak i larval tarmen. Selv om denne metoden ble brukt til EdU-inkorporering i Mms19 funksjonstap (Mms19P) tredje instar larver, matet Mms19P larver tilsynelatende ikke da knapt noen blå farge ble oppdaget i larval tarmen (upubliserte resultater). Mms19P larver viser drastiske utviklingsdeformiteter og til slutt arrestasjon i tredje instar-stadium. Dette kan på en eller annen måte påvirke fôringsatferden til de tredje instar larver og gjøre EdU-fôringsprotokollen uegnet for slike tilfeller.
Etter å ha studert tilgjengelig litteratur og arbeidet mye med standardisering av viktige trinn, ble det foreslått en alternativ tilnærming for EdU / pH3 dual-labeling i Drosophila NBs, som ikke krever fôring av EdU til larver. En tidligere studie benyttet dobbel EdU / pH3 farging for å analysere cellesyklusen i NBs, men presenterte ikke en detaljert protokoll4. Dette presenterer et unødvendig hinder for laboratorier som prøver å implementere denne metoden. Videre kan evaluering av kompatibiliteten til ulike reagenser med EdU-settet og utføre ytterligere optimalisering være en tidkrevende prosess. Dette dokumentet presenterer en trinnvis protokoll som dekker EdU-inkorporering i dissekerte larvalhjerner og immunoppfatning med anti-pH3-antistoffer, etterfulgt av konfokal mikroskopi og bildeanalyse for å tildele NBer til fire forskjellige kategorier: G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-fase. Trinnene som trenger optimalisering er skissert og tips gitt for bildeanalyse av store datasett. I tillegg analyseres EdU/pH3-avlesningen i wild-type NBer og sammenlignes med Mms19P NBs, som nylig ble rapportert å vise en cellesyklusforsinkelse11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser og aksjer for Click-it EdU-analyse
MERK: Se materialtabellen og tabell 1 hvis du vil ha mer informasjon om settet og reagensene som følger med settet.
- Sørg for at hetteglassene har romtemperatur før du klargjør løsningene.
- Forbered 10 mM EdU (komponent A) lagerløsning ved å tilsette 2 ml dimetylsulfoksid (DMSO, komponent C). Bland godt og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered en arbeidsløsning av Alexa Fluor 647-azide (komponent B) ved å tilsette 70μL DMSO (komponent C). Bland godt og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered en 1x løsning av Click-iT EdU reaksjonsbuffer (komponent D) ved å blande 4 ml av denne løsningen med 36 ml deionisert vann. Oppbevar den gjenværende oppløsningen ved 2-6 °C.
- Lag en 10x lager (200 mg / ml) av Click-iT EdU buffertilsetning (komponent F) ved å tilsette 2 ml deionisert vann. Bland godt og oppbevar ved -20 °C.
- Oppbevar Hoechst 33342 (komponent G) ved 2-6 °C. Oppbevar DMSO (komponent C) i en tørkeapparat ved -20 °C.
MERK: Hansker bør brukes til å håndtere DMSO og Hoechst.
2. Disseksjon av tredje instar larval hjerner og EdU inkorporering
MERK: Protokollen for hjerne disseksjoner er beskrevet tidligere12. Før du starter disseksjonene, må du sørge for at tilstrekkelige mengder av EdU- og PFA-løsningene fremstilles og tines som beskrevet i 2.6 og 3.1.
- Forbered 10x fosfatbufret saltvann (PBS) ved å tilsette 25,6 g Na2HPO4,7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl og 2 g KH2PO4 til 1 L deionisert vann. Juster pH til 7,4, og lag deretter en 1x løsning i deionisert vann.
- Tilsett Schneiders disseksjonsmedium (SM) i to påfølgende depresjoner av en glass (3 eller 9) depresjon glass spot plate. Tilsett 1x PBS til neste påfølgende depresjon.
- Bruk et par tang, velg vandrende tredje instar larver og legg på et vev fuktet med PBS for å rense av fluematrester. Plasser larven i depresjonen med PBS og deretter i den påfølgende depresjonen med SM.
- Bruk et par fine tang, fjern 3/4th av larvens underkropp.
- Ta forsiktig tak i larvemunnkrokene med ett par tang, og hold neglebåndet i den andre enden med det andre par tang.
- Vri larvehodet ut og inn ved å skyve innover munnkrokene og samtidig skrelle av vevet i den andre enden.
- Vær oppmerksom på larvalhjernen med vedlagte imaginale plater. Fjern andre vev festet til hjernen, og overfør hjernen til neste påfølgende depresjon med SM.
- Tine 10 mM EdU lagerløsning. Forbered en 100 μM løsning ved å fortynne denne 10 mM lager i SM.
- Tilsett 100 μL av denne 100 μM EdU +SM-oppløsningen i en annen depresjon på Pyrex-platen. Inkuber ~5-10 dissekerte hjerner i 100 μL 100 μM EdU +SM-oppløsning i 2 timer ved 25 °C.
MERK: Ettersom NBs deler seg en gang i ~ 2 timer, tar denne protokollen sikte på å analysere en full cellesyklus. Bruk bare intakte hjerner for ytterligere trinn. Kast hjerner som er skadet under disseksjonen.
3. Fiksering og immunstaining
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning i en avtrekkshette.
- Tilsett 4 g paraformaldehydpulver til 80 ml 1x PBS i et beger plassert på en magnetisk omrører og varm til 60 °C. For å oppløse PFA, legg til noen dråper 1 N NaOH. Kontroller pH, og juster til 7.0 med noen dråper 1 M HCl om nødvendig.
- Juster volumet til 100 ml med 1x PBS. Aliquot PFA-oppløsningen og oppbevar den ved 2-6 °C i opptil 1 måned. Tilsett 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel (se materialtabellen) i PFA-løsningen for effektiv fiksering av store vev som larvalhjernen.
- Etter EdU inkorporering, overføre hjernen til 0,6 ml mikrocentrifuge rør som inneholder 4% PFA. Inkuber ved romtemperatur på en mutter i 15 min. Trykk på røret på laboratoriebenken slik at hjernen setter seg ned på bunnen av røret.
- Fjern PFA og vask 3 ganger med PBS + 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel (PBST) ved romtemperatur. Pass på at hver vask varer i minst 10 minutter på en mutter. Etter den siste vasken, fjern PBST, legg til blokkeringsløsning (PBST + 5% bovint serumalbumin), og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fortynn anti-Miranda antistoff (1:250) og anti pH3 antistoff (1:200) i PBST (begge antistoffer i samme rør). Fjern blokkeringsbufferen, og tilsett den primære antistoffløsningen. Inkuber over natten ved 2-6 °C på en mutter.
MERK: Miranda er et membranprotein til stede på CB NBs. Det tjener til å identifisere disse store runde cellene i CB-regionen13. - Fjern den primære antistoffoppløsningen og vask 3 ganger med PBST. Pass på at hver vask varer i 10 min på en mutter ved romtemperatur.
- Forbered sekundær antistoffløsning ved å tilsette 1:500 fortynnet Alexa Fluor 488 antikanin og Alexa Fluor 568 antirotte i PBST. Fjern PBST, og tilsett den sekundære antistoffløsningen i de dissekerte hjernene. Inkuber over natten ved 2-6 °C i mørket, på en mutter, og vask 3 ganger med PBST (trinn 3.5).
4. EdU-deteksjon, DNA-farging og montering
- For å tilberede EdU-deteksjonscocktailen, bland komponentene (se tabell 2) i et 1,5 ml rør.
- Etter den siste vasken (trinn 3.6), fjern PBST, og legg til EdU-deteksjonscocktailen til de dissekerte hjernene. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 30 min på en mutter. Vask 2 ganger med PBST i 10 min hver, i mørket.
- For DNA-farging, fortynn Hoechst 33342 (komponent G) 1:2,000 i PBST for å forberede en 5 μg / ml løsning.
- Fjern PBST etter den andre vasken (trinn 4.2), og tilsett 500 μL 5 μg/ml Hoechst-oppløsning til de dissekerte hjernene. Inkuber i mørket i 10 min. Fjern Hoechst, og vask en gang med PBST i 10 min.
- Trykk på røret på labbenken, og la hjernen slå seg ned. Fjern PBST fra røret, men la det bare være 50-100 μL.
- Klipp enden av en 200 μL mikropipettespiss, og overfør hjernen forsiktig til en ren glasssklie. Fjern overflødig PBST fra lysbildet ved å blåse opp med filterpapirstrimler. Vær forsiktig så du ikke lar filterpapiret berøre hjernen.
- Sett en dråpe vannløselig, ikke-fluorescerende monteringsmedium på hjernen, og orienter hjernen slik at ventral nerveledning vender mot lysbildet, og lobene vender oppover. Ordne hjernen i en enkelt fil slik at det er lettere å avbilde hjernene serielt.
- Plasser forsiktig en deksle på toppen av hjernen. Plasser skredet ved 2-6 °C over natten.
MERK: Monteringsmediet herdes ved lagring over natten, slik at det ikke er nødvendig å forsegle dekslene med neglelakk.
5. Bildebehandling
MERK: Se materialtabellen for detaljer om laserskanningsmikroskopet og målet for oljeinnlevelse som brukes i denne protokollen.
- Velg målsettingen 63xfra anskaffelsesprogramvaren.
- Sett en dråpe nedsenkningsolje på dekslene like over de monterte hjernene for å gjøre det lettere å finne vevet gjennom okularet.
- Bruk DAPI/Hoechst 33342-kanalen til å finne hjernen gjennom okularet, og bytt deretter til anskaffelsesmodus i programvaren.
- Sett opp 4 kanaler til bilde Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) og Alexa Fluor 647 (EdU). Bruk fargeassistentverktøyet, som automatisk setter opp eksitasjonslasere og utslippsfiltre for de valgte fargestoffene.
- Sett synsfeltet slik at det omfatter hele hjerneloben. Bilde hele volumet av hjernen lobe ved å anskaffe z-stabler fordelt 0,8 μm fra hverandre. Lagre alle bilder fra en bildeøkt i et LIF-bibliotekformat.
6. Bildeanalyse
MERK: Følgende trinn beskriver analysen av oppkjøpte bilder og hvordan du sorterer celler i G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progresjon fra S til G2/M) og M-fase ved hjelp av ImageJ-programvaren.
- Last ned Fiji (Fiji er ImageJ) fra følgende URL:https://fiji.sc/. Åpne Fiji, og dra og slipp deretter LIF-filene i Fiji.
MERK: Fiji er en versjon av ImageJ som kommer forhåndsinstallert med flere plugins14. Overføring av LIF-filer til Fiji vil åpne Bio-formater plugin, som er nødvendig for å behandle .lif filer. Bio-formater plugin er også nødvendig for å åpne bildefiler generert fra noen andre mikroskop merker, f.eks, nd2 filer generert fra et Nikon mikroskop. Denne pluginen kommer forhåndsinstallert med Fiji. - Velg Dataleser fra kategorien for stakkvisning, og bruk virtuell stakk fra kategorien minnebehandling i plugin-modulen for bioformater.
MERK: Lif-filer med z-stabler fra 8-10 hjerner er ofte 300-400 megabyte i størrelse. På datamaskiner med lite RAM kan åpning av noen få slike filer raskt tømme tilgjengelig RAM på ImageJ og forhindre ytterligere bildebehandling. Virtuell stakk er skrivebeskyttet, trenger ikke høy RAM for behandling, og er et ideelt alternativ for å laste store datasett på Fiji. - Vær oppmerksom på flerkanalsbildet som vises i ImageJ. Endre fargen på kanalene fra menylinjen ved hjelp av bilde | farge | kanalverktøy. Vær oppmerksom på de Miranda-merkede NB-ene som store runde celler i CB-regionen.
- Tegn en interesseregion (ROI) ved hjelp av ellipseverktøyet over hver NB for å unngå å telle NB to ganger.
- Velg Analyser | verktøy på ImageJ-menylinjen | ROI manager. Merk alle NBer i gjeldende z-inndeling, og trykk t etter at du har merket hver celle.
- Når alle NBs i den nåværende z-delen er merket, endrer du kanalene til pH3 og EdU, og teller manuelt antall EdU-positive NB-er, pH3-positive NBs, NBs som flekker positivt for både EdU og pH3, og NBs ikke flekker for begge markørene.
- Søk etter NBer i etterfølgende z-seksjoner, slett gamle ROIer, og legg til nye ROIer for å telle NBer i forskjellige stakker.
- Klargjør et regneark med følgende kolonner: 1. EdU- pH3-: Denne inndelingen representerer de dobbeltnegative cellene som er i G0/G1-fasen i cellesyklusen. 2. EdU +: cellene i denne kategorien har innlemmet EdU og gjennomgår DNA-replikasjon (S-fase); 3. EdU + pH3 +: Disse dobbeltpositive cellene har fullført S-fasen og har gått videre til G2- eller M-fase; 4. pH3 +: Disse NBs gjennomgår mitose.
- Beregn prosenter av NBer som finnes i alle de ovennevnte 4 kategoriene for hver lobe. Klargjør et stolpediagram ved hjelp av regnearkprogramvaren som viser de grupperte dataene for prosenter av NBer i hver kategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den bi-lobed Drosophila tredje instar larval hjernen har blitt brukt som et modellsystem for å studere grunnleggende cellulære og utviklingsmessige prosesser9. Fokuset i den nåværende studien var å presentere en protokoll for analyse av cellesyklusprogresjon i EdU- og pH3-merkede NBs i CB-regionen (figur 1). CB NBs er delt inn i type I og type II, og de viser det karakteristiske asymmetriske divisjonsmønsteret9. Hver type I NB-divisjon genererer en NB, som er i stand til selvfornyelse, og en annen GMC som er skjebnesvanger for differensiering9. I motsetning genererer type II NBs transittforsterkning, umodne nevrale stamceller (INPer) som selv fornyer og genererer 2 GPC-er9. Selv om det finnes en tydelig NB-befolkning i OL-regionen, fokuserte denne studien på CB NBs, som er store og lett identifiserbare med NB-spesifikke markører.
For denne studien ble Miranda brukt til å identifisere og analysere CB NBs (Figur 2). Selv om Miranda også flekker andre cellepopulasjoner i OL, kan CB NBs identifiseres med Miranda på grunn av deres store størrelse og CB-plassering13. Andre mer spesifikke markører kan også brukes til å merke CB NBs, for eksempel Deadpan, som er en transkripsjonsfaktor som regulerer NB-selvfornyelse. Men ettersom både pH3 og EdU markerer kromatinet, ble membranmarkøren Miranda brukt til å gjøre det lettere å visualisere og analysere NBs merket med pH3 og EdU. EdU-inkorporering, påfølgende deteksjon og videre karakterisering ved immunoppfatning og bildeanalyse er en kompleks prosedyre. Det er viktig å standardisere hvert trinn for å bestemme optimale farge- og bildeforhold. Selv om noen publiserte rapporter presenterer EdU/pH3-merkingsstrategier, utdyper ikke disse rapportene trinnene for optimalisering og bildeanalyse. Arbeidsflyten som er beskrevet i figur 1, oppsummerer trinnene fra EdU-inkorporering til bildeanalyse.
Vi karakteriserte nylig Mms19-genet, som kreves av NBs for normal mititotisk progresjon11. Gjennom live-celle bildeanalyser ble NBs manglende funksjonelle Mms19 vist å ta dobbelt så lang tid som wild-type NBs for å fullføre mitose. Dette ble tydelig reflektert i EdU/pH3-analysen, der en betydelig høyere andel mms19P NBer ble funnet å være i M-fasen sammenlignet med villtype NBs ( Figur3A). Uttrykk for Mms19::eGFP fusjonsproteinet i Mms19P-bakgrunnen hadde vist seg å redde fenotypiske defekter11,15. Dette korrelerte godt med resultatene fra cellesyklusprogresjonsanalysen der andelen celler i M-fase ble reddet til wild-type nivåer på Mms19::eGFP-uttrykk i Mms19P-bakgrunnen ( Figur3A,B).
Figur 1: En forenklet arbeidsflyt for dobbeltmerking av EdU/pH3. Tredje instar larval hjerner ble dissekert og inkubert med 100 μM EdU i 2 timer. Deretter ble hjernevevet løst med PFA og immunostert med antistoffer mot Miranda og pH3. Bilder av de fargede hjernene ble oppnådd på et konfokalt mikroskop og videre behandlet med ImageJ / Fiji for å tildele celler til forskjellige cellesyklusfaser. Forkortelser: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin; pH3 = fosfo-histone H3; PFA = paraformaldehyd; SM = Schneiders disseksjonsmedium; PBS = fosfatbufret saltvann; PBST = PBS + 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel; BSA = bovint serumalbumin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tildeling av celler til G1/G0; S; S>G2/M- og M-faser. Celler går gjennom G1-, S-, G2- og M-fasene for å fullføre en full cellesyklus. CB NBs fra vandrende tredje instar larval hjerner ble merket med Miranda (rød), EdU (grå), pH3 (grønn), og DNA ble merket med Hoechst 33342 (blå). Merkede NBer ble analysert i ImageJ og tildelt 4 forskjellige faser basert på om de farget positivt for (A) verken EdU eller pH3 (G1/G0), (B) bare EdU (S-fase), (C) både EdU og pH3 (S>G2/M) og (D) bare pH3 (M-fase). Eksempler på individuelle NBs bare fra wild-type hjerner er vist her. Skalastenger = 5 μm. Forkortelser: CB = sentral hjerne; NBs = nevroblaster; EdU = med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin; pH3 = fosfo-histone H3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av Mms19P på NB cellesyklusfasefordeling. (A) Ved analyse av wild-type (w;+;+) NBs ble ~25% NBs funnet å være i M-fase. I Mms19P NBs økte imidlertid denne andelen til nesten 40%. Mms19::eGFP-uttrykk i Mms19P-bakgrunnen er kjent for å redde Mms19P fenotyper, og andelen M fase NB i denne bakgrunnen var sammenlignbar med vill type. (B) Prosenter av NBer i 4 forskjellige kategorier som tilsvarer cellesyklusfaser G1/G0, S, S>G2/M og M ble sammenlignet på tvers av villtype; Mms19P og Mms19::eGFP, Mms19P genotyper. Andelen M-fase- og G1/G0-faser varierer betydelig i Mms19P NBs sammenlignet med wild-type NBs. Cellesyklusfordelingen av NBs i Mms19::eGFP, Mms19P-hjerner kan derimot sammenlignes med den som finnes i den ville typen. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av Kruskal-Wallis-testen og flere kolonner sammenlignet med Dunns ettertest; (P<0.001). Dette tallet er endret fra 11. Forkortelser: NBs = neuroblaster; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; WT = wild-type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Mengde/volum |
| EdU (komponent A) | 5 mg |
| Alexa Fluor 647 – azide (komponent B) | 1 hetteglass |
| Dimetylsulfoksid (DMSO, komponent C) | 4 ml |
| Click-iT EdU-reaksjonsbuffer (komponent D) | 4 ml (10x oppløsning) |
| Kobbersulfat (CuSO4, komponent E) | 100 mM; 1 hetteglass |
| Click-iT EdU-buffertilsetning (komponent F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (komponent G) | 10 mg/ml i vann, 35 μL |
Tabell 1: Komponenter i EdU-sett. Komponenter som følger med Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit og de respektive mengdene / volumene. Forkortelse: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin.
| Reaksjonskomponenter | Volum (ml) |
| 1x Click-iT-reaksjonsbuffer (utarbeidet i trinn 1.4) | 430 |
| CuSO4 (komponent E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – azide (komponent B, fremstilt i trinn 1.3) | 1.2 |
| Reaksjonsbuffertilsetning (komponent F, fremstilt i trinn 1.5) | 50 |
| Totalt volum | ~500 |
Tabell 2: Tilberedning av EdU-deteksjonscocktail. EdU-deteksjonscocktail ble tilberedt ved å blande de angitte volumene av settkomponentene (tilberedt i avsnitt 2). Forkortelse: EdU = med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdU inkorporering og dens påfølgende "klikk" reaksjon med cellegjennomtrengelig azide presenterer praktiske fordeler med denne teknikken over BrdU-metoden som ble brukt tidligere7. Imidlertid er denne reaksjonen katalysert av Cu (I) ioner, og flere fargestoffer kan være ustabile i nærvær av denne kobberkatalysatoren, som det tydelig anbefales av Click-it EdU-settprodusenten. Når immunsendende eksperimenter hadde blitt utført etter å ha utført EdU-deteksjonstrinnet, ble den forventede signalintensiteten ikke observert med de røde kanalfargene, Alexa Fluor 568 og Cy3. Protokollen fungerte imidlertid når immunstainende reaksjoner ble fullført før EdU-deteksjonstrinnet. Med denne protokollen ble fire kanaler brukt til å visualisere Hoechst, pH3, Miranda og EdU.
Et annet optimalisert skritt i denne protokollen var opptaket av EdU av dissekerte hjerner i motsetning til å mate EdU-spiked flymat til larver. Som hele Drosophila NB celle syklus varer i ca 2-2.5 h16, EdU opptak av hjerner for 2.5 h som i denne protokollen, muliggjør sporing av en full celle syklus av NBs. Celler som ikke flekker positivt for enten EdU eller pH3 er hvilende celler. Når det gjelder en tredje instar larve hvor NBs aktivt deler seg, vil disse hvilecellene mest sannsynlig være i G1-fasen av cellesyklusen. Men fra sen embryonal til tidlig andre instar stadier, NBs midlertidig bli passiv17. I disse tidlige utviklingsstadiene vil dobbeltnegative flekker mest sannsynlig representere en G0/passiv fase.
NBs under DNA-replikasjon bør flekke positivt for EdU, mens celler som har utviklet seg fra S-fasen (EdU-inkorporering) til slutten av G2- eller M-fasen, skal flekke positivt for både EdU og pH3. Karakterisering av G2-fasen vil imidlertid være vanskelig med denne protokollen, da tidlige G2-celler ikke flekker positivt for EdU eller pH3. Celler som har innlemmet EdU og har utviklet seg til tidlig G2, vil imidlertid også farge positivt for EdU og kunne komplisere analysen av G2-fasen. Flere legemidler som hemmer DNA-replikasjon forårsaker cellesyklusstans ved S-fase18,19,20. Denne protokollen kan være et praktisk verktøy for å analysere og identifisere effekten av slike narkotikabehandlinger som S-fase-blokkerte celler ville ikke gå videre til M-fasen, og brøkdelen av EdU, pH3 dobbeltpositive celler ville bli redusert eller til og med fraværende i dette tilfellet.
I en nylig publisert studie evaluerte vi effekten av Mms19-genet på mititotisk progresjon i NBs11. Gjennom live-celle bildebehandling demonstrerte vi en dramatisk forsinkelse av Mms19P NBs i M-faseprogresjon. Mens wild-type NBs fullfører M-fasen på ~ 10 min, tok Mms19P NBs omtrent dobbelt så mye tid å fullføre M-fase11. Følgelig reflekterte denne EdU / pH3 dual-labeling-protokollen også en mititotisk forsinkelse da vi observerte nesten 1,5 ganger så mange NBs som farget positivt for pH3 i Mms19P-hjerner sammenlignet med ville hjerner. Data fra denne EdU-protokollen kan dermed sammenlignes med de direkte live-celleavbildningsresultatene. Som sådan direkte, live-celle tilnærminger er tidkrevende og trenger omfattende optimalisering, kan denne protokollen brukes til å utføre en rask innledende screening av slike cellesyklusmutanter for å forstå feil på bestemte stadier. Når en fase av interesse er identifisert, kan dette deretter følges opp av direkte cellevisualiseringsanalyser.
Varigheten av cellesyklusfaser kan variere betydelig mellom ulike celletyper og utviklingsstadier. For eksempel, i utviklingen av Drosophila embryoer, nedregulering av mititotiske kinases resulterer i en lengre varighet av S-fasen, mens i celler skjebnesvangert for differensiering, for eksempel ferret (Mustela putorius furo) hjernen nevrale forfedre, S fase varigheten er markert kort21,22. EdU pulsmerkingstid bør derfor optimaliseres avhengig av lengden på S- og G-fasene i den gitte celletypen. Varigheten av EdU-pulsen vil også avhenge av de eksperimentelle målene, for eksempel er en kort puls tilstrekkelig til å måle brøkdelen av cellene som for tiden er i S-fasen, mens en lengre puls muliggjør analyse av utviklingen av celler gjennom S-fasen.
Omfattende optimalisering av EdU-puls kan også tillate estimering av S-fase, som ble elegant demonstrert av Pereira og kolleger23. Disse forskerne demonstrerte en ny, strømningscytometribasert metode der HCT116-celler ble pulsmerket med EdU i trinnvise tidsperioder. Forfatterne viste at maksimal fluorescerende intensitet av EdU oppnås når pulserende tid samsvarer med lengden på S fase23. Videre aktiverte analyse av den tidsmessige progresjonen av EdU-merkede celler også kvantifiseringen av G1- og G2/M-fasene. Selv om den nåværende protokollen for EdU/pH3 dual-labeling muliggjør analyse av S- og M-fasefeil, er det ikke mulig å måle den nøyaktige varigheten av faser med denne protokollen. Protokollen beskrevet av Pereira og kolleger kan være et passende alternativ for analyser som krever bestemmelse av cellesyklusfaselengder. Tilpasning av denne protokollen med ytterligere pH3-merking kan også føre til høyere følsomhet ved registrering av M-faseceller.
Bortsett fra EdU / pH3-tilnærmingen, har fluorescent ubiquitin-basert cellesyklusindikator (FUCCI) -metoden også blitt brukt til å studere cellesyklusprogresjon i pattedyrceller så vel som i Drosophila vev24,25. Dette systemet benytter to fluorescerende merkede proteiner, geminin og Cdt1, som inneholder motiver for spesifikk allestedsnærværende og proteasomal nedbrytning av henholdsvis APC / C og SCFSkp2. Siden APC/C bare er aktiv fra slutten av mitose gjennom G1 og SCFSkp2 er aktiv i S- og G2-fasene, muliggjør den cellesyklusspesifikke nedbrytningen av fluorescerende merket geminin og Cdt1 bestemmelse av cellesyklusfasen24. En litt modifisert 'Fly-FUCCI' metode for Drosophila vev er i stedet avhengig av fluorescerende merket Cyclin B og E2F1, som forringes av APC / C (under mitose) og CRL4Cdt2 (under S-fase utbrudd), henholdsvis25. En tidligere studie som karakteriserer for tidlig differensiering av Drosophila larval NBs som svar på aneuploidy analyserte cellesyklusfeil ved både Fly-FUCCI og EdU / pH3-metoder4. Aneuploidy induserer for tidlig differensiering av NBs, og derfor går en høy brøkdel av NBs ut av cellesyklusen.
Dette ble nøyaktig reflektert i både Fly-FUCCI- og EdU/pH3-data4. Data hentet fra EdU/pH3-metoden er derfor også sammenlignbare med andre cellesyklussporingsmetoder som Fly-FUCCI. Fly-FUCCI er et kraftig verktøy, og alle fluebestandene med allestedsnærværende drevne fluorescerende markører eller markører smeltet sammen til vevsspesifikke promotorer er tilgjengelige fra lagersentre. Å bruke disse konstruksjonene til å analysere cellesyklusfeil i nullmutanter eller med siRNA-knockdown vil imidlertid innebære genetisk rekombinasjon for å skape en fluebestand som bærer FUCCI-elementene, vevsspesifikke drivere, en bestemt mutasjon eller en siRNA av interesse. Denne prosessen vil forsinke det faktiske eksperimentet i flere uker, mens EdU / pH3-metoden lett kan brukes på flylinjer med genetisk nullbakgrunn. Alternativt, for siRNA-knockdowns, kan en ett-trinns kryss mellom en driver lager og en siRNA lager brukes til EdU / pH3 analyse.
En ulempe ved denne tilnærmingen er bilde- og bildeanalyserørledningen, som innebærer manuell kvantifisering av et stort antall celler fra flere hjerneprøver. Nylig har en strømningscytometri tilnærming blitt presentert som et høygjennomstrømningsalternativ til en konvensjonell mikroskopibasert analyse for cellesyklusanalyse26. Den raske analysen av tusenvis av celler samtidig med denne tilnærmingen er fordelaktig, og evnen til å oppdage flere markører muliggjør kvantifisering av bestemte celletyper. Selv om denne protokollen er lett å bruke med kultiverte cellelinjer, kan den være vanskelig å bruke på store vevsprøver som Drosophila larvalhjernen. Imidlertid er det publisert noen få protokoller som beskriver hjernevev dissosiasjon og analyse av isolerte larval NBs ved strømning cytometri27,28. Ytterligere innovative tilnærminger i denne retningen kan presentere nye muligheter for høygjennomstrømningscellesyklusanalyse i Drosophila-vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært at det ikke finnes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Swiss National Science Foundation (prosjektstipend 31003A_173188; www.snf.ch) og Universitetet i Bern (www.unibe.ch) til BS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
