Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

5-этинил-2'-дезоксиуридин / фосфо-гистон H3 Двойной протокол маркировки для анализа прогрессирования клеточного цикла в нервных стволовых клетках дрозофилы

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/62642
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

Summary

Анализ клеточного цикла с маркировкой 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и фосфогистона H3 (pH3) является многоэтапной процедурой, которая может потребовать обширной оптимизации. Здесь мы представляем подробный протокол, который описывает все этапы этой процедуры, включая анализ изображений и количественную оценку для различения клеток в разных фазах клеточного цикла.

Abstract

Анализ прогрессирования клеточного цикла in vivo обычно проводится в исследованиях генов, регулирующих митоз и репликацию ДНК. 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) был использован для исследования репликативного / S-фазного прогрессирования, тогда как антитела против фосфогистона H3 были использованы для маркировки митотических ядер и клеток. Комбинация обеих меток позволит классифицировать фазы G0 /G1 (фаза разрыва), S (репликативная) и M (митотическая) фазы и послужит важным инструментом для оценки влияния митотических нокдаунов генов или нулевых мутантов на прогрессирование клеточного цикла. Однако реагенты, используемые для маркировки клеток, меченных EdU, несовместимы с несколькими вторичными антителами-флуоресцентными метками. Это усложняет иммуноокрашивание, когда первичные и меченые вторичные антитела используются для маркировки pH3-положительных митотических клеток. В этой статье описывается пошаговый протокол двойной маркировки EdU и pH3 в нервных стволовых клетках личинок Drosophila, система, широко используемая для изучения митотических факторов. Кроме того, предоставляется протокол для анализа и количественной оценки изображений для выделения меченых клеток в 3 различных категориях: G0/ G1, S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и M фаз.

Introduction

Цикл деления клеток включает фазу G1 (первая фаза зазора), репликативную/S-фазу, G2 (вторая фаза разрыва) и M(митотическую) фазу. Проходя через эти фазы, клетка претерпевает драматические изменения в клеточной транскрипции, трансляции и реорганизации цитоскелетного аппарата1,2. В ответ на сигналы развития и окружающей среды клетки могут временно перестать делиться и становиться покоящимися (G0) или дифференцироваться и постоянно переставать делиться3. Другие сценарии, такие как повреждение ДНК, могут вызвать преждевременную дифференцировку или апоптоз3,4. Реакция на такие сигналы опосредована контрольными точками клеточного цикла, которые действуют как система наблюдения для обеспечения целостности основных клеточных процессов до того, как клетка перейдет к следующей фазе цикла деления5. Поэтому исследования генов, регулирующих репликацию ДНК, контрольные точки и митотический механизм, должны анализировать возможные дефекты прогрессирования клеточного цикла, которые могут возникать в мутантных клетках или при нокдауне siRNA этих генов. Кроме того, такие анализы могут быть использованы для проверки общего здоровья клеток, а также клеточных реакций на медикаментозное лечение.

5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU) является аналогом тимидина, который включается в ДНК во время репликации6. Этот метод широко использовался для идентификации клеток в S-фазе. Однако затем клетки подвергаются жестким процедурам денатурации ДНК, чтобы позволить обнаружить BrdU с помощью антител против BrdU6. Это жесткое лечение может повредить клеточные эпитопы и предотвратить дальнейшую характеристику образца путем иммуноокрашивания. Включение EdU и последующее обнаружение катализируемой медью «щелкающей реакции» с небольшими, проницаемыми клетками, флуоресцентно мечеными азидными красителями устраняет необходимость в жестких процедурах денатурации7. Таким образом, этот метод стал более практичной альтернативой инкорпорации BrdU.

Кроме того, pH3 был описан как надежный маркер для митотических /М фазовых клеток8. Гистон H3 представляет собой ДНК-ассоциированный основной гистоновый белок, который фосфорилируется примерно в конце фазы G2 до ранней фазы M и дефосфорилируется к концу анафазы8. Несколько коммерческих антител могут быть использованы для обнаружения pH3 с использованием стандартных протоколов иммуноокрашения. Таким образом, двойное окрашивание EdU и pH3 позволит обнаруживать клетки как в S-фазе, так и в М-фазе. Кроме того, клетки в фазе G1 и ранней фазе G2 не окрашиваются положительно ни для одного из маркеров.

Нервные стволовые клетки Drosophila или нейробласты (NB) предлагают хорошо охарактеризованную модель стволовых клеток, в которой клетки делятся асимметрично, чтобы произвести один идентичный самообновляющийся NB и ганглиозную материнскую клетку (GMC), которая предназначена для дифференцировки9. Кроме того, несколько генетических инструментов и NB-специфических антител делают эту систему подходящей для генетических манипуляций и визуализации живых клеток. Следовательно, в нескольких исследованиях использовались NB для изучения генов, регулирующих асимметричные деления и определение судьбы клеток9. Различные популяции NB существуют в центральном мозге (CB) и зрительной доле (OL) личиночного мозга9; Для текущего исследования использовались CB NB. Эти третьи личинки CB NB представляют собой крупные клетки, которые также подходят для изучения факторов, регулирующих сборку митотического веретена. Протокол для анализа дефектов прогрессирования клеточного цикла будет жизненно важным инструментом в таких исследованиях.

Протоколы, опубликованные ранее, использовали коммерческие наборы, такие как Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, которые предоставляют несколько реакционных компонентов и азидных красителей, помеченных различными красителями Alexa Fluor для включения и обнаруженияEdU 10. Однако реагенты, поставляемые с такими наборами, не совместимы с некоторыми флуоресцентными метками, часто используемыми со вторичными антителами. Этот набор для обнаружения EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, поставляемый с Alexa Fluor 647-конъюгированным азидным красителем) был протестирован на Drosophila third instar NB, и было предпринято совместное окрашивание антителами против pH3 и Miranda, маркером для NB. Кроме того, вторичные антитела, помеченные Alexa Fluor 568 или Cy3, были использованы для обнаружения маркировки Miranda на плазматической мембране NBs11. Однако ожидаемая интенсивность сигнала и картина окрашивания (неопубликованные результаты) не наблюдались с этими вторичными антителами при иммуноокрашивании после обнаружения EdU.

Для включения EdU протокол, описанный Даулом и его коллегами, требовал кормления личинок средой Канкеля-Уайта, смешанной с EdU и бромфеноловым синим (BPB)10. Личинки питались пищей с шипами EdU и BPB, что можно было увидеть по их синему цвету при проглатывании в личиночном кишечнике. Хотя этот метод был использован для включения EdU в mms19 потеря функции(Mms19P)третьими личинками звезды, личинки Mms19P, по-видимому, не питались, поскольку в личиночной кишке почти не было обнаружено синего цвета (неопубликованные результаты). Личинки Mms19P демонстрируют резкие деформации развития и в конечном итоге останавливаются на третьей стадии. Это может каким-то образом повлиять на пищевое поведение личинок третьей звезды и сделать протокол кормления EdU непригодным для таких случаев.

После изучения имеющейся литературы и обширной работы над стандартизацией основных этапов был предложен альтернативный подход для двойной маркировки EdU/pH3 у Drosophila NBs, которая не требует кормления EdU личинкам. Предыдущее исследование использовало двойное окрашивание EdU/pH3 для анализа клеточного цикла в NB, но не представило подробного протокола4. Это представляет собой ненужное препятствие для лабораторий, пытающихся реализовать этот метод. Кроме того, оценка совместимости различных реагентов с комплектом EdU и выполнение дальнейшей оптимизации могут быть трудоемким процессом. В этой статье представлен пошаговый протокол, который охватывает включение EdU в рассеченный личиночный мозг и иммуноокрашивание антителами против pH3, за которым следует конфокальная микроскопия и анализ изображений для выделения NB по четырем различным категориям: фаза G0 / G1, фаза S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и фаза M. Описаны шаги, требующие оптимизации, и приведены советы по анализу изображений больших наборов данных. Кроме того, анализируются показания EdU/pH3 в НБ дикого типа и сравниваются с Mms19P NB, которые, как недавно сообщалось, показывают задержку клеточного цикла11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов и запасов для анализа Click-it EdU

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о комплекте и реагентах, поставляемых с комплектом, см. в Таблице материалов и Таблице 1.

  1. Доведите флаконы до комнатной температуры перед приготовлением растворов.
  2. Готовят 10 мМ EdU (компонент А) стокового раствора, добавляя 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО, компонент С). Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
  3. Готовят рабочий раствор Alexa Fluor 647-азида (компонент B) путем добавления 70 мкл DMSO (компонент C). Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
  4. Готовят 1-кратный раствор реакционного буфера Click-iT EdU (компонент D), смешивая 4 мл этого раствора с 36 мл деионизированной воды. Хранить оставшийся раствор при 2-6 °C.
  5. Сделайте 10-кратный запас (200 мг/мл) буферной добавки Click-iT EdU (компонент F), добавив 2 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать и хранить при -20 °C.
  6. Хранить Hoechst 33342 (компонент G) при температуре 2-6 °C. Хранить ДМСО (компонент С) в осушителе при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки следует использовать для обработки DMSO и Hoechst.

2. Рассечение мозга личинок третьей звезды и инкорпорация EdU

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для рассечения мозга был описанранее 12. Перед началом вскрытия убедитесь, что подготовлено и разморожено достаточное количество растворов EdU и PFA, как описано в 2.6 и 3.1.

  1. Приготовьте 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), добавив 25,6 г Na2HPO4.7H 20, 80 г NaCl, 2 г KCl и 2 г KH2PO4 к 1 л деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 7,4, а затем приготовьте 1-кратный раствор в деионизированной воде.
  2. Добавьте среду рассечения Schneiders (SM) к двум последовательным углублениям стеклянной (3 или 9) пластины с депрессионным стеклом. Добавьте 1x PBS к следующему последовательному депрессии.
  3. Используя пару щипцов, соберите блуждающих личинок третьей звезды и поместите на ткань, смочещенную PBS, чтобы очистить остатки пищи мухи. Поместите личинку в депрессию с PBS, а затем в последовательную депрессию с SM.
  4. Используя пару мелких щипцов, удалите3/4 нижней части тела личинки.
    1. Осторожно схватите личиночные крючки рта одной парой щипцов, а другой парой щипцов удерживайте кутикулу.
    2. Выверните личиночную головку наизнанку, протолкнув внутрь ротовые крючки и одновременно отклеив ткань на другом конце.
  5. Понаблюдайте за личиночным мозгом с прикрепленными воображаемыми дисками. Удалите другие ткани, прикрепленные к мозгу, и переведите мозг к следующей последовательной депрессии с SM.
  6. Разморозьте 10 мМ EdU. Приготовьте раствор 100 мкМ, разбавляя этот запас 10 мМ в СМ.
  7. Добавьте 100 мкл этого 100 мкМ раствора EdU+SM в другое углубление на пластине Pyrex. Инкубируют ~5-10 рассеченных мозгов в 100 мкл 100 мкМ раствора ЭдУ+СМ в течение 2 ч при 25 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку NB делятся один раз в ~ 2 ч, этот протокол направлен на анализ одного полного клеточного цикла. Используйте только неповрежденный мозг для дальнейших шагов. Отбросьте мозги, которые повреждены во время рассечения.

3. Фиксация и иммуноразрашивание

  1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (ПФА) в вытяжном шкафу.
    1. Добавьте 4 г порошка параформальдегида в 80 мл 1x PBS в стакан, помещенный на магнитную мешалку, и нагрейте до 60 °C. Чтобы растворить PFA, добавьте несколько капель 1 N NaOH. Проверьте pH и отрегулируйте до 7,0 с помощью нескольких капель 1 M HCl, если это необходимо.
    2. Отрегулируйте громкость до 100 мл с 1x PBS. Аликвот раствор ПФА и хранить при 2-6 °C до 1 месяца. Добавьте 0,3% неионное моющее средство (см. Таблицу материалов)в раствор PFA для эффективной фиксации крупных тканей, таких как личиночный мозг.
  2. После включения EdU переведите мозг в микроцентрифужные трубки объемом 0,6 мл, содержащие 4% PFA. Инкубировать при комнатной температуре на питателе в течение 15 мин. Постучите по трубке на лабораторном стенде так, чтобы мозги расположились на дне трубки.
  3. Снимите PFA и смойте 3 раза PBS + 0,3% неионным моющим средством (PBST) при комнатной температуре. Убедитесь, что каждая стирка длится не менее 10 минут на нутаторе. После последней промывки удалить ПБСТ, добавить блокирующий раствор (ПБСТ + 5% бычий сывороточный альбумин) и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Разбавляют анти-Мирандовое антитело (1:250) и антитело против рН3 (1:200) в ПБСТ (оба антитела в одной пробирке). Удалите блокирующий буфер и добавьте раствор первичного антитела. Инкубировать на ночь при 2-6 °C на нутаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Миранда является мембранным белком, присутствующим на CB NB. Он служит для идентификации этих больших круглых клеток в области CB13.
  5. Удалить раствор первичных антител и промыть 3 раза ПБСТ. Убедитесь, что каждая стирка длится в течение 10 минут на нутаторе при комнатной температуре.
  6. Готовят раствор вторичных антител, добавляя 1:500 разбавленных Alexa Fluor 488 против кролика и Alexa Fluor 568 против крыс в PBST. Удалите PBST и добавьте раствор вторичных антител к рассеченному мозгу. Инкубировать на ночь при 2-6 °C в темноте, на нутаторе, и промыть 3 раза PBST (шаг 3,5).

4. Обнаружение EdU, окрашивание ДНК и монтаж

  1. Для приготовления коктейля обнаружения EdU смешайте компоненты (см. таблицу 2)в пробирке объемом 1,5 мл.
  2. После последней промывки (шаг 3.6) удалите PBST и добавьте коктейль обнаружения EdU в рассеченный мозг. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин на нутризаторе. Промыть 2 раза ПБСТ по 10 мин, в темное время суток.
  3. Для окрашивания ДНК разбавьте Hoechst 33342 (компонент G) 1:2000 в PBST для получения раствора 5 мкг/мл.
  4. Удаляют PBST после второй промывки (этап 4.2) и добавляют 500 мкл 5 мкг/мл раствора Hoechst в рассеченный мозг. Инкубировать в темноте в течение 10 мин. Удалить Hoechst, и промыть один раз с PBST в течение 10 мин.
  5. Нажмите трубку на лабораторный стенд, и пусть мозги успокоятся. Извлеките ПБСТ из пробирки, но оставьте после себя только 50-100 мкл.
  6. Вырежьте конец наконечника микропипетки объемом 200 мкл и аккуратно перенесите мозги на чистый стеклянный слайд. Удалите лишний PBST со слайда, промокнув полосками фильтровальной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не позволить фильтровальной бумаге коснуться мозга.
  7. Поместите каплю водорастворимой, нефлуоресцентной монтажной среды на мозг и сориентируйте мозг так, чтобы вентральный нервный шнур был обращен к скольжению, а лопасти — вверх. Расположите мозг в одном файле, чтобы было легче изображать мозг последовательно.
  8. Аккуратно поместите обшивку поверх мозга. Поместите горку при температуре 2-6 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная среда затвердевает при ночном хранении, так что нет необходимости герметизировать крышку лаком для ногтей.

5. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о лазерном сканирующем микроскопе и масляно-погружном объективе, используемом в этом протоколе.

  1. В программном обеспечении для сбора выберите цель 63x.
  2. Нанесите каплю погружного масла на крышку чуть выше установленных мозгов, чтобы было легче найти ткань через окуляр.
  3. Используя канал DAPI/Hoechst 33342, найдите мозг через окуляр, а затем переключитесь в режим сбора в программном обеспечении.
  4. Настройте 4 канала для изображения Hoechst 33342 (ДНК), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) и Alexa Fluor 647 (EdU). Используйте инструмент dye-assistant, который автоматически настраивает лазеры возбуждения и эмиссионные фильтры для выбранных красителей.
  5. Установите поле зрения таким образом, чтобы оно охватывало всю долю мозга. Представьте себе весь объем доли мозга, получив z-стеки, расположенные на расстоянии 0,8 мкм друг от друга. Храните все изображения из сеанса обработки изображений в формате библиотеки *.lif.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают анализ полученных изображений и способы сортировки клеток на фазу G0 / G1, фазу S, S>G2 / M (прогрессия от S до G2 / M) и фазу M с помощью программного обеспечения ImageJ.

  1. Загрузите Fiji (Fiji is ImageJ) по следующему URL-адресу: https://fiji.sc/. Откройте Fiji, а затем перетащите файлы .lif на Фиджи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fiji - это версия ImageJ, которая поставляется с предустановленными с несколькими плагинами14. Передача файлов .lif на Фиджи откроет плагин Bio-formats, который необходим для обработки файлов .lif. Плагин bio-formats также необходим для открытия файлов изображений, сгенерированных из некоторых других марок микроскопов, например, файлов nd2, сгенерированных из микроскопа Nikon. Этот плагин поставляется с предустановленным с Фиджи.
  2. Выберите Браузер данных на вкладке просмотра стека и используйте виртуальный стек на вкладке управления памятью в плагине биоформатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Lif файлы с z-стеками от 8-10 мозгов часто имеют размер 300-400 мегабайт. На компьютерах с низким объемом оперативной памяти открытие нескольких таких файлов может быстро истощить доступную оперативную память на ImageJ и предотвратить дальнейшую обработку изображений. Виртуальный стек является «доступным только для чтения», не требует большого объема оперативной памяти для обработки и является идеальным вариантом для загрузки больших наборов данных на Фиджи.
  3. Наблюдайте за многоканальным изображением, отображаемым в ImageJ. Измените цвет каналов из строки меню с помощью инструмента «Изображение | цвет | каналы». Наблюдайте за помеченными Мирандой NB как большими круглыми клетками в области CB.
  4. Нарисуйте интересующую область (ROI) с помощью инструмента эллипс над каждым NB, чтобы избежать подсчета NB дважды.
    1. В строке меню ImageJвыберите анализ инструментов | | Менеджер roi. Отметьте все NB в текущем z-сечении и нажмите клавишу t после пометки каждой ячейки.
  5. После того, как все NB в текущем z-сечении помечены, измените каналы на pH3 и EdU и вручную подсчитайте количество EdU-положительных NB, pH3-положительных NB, NB, окрашивающихся положительно как для EdU, так и для pH3, и NB, не окрашивающихся для обоих маркеров.
  6. Поиск NB в последующих z-разделах, удаление старых ROI и добавление новых ROI для подсчета NB в разных стеках.
  7. Подготовьте электронную таблицу со следующими столбцами: 1. EdU-pH3-: в этом разделе представлены двойные отрицательные клетки, которые находятся в фазе G0/G1 клеточного цикла; 2. EdU+: клетки этой категории включили EdU и проходят репликацию ДНК (S-фаза); 3. EdU+ pH3+: эти двойные положительные клетки завершили S-фазу и перешли в фазу G2 или M; 4. pH3+: эти NB подвергаются митозу.
  8. Рассчитайте процентное содержание NB, присутствующих во всех вышеуказанных 4 категориях для каждой доли. Подготовьте гистограмму с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами, показывающую объединенные данные для процентов NB в каждой категории.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двулопастный мозг drosophila third instar larval был использован в качестве модельной системы для изучения фундаментальных клеточных процессов и процессов развития9. Основное внимание в текущем исследовании было уделено представлению протокола для анализа прогрессирования клеточного цикла в EdU- и pH3-меченых NB области CB(рисунок 1). CB NB подразделяются на тип I и тип II, и они отображают характерную асимметричную схему деления9. Каждое подразделение NB типа I генерирует NB, который способен к самообновлению, и другой GMC, который предназначен для дифференциации9. Напротив, NB типа II генерируют транзитно-усиливающие, незрелые нейронные клетки-предшественники (INPs), которые самообновляются и генерируют 2 GMC9. Хотя в регионе OL существует отдельная популяция NB, это исследование было сосредоточено на CB NB, которые являются большими и легко идентифицируемыми с помощью маркеров, специфичных для NB.

Для этого исследования Миранда использовалась для выявления и анализа CB NB(рисунок 2). Хотя Миранда также окрашивает другие клеточные популяции в OL, CB NB могут быть идентифицированы с Miranda из-за их большого размера и расположения CB13. Другие более специфические маркеры также могут быть использованы для маркировки CB NB, таких как Deadpan, который является транскрипционным фактором, регулирующим самообновление NB. Однако, поскольку и pH3, и EdU отмечают хроматин, мембранный маркер Miranda был использован для облегчения визуализации и анализа NB, отмеченных pH3 и EdU. Включение EdU, последующее обнаружение и дальнейшая характеристика путем иммуноокрашивания и анализа изображений является сложной процедурой. Важно стандартизировать каждый шаг, чтобы определить оптимальные условия окрашивания и визуализации. Хотя в некоторых опубликованных отчетах представлены стратегии маркировки EdU/pH3, в этих отчетах не рассматриваются этапы оптимизации и анализа изображений. Рабочий процесс, описанный на рисунке 1, суммирует шаги от включения EdU до анализа изображений.

Недавно мы охарактеризовали ген Mms19, который необходим НБ для нормальной митотической прогрессии11. С помощью анализов визуализации живых клеток было показано, что NB, лишенным функционального Mms19, занимают в два раза больше времени, чем NB дикого типа, чтобы закончить митоз. Это было четко отражено в анализе EdU/pH3, в котором было обнаружено, что значительно более высокая доля Mms19P NB находится в М-фазе по сравнению с NB дикого типа (рисунок 3A). Было показано, что экспрессия белка слияния Mms19::eGFP на фоне Mms19P спасает фенотипические дефекты11,15. Это хорошо коррелировало с результатами анализа прогрессирования клеточного цикла, в котором доля клеток в М-фазе была спасена до уровней дикого типа при экспрессии Mms19::eGFP на фоне Mms19P (рисунок 3A,B).

Figure 1
Рисунок 1:Упрощенный рабочий процесс для двойной маркировки EdU/pH3. Третий личиночный мозг был рассечен и инкубирован со 100 мкМ ЭдУ в течение 2 ч. Впоследствии мозговую ткань фиксировали с помощью PFA и иммунораступили антителами против Миранды и рН3. Изображения окрашенного мозга были получены на конфокальном микроскопе и дополнительно обработаны с помощью ImageJ / Fiji для выделения клеток для различных фаз клеточного цикла. Сокращения: EdU = с 5-этинил-2'-дезоксиуридином; pH3 = фосфогистон H3; PFA = параформальдегид; SM = среда рассечения Шнайдера; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PBST = PBS + 0,3% неионное моющее средство; BSA = сывороточный альбумин крупного рогатого скота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Выделение ячеек в G1/G0; S; Фазы S>G2/M и M. Клетки проходят через фазы G1, S, G2 и M, чтобы завершить полный клеточный цикл. CB NB из блуждающего мозга третьей звезды личинок были отмечены Miranda (красный), EdU (серый), pH3 (зеленый), а ДНК была помечена Hoechst 33342 (синий). Меченые NB были проанализированы в ImageJ и распределены по 4 различным фазам в зависимости от того, окрашивались ли они положительно для(A) ни EdU, ни pH3 (G1 / G0),(B)только EdU (S фаза),(C)как EdU, так и pH3 (S>G2 / M), и(D)только pH3 (M фаза). Примеры отдельных NB только из мозга дикого типа показаны здесь. Шкала стержней = 5 мкм. Сокращения: CB = центральный мозг; NB = нейробласты; EdU = с 5-этинил-2'-дезоксиуридином; pH3 = фосфогистон H3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Влияние Mms19P на распределение фаз NB клеточного цикла. (A) При анализе НБ дикого типа (w;+;+) ~25% НБ оказались в М-фазе. Однако в Mms19P NB эта доля увеличилась почти до 40%. Известно, что экспрессия Mms19::eGFP на фоне Mms19P спасает фенотипы Mms19P, и доля NB фазы M на этом фоне была сопоставима с диким типом. (B)Процентное содержание NB в 4 различных категориях, соответствующих фазам клеточного цикла G1/G0, S, S>G2/M, сравнивалось по диким типам; Генотипы Mms19P и Mms19::eGFP, Mms19P. Доля фаз M-фазы и фаз G1/G0 значительно отличается в Mms19P NB по сравнению с NB дикого типа. Напротив, распределение NB в клеточном цикле в мозге Mms19::eGFP, Mms19P сопоставимо с тем, которое обнаружено в диком типе. Статистическая значимость была рассчитана с использованием теста Крускала-Уоллиса и нескольких столбцов, сравниваемых с использованием пост-теста Данна; (П<0,001). Этот показатель был изменен с 11. Сокращения: NB = нейробласты; eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Реагент Объем/объем
ЭдУ (компонент А) 5 мг
Alexa Fluor 647 – азид (компонент B) 1 флакон
Диметилсульфоксид (ДМСО, компонент С) 4 мл
Реакционный буфер Click-iT EdU (компонент D) 4 мл (10x раствор)
Сульфат меди (CuSO4,компонент E) 100 мМ; 1 флакон
Буферная добавка Click-iT EdU (компонент F) 400 мг
Hoechst 33342 (компонент G) 10 мг/мл в воде, 35 мкл

Таблица 1: Компоненты комплекта EdU. Компоненты, поставляемые с набором для пролиферации флюоровых клеток Click-iT EdU Alexa и соответствующими объемами/объемами. Аббревиатура: EdU = с 5-этинил-2'-дезоксиуридином.

Реакционные компоненты Объем (мл)
1x реакционный буфер Click-iT (подготовлен на этапе 1.4) 430
CuSO4 (компонент E) 20
Alexa Fluor 647 – азид (компонент B, полученный на этапе 1.3) 1.2
Реакционная буферная добавка (компонент F, полученный на этапе 1.5) 50
Общий объем ~500

Таблица 2: Приготовление коктейля для детектирования ЭдУ. Коктейль обнаружения EdU готовили путем смешивания указанных объемов компонентов набора (приготовленных в разделе 2). Аббревиатура: EdU = с 5-этинил-2'-дезоксиуридином.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Инкорпорация EdU и ее последующая «щелкающая» реакция с проницаемым в клетки азидом представляют практические преимущества этой методики по сравнению с методом BrdU, используемымранее 7. Однако эта реакция катализируется ионами Cu(I), и некоторые красители могут быть нестабильными в присутствии этого медного катализатора, что явно рекомендуется производителем комплекта Click-it EdU. Когда эксперименты с иммуноокрашиванием проводились после выполнения этапа обнаружения EdU, ожидаемая интенсивность сигнала не наблюдалась с красителями красного канала, Alexa Fluor 568 и Cy3. Тем не менее, протокол работал, когда иммуноокрашивающие реакции были завершены до этапа обнаружения EdU. С помощью этого протокола четыре канала использовались для визуализации Hoechst, pH3, Miranda и EdU.

Другим оптимизированным шагом в этом протоколе было поглощение EdU рассеченным мозгом, в отличие от кормления личинок мух с шипами EdU. Поскольку полный клеточный цикл Drosophila NB длится примерно 2-2,5 ч16,поглощение EdU мозгом в течение 2,5 ч, как в этом протоколе, позволяет отслеживать один полный клеточный цикл NB. Клетки, которые не окрашиваются положительно ни для EdU, ни для pH3, являются покоящимися клетками. В случае третьей звездной личинки, в которой NB активно делятся, эти покоящиеся клетки, скорее всего, будут находиться в фазе G1 клеточного цикла. Однако от поздней эмбриональной до ранней второй стадии звезды NB временно становятсяпокоящимися 17. На этих ранних стадиях развития двойное отрицательное окрашивание, скорее всего, будет представлять собой фазу G0 / покоя.

NB, подвергающиеся репликации ДНК, должны окрашиваться положительно для EdU, тогда как клетки, которые прогрессировали от S-фазы (включение EdU) до поздней фазы G2 или M, должны окрашивать положительно как для EdU, так и для pH3. Тем не менее, характеристика фазы G2 была бы затруднена с этим протоколом, поскольку ранние клетки G2 не окрашиваются положительно для EdU или pH3. Тем не менее, клетки, которые включили EdU и прогрессировали до раннего G2, также положительно окрашиваются для EdU и могут усложнить анализ фазы G2. Несколько препаратов, ингибирующих репликацию ДНК, вызывают остановку клеточного цикла в S-фазе18,19,20. Этот протокол может быть удобным инструментом для анализа и идентификации эффекта таких лекарственных препаратов, поскольку клетки, заблокированные S-фазой, не будут прогрессировать до М-фазы, а доля EdU, pH3 двойных положительных клеток будет уменьшена или даже отсутствовать в этом случае.

В недавно опубликованном исследовании мы оценили влияние гена Mms19 на митотическое прогрессирование в NB11. С помощью визуализации живых клеток мы продемонстрировали резкую задержку Mms19PNB в прогрессировании M-фазы. В то время как NB дикого типа завершают M-фазу за ~ 10 минут, Mms19P NB потребовалось примерно в два раза больше времени, чтобы закончить M-фазу11. Соответственно, этот протокол двойной маркировки EdU/ pH3 также отражал митотическую задержку, поскольку мы наблюдали почти в 1,5 раза больше NB, окрашивающих положительно pH3 в мозге Mms19P по сравнению с мозгом дикого типа. Таким образом, данные из этого протокола EdU сопоставимы с прямыми результатами визуализации живых клеток. Поскольку такие прямые подходы с живыми клетками отнимают много времени и нуждаются в обширной оптимизации, этот протокол может быть использован для выполнения быстрого первоначального скрининга таких мутантов клеточного цикла для понимания дефектов на определенных этапах. Как только фаза интереса идентифицирована, за этим могут последовать прямые анализы визуализации клеток.

Продолжительность фаз клеточного цикла может значительно варьироваться между различными типами клеток и стадиями развития. Например, при развитии эмбрионов дрозофилы понижение регуляции митотических киназ приводит к увеличению продолжительности S-фазы, в то время как в клетках, обреченных на дифференцировку, таких как хорек(Mustela putorius furo)нейронных предшественников мозга, продолжительность S-фазы заметно коротка21,22. Таким образом, время маркировки импульсов EdU должно быть оптимизировано в зависимости от длины фаз S и G в данном типе клеток. Продолжительность импульса EdU также будет зависеть от экспериментальных целей, например, короткий импульс достаточен для измерения доли клеток, находящихся в настоящее время в S-фазе, в то время как более длинный импульс позволяет анализировать прогрессирование клеток через S-фазу.

Обширная оптимизация импульса EdU может также позволить оценить S-фазу, что было элегантно продемонстрировано Перейрой и его коллегами23. Эти исследователи продемонстрировали новый метод, основанный на проточной цитометрии, в котором клетки HCT116 были мечены пульсом EdU в течение дополнительных периодов времени. Авторы продемонстрировали, что максимальная флуоресцентная интенсивность EdU получается, когда время пульсации соответствует длине S фазы23. Кроме того, анализ временной прогрессии клеток, меченных EdU, также позволил количественно оценить фазы G1 и G2 / M. Хотя текущий протокол двойной маркировки EdU/pH3 позволяет анализировать дефекты фаз S и M, невозможно измерить точную продолжительность фаз с помощью этого протокола. Протокол, описанный Перейрой и его коллегами, может быть подходящей альтернативой для анализов, требующих определения длин фаз клеточного цикла. Адаптация этого протокола с дополнительной маркировкой pH3 может также привести к более высокой чувствительности при обнаружении клеток М-фазы.

Помимо подхода EdU/pH3, метод индикатора клеточного цикла f luorescent ubiquitin (FUCCI) также использовался для изучения прогрессирования клеточного цикла в клетках млекопитающих, а также в тканях дрозофилы24,25. Эта система использует два флуоресцентно помеченных белка, geminin и Cdt1, которые содержат мотивы для специфического убиквитинирования и протеазомной деградации APC / C и SCFSkp2соответственно. Поскольку APC/C активен только с конца митоза через G1, а SCFSkp2 активен в фазах S и G2, специфическая для стадии клеточного цикла деградация флуоресцентно меченого геминина и Cdt1 позволяет определить фазу24клеточного цикла. Слегка модифицированный метод «Fly-FUCCI» для тканей дрозофилы опирается, вместо этого, на флуоресцентно помеченные циклин B и E2F1, которые разлагаются APC / C (во время митоза) и CRL4Cdt2 (во время начала S-фазы), соответственно25. Предыдущее исследование, характеризующее преждевременную дифференцировку личинок Drosophila NB в ответ на анеуплоидию, проанализировало дефекты клеточного цикла методами Fly-FUCCI и EdU/pH34. Анеуплоидия вызывает преждевременную дифференцировку NB, и, следовательно, высокая доля NB выходит из клеточного цикла.

Это было точно отражено как в данных Fly-FUCCI, так и в данных EdU/pH34. Таким образом, данные, полученные с помощью метода EdU/pH3, также сопоставимы с другими методами отслеживания клеточного цикла, такими как Fly-FUCCI. Fly-FUCCI является мощным инструментом, и все запасы мух с вездесущими флуоресцентными маркерами или маркерами, слитыми с тканеспецифическими промоутерами, доступны в центрах запасов. Однако использование этих конструкций для анализа дефектов клеточного цикла у нулевых мутантов или с нокдауном siRNA будет включать генетическую рекомбинацию для создания мушки, которая несет элементы FUCCI, тканеспецифические драйверы, конкретную мутацию или интересную siRNA. Этот процесс отсрочит фактический эксперимент на несколько недель, тогда как метод EdU/pH3 может быть легко применен к летающим линиям с генетическим нулевым фоном. В качестве альтернативы, для нокдаунов siRNA для анализа EdU/pH3 может быть использовано одноступенчатое скрещивание между запасом драйвера и запасом siRNA.

Одним из недостатков этого подхода является конвейер визуализации и анализа изображений, который включает в себя ручную количественную оценку большого количества клеток из нескольких образцов мозга. Недавно подход к проточной цитометрии был представлен в качестве высокопроизводительной альтернативы обычному анализу на основе микроскопии для анализа клеточного цикла26. Быстрый анализ тысяч клеток одновременно с этим подходом является преимуществом, а способность обнаруживать несколько маркеров позволяет количественно оценить конкретные типы клеток. Хотя этот протокол легко использовать с культивируемыми клеточными линиями, его может быть трудно применить к большим образцам тканей, таким как мозг личинок дрозофилы. Тем не менее, было опубликовано несколько протоколов, которые описывают диссоциацию мозговой ткани и анализ изолированных личиночных NB методом проточной цитометрии27,28. Дальнейшие инновационные подходы в этом направлении могут предоставить новые возможности для высокопроизводительного анализа клеточного цикла в тканях дрозофилы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансированием Швейцарского национального научного фонда (грант проекта 31003A_173188; www.snf.ch) и Бернского университета (www.unibe.ch) для BS. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) Bloomington stock center #15477 P-element insertion in the third exon of Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19p Generated in house eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background
w1118 Bloomington stock center #3605 wild-type stock (w;+;+)
Primary antibodies Dilution
Rat anti-Miranda Abcam Ab197788 1/250
Rabbit anti-pH3 Cell Signaling 9701 1/200
Secondary antibodies
Goat anti-Rat Cy3 Jackson Immuno 112-165-167 1/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 1/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A27034 1/500
Reagent/Kit
Aqua Poly/Mount mounting medium Polysciences Inc 18606-20
Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 Thermo Fischer Scientific C10340
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fischer Scientific 21720-024
Bovine serum albumin (BSA) fraction V Merck 10735078001
Triton X-100 Fischer Scientific 9002-93-1 non-ionic detergent
Software
Fiji (Imagej) https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X) Leica microsystems
PRISM Graph pad software Version 5
Microsoft Excel Microsoft office 2016
Equipment
Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective
Materials
Aqua Poly/Mount mounting medium water-soluble, non-fluorescing mounting medium
Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate
Whatman filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

Tags

Биология выпуск 171
5-этинил-2'-дезоксиуридин / фосфо-гистон H3 Двойной протокол маркировки для анализа прогрессирования клеточного цикла в нервных стволовых клетках <em>дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chippalkatti, R., Suter, B.… More

Chippalkatti, R., Suter, B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62642, doi:10.3791/62642 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter