Spyttkjertler har blitt foreslått som et vevsmålsted for genterapi, spesielt innen vaksinasjon ved genoverføring. Vi demonstrerer gentilførsel i en ikke-menneskelig primatmodell ved hjelp av retrograd parotidinfusjon.
Spyttkjertler er et attraktivt vevsmål for genterapi med lovende resultater som allerede fører til menneskelige studier. De er iboende i stand til å utskille proteiner i blodet og er lett tilgjengelige, noe som gjør dem potensielt overlegne vevssteder for erstatningshormonproduksjon eller vaksinasjon ved genoverføring. Foreslåtte metoder for genlevering inkluderer transkutan injeksjon og retrograd infusjon gjennom spyttkanaler. Vi demonstrerer hvordan du utfører Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) hos ikke-menneskelige primater. Vi beskriver de viktige anatomiske landemerkene, inkludert identifisering av parotid papilla, en atraumatisk metode for kanylering og tetting av Stensens kanal ved hjelp av grunnleggende tannverktøy, polyetylenrør og cyanoakrylat, og riktig infusjonshastighet. Selv om dette er den minst traumatiske leveringsmåten, er metoden fortsatt begrenset av volumet som kan leveres (<0,5 ml) og potensialet for traumer til kanalen og kjertelen. Vi demonstrerer ved hjelp av fluoroskopi at et infusat kan leveres fullt ut i kjertelen, og videre demonstrere ved immunhiistokjemi transduksjonen av en typisk vektor og uttrykk for det leverte genet.
Mens spyttkjertler er kjent for sin eksokrinproduksjon av spytt, har forskere lenge anerkjent sin evne til å skille ut proteiner direkte i blodet1, noe som gjør dem til et potensielt mål for genterapi for systemisk administrasjon, for eksempel erstatningshormoner eller antistoffproduksjon. Faktisk tilbyr spyttkjertler flere fordeler i forhold til andre vevsmål, for eksempel den iboende evnen til å produsere proteiner for sekresjon (en eiendomsmuskulatur mangler), tung innkapsling som kan begrense vektordiffusjon, og godt differensiert vev som gir stabilitet for ikke-integrerende vektorer. Videre, i tilfelle en alvorlig bivirkning, er spyttkjertler ikke kritiske for livet og kan fjernes kirurgisk. Selv om de ikke umiddelbart er intuitive, er parotidkjertler også lett tilgjengelige fra munnen gjennom hovedutskillelseskanalen, Stensens kanal2.
Gitt fordelene med spyttvev for genterapi, er det økende interesse for å utforske dette vevsmålet. Tallrike studier har allerede blitt utført i gnager-, hunde- og ikke-menneskelige primatmodeller, og minst en menneskelig klinisk studie er i gang3,4,5. For å utforske og utvikle nytten av dette vevsmålet for genterapiformål, må flere ikke-menneskelige primatstudier utføres. Dette dokumentet beskriver en metode for å få tilgang til parotidkjertlene gjennom Stensens kanal for å levere et vektorisert gen for transduksjon i den ikke-menneskelige primatmodellen. For å synlig demonstrere leveransen av infusatet og kanalens anatomi når den kommer inn i kjertelen, ble fluoroskopi ved hjelp av radiokontrast utført. For å demonstrere vellykket transduksjon av en vektor, ble en Adenovirus serotype 5 (Ad5) vektorisert egfp gen brukt. Ad5 er en godt beskrevet vektor som er i stand til å transdusere spyttvev. Selv om det er for immunogent for optimal klinisk bruk, ble en Ad5-vektor valgt for denne demonstrasjonsstudien for å sikre effektiv transduksjon. Evaluering av enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) produksjon er en godt beskrevet metode for å demonstrere vellykket transkripsjon og oversettelse av et vektorisert gen etter transduksjon og ble gjort her.
Her beskriver vi en protokoll for retrograd infusjon i parotidkjertelen gjennom Stensens kanal. Den beskrevne metodikken gir veiledning som potensielt kan brukes av forskere som utforsker nytten av spyttvev som et sted for genterapi og andre anvendelser.
Det er flere kritiske trinn for å sikre at prosedyren lykkes. Først og fremst bør alle prosedyretrinnene fullføres forsiktig. Kraftig avstivning av munnen kan føre til mandibulær subluxasjon. Kraftig kanylering av parotid papilla eller r…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Mr. Cagney Gentry for hans audiovisuelle støtte til å filme prosedyren. Vi ønsker også å anerkjenne Hefner VA medisinske senter for faglig støtte i jakten på dette prosjektet.
500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |