Summary

Retrograd parotidkjertelinfusjon gjennom Stensens kanal i en ikke-menneskelig primat for vektorisert genlevering

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Spyttkjertler har blitt foreslått som et vevsmålsted for genterapi, spesielt innen vaksinasjon ved genoverføring. Vi demonstrerer gentilførsel i en ikke-menneskelig primatmodell ved hjelp av retrograd parotidinfusjon.

Abstract

Spyttkjertler er et attraktivt vevsmål for genterapi med lovende resultater som allerede fører til menneskelige studier. De er iboende i stand til å utskille proteiner i blodet og er lett tilgjengelige, noe som gjør dem potensielt overlegne vevssteder for erstatningshormonproduksjon eller vaksinasjon ved genoverføring. Foreslåtte metoder for genlevering inkluderer transkutan injeksjon og retrograd infusjon gjennom spyttkanaler. Vi demonstrerer hvordan du utfører Retrograde Salivary Gland Infusion (RSGI) hos ikke-menneskelige primater. Vi beskriver de viktige anatomiske landemerkene, inkludert identifisering av parotid papilla, en atraumatisk metode for kanylering og tetting av Stensens kanal ved hjelp av grunnleggende tannverktøy, polyetylenrør og cyanoakrylat, og riktig infusjonshastighet. Selv om dette er den minst traumatiske leveringsmåten, er metoden fortsatt begrenset av volumet som kan leveres (<0,5 ml) og potensialet for traumer til kanalen og kjertelen. Vi demonstrerer ved hjelp av fluoroskopi at et infusat kan leveres fullt ut i kjertelen, og videre demonstrere ved immunhiistokjemi transduksjonen av en typisk vektor og uttrykk for det leverte genet.

Introduction

Mens spyttkjertler er kjent for sin eksokrinproduksjon av spytt, har forskere lenge anerkjent sin evne til å skille ut proteiner direkte i blodet1, noe som gjør dem til et potensielt mål for genterapi for systemisk administrasjon, for eksempel erstatningshormoner eller antistoffproduksjon. Faktisk tilbyr spyttkjertler flere fordeler i forhold til andre vevsmål, for eksempel den iboende evnen til å produsere proteiner for sekresjon (en eiendomsmuskulatur mangler), tung innkapsling som kan begrense vektordiffusjon, og godt differensiert vev som gir stabilitet for ikke-integrerende vektorer. Videre, i tilfelle en alvorlig bivirkning, er spyttkjertler ikke kritiske for livet og kan fjernes kirurgisk. Selv om de ikke umiddelbart er intuitive, er parotidkjertler også lett tilgjengelige fra munnen gjennom hovedutskillelseskanalen, Stensens kanal2.

Gitt fordelene med spyttvev for genterapi, er det økende interesse for å utforske dette vevsmålet. Tallrike studier har allerede blitt utført i gnager-, hunde- og ikke-menneskelige primatmodeller, og minst en menneskelig klinisk studie er i gang3,4,5. For å utforske og utvikle nytten av dette vevsmålet for genterapiformål, må flere ikke-menneskelige primatstudier utføres. Dette dokumentet beskriver en metode for å få tilgang til parotidkjertlene gjennom Stensens kanal for å levere et vektorisert gen for transduksjon i den ikke-menneskelige primatmodellen. For å synlig demonstrere leveransen av infusatet og kanalens anatomi når den kommer inn i kjertelen, ble fluoroskopi ved hjelp av radiokontrast utført. For å demonstrere vellykket transduksjon av en vektor, ble en Adenovirus serotype 5 (Ad5) vektorisert egfp gen brukt. Ad5 er en godt beskrevet vektor som er i stand til å transdusere spyttvev. Selv om det er for immunogent for optimal klinisk bruk, ble en Ad5-vektor valgt for denne demonstrasjonsstudien for å sikre effektiv transduksjon. Evaluering av enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) produksjon er en godt beskrevet metode for å demonstrere vellykket transkripsjon og oversettelse av et vektorisert gen etter transduksjon og ble gjort her.

Protocol

Alle prosedyrene ble utført ved Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus for dyrestudier. Institusjonell dyrepleie- og brukskomité (IACUC) ble konsultert for etiske hensyn og detaljer om prosedyrene ble sendt inn til gjennomgang. Wake Forest IACUC godkjente vår studieprotokoll og alle prosedyrer ble gjort under IACUC-godkjent protokoll #A17-147. 1. Klargjøring av infusjonsenheten Klipp størrelse 10 Polyetylen Tube (PET10) i 25 cm lengder ved hjelp av en saks. Mer…

Representative Results

Vellykket prosedyre, transduksjon og transkripsjonFigur 1 viser parotid papillaen ved siden av denandre molaren på det bakre overlegne kinnet. Bildet viser også riktig plassering av munnstøtten, den ene gummienden på den harde ganen og den andre gummienden på den ipsilaterale hunden. Figur 2 viser et bilde tatt etter vellykket kanylering av parotid papilla ved 2 cm-merket på PET10. Figur 3 viser…

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for retrograd infusjon i parotidkjertelen gjennom Stensens kanal. Den beskrevne metodikken gir veiledning som potensielt kan brukes av forskere som utforsker nytten av spyttvev som et sted for genterapi og andre anvendelser.

Det er flere kritiske trinn for å sikre at prosedyren lykkes. Først og fremst bør alle prosedyretrinnene fullføres forsiktig. Kraftig avstivning av munnen kan føre til mandibulær subluxasjon. Kraftig kanylering av parotid papilla eller r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil takke Mr. Cagney Gentry for hans audiovisuelle støtte til å filme prosedyren. Vi ønsker også å anerkjenne Hefner VA medisinske senter for faglig støtte i jakten på dette prosjektet.

Materials

500 µL U100 syringes with 30-gauge needles Becton Dickinson 328466 fixed needle for less waste
Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) Various Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion.
Atropine injectable solution Patterson Veterinary 07 869-6061 Atropine inj. 0.54 mg/mL
BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G Walmart N/A Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes.
Cyanoacrylate (medical glue) Ethicon DNX12 Dermabond topical skin adhesive
Dental loops with light Amazon (DDP) B012M3IV80 Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla
Infant Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-137
Ketamine injectable solution Patterson Veterinary 07-803-6637 Ketaset inj. 100 mg/mL
Lacrimal Dilator Surgipro SPOI-132 Used to dialate the Stensen's duct.
Midazolam injectable solution Patterson Veterinary 07 890-6698 Midazolam inj. 5mg/mL
Pair of scissors Amazon (DDP) N/A Used to cut PET10 tube
Polyethylene Tubing (PE-10) Scientific Comodities, Inc BB31695-PE/1 Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct.
Q-tips Walmart N/A Used to spread cyanoacrylate on the cheek
Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) Scientific Commodities BB31695-PE/1 low density polyethylene tubing
Small Animal Mouth Opener Amazon (DDP) B01F3LVJXC Used to keep the animal's mouth open.
Tweezers Amazon (DDP) N/A Used to insert PET10 tube into Stenson's duct
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 7646-86-7 Included in plasmid DNA infusates

References

  1. Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
  2. Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
  3. Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
  4. Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
  5. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
  6. Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
  7. Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
  8. Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
  9. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , (2011).
  10. Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).

Play Video

Cite This Article
El Helou, G., Goodman, J. F., Blevins, M., Caudell, D. L., Ponzio, T. A., Sanders, J. W. Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen’s Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery. J. Vis. Exp. (174), e62645, doi:10.3791/62645 (2021).

View Video