Visualisatie van membraanrommelvorming met behulp van Scanning Electron Microscopie
Summary
Macropinocytose is een sterk geconserveerd endocytisch proces geïnitieerd door de vorming van F-actine-rijke plaatachtige membraanprojecties, ook bekend als membraanrulingen. Verhoogde snelheid van macropinocytotische opgeloste stof internalisatie is betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen. Dit protocol presenteert een methode om de vorming van membraanrommels in vitro te kwantificeren met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Abstract
Membraanrommel is de vorming van beweeglijke plasmamembraanuitsteeksels die een maaswerk van nieuw gepolymeriseerde actinefilamenten bevatten. Membraanrusels kunnen zich spontaan vormen of als reactie op groeifactoren, inflammatoire cytokines en phorbolesters. Sommige van de membraanuitsteeksels kunnen reorganiseren in cirkelvormige membraanrukels die aan hun distale randen samensmelten en kopjes vormen die sluiten en scheiden in het cytoplasma als grote, heterogene vacuolen die macropinosomen worden genoemd. Tijdens het proces vangen ruches extracellulaire vloeistof en opgeloste stoffen op die zich internaliseren binnen macropinosomen. Hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een veelgebruikte beeldvormingstechniek om de vorming van membraanrommels, cirkelvormige uitsteeksels en gesloten macropinocytische cups op het celoppervlak te visualiseren en te kwantificeren. Het volgende protocol beschrijft de celkweekomstandigheden, stimulatie van de membraanrommelvorming in vitro en hoe cellen te fixeren, uitdrogen en voorbereiden voor beeldvorming met behulp van SEM. Kwantificering van membraanruling, gegevensnormalisatie en stimulatoren en remmers van membraanrommelvorming worden ook beschreven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van macropinocytose in fysiologische en pathologische processen, het onderzoeken van nieuwe doelen die de vorming van membraanrommel reguleren en het identificeren van nog niet-gekarakteriseerde fysiologische stimulatoren en nieuwe farmacologische remmers van macropinocytose.
Introduction
Macropinocytose is een endocytisch proces dat verantwoordelijk is voor het internaliseren van een grote hoeveelheid extracellulaire vloeistof en de inhoud ervan via de vorming van dynamische en actine-aangedreven plasmamembraanuitsteeksels die membraanruches worden genoemd1. Veel van deze membraanruches vormen cups die sluiten en terugsmelten naar de cel en scheiden van het plasmamembraan als grote, heterogene intracellulaire endosomen, ook bekend als macropinosomen1. Hoewel macropinocytose wordt geïnduceerd door groeifactoren zoals macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en epidermale groeifactor (EGF) in een breed scala van celtypen, is een extra uniek, calciumafhankelijk proces dat bekend staat als constitutieve macropinocytose ook waargenomen in aangeboren immuuncellen 2,3,4,5,6,7,8.
Het is aangetoond dat het vermogen van cellen om extracellulair materiaal te internaliseren via macropinocytose een belangrijke rol speelt in een verscheidenheid aan fysiologische processen, variërend van opname van voedingsstoffen tot het vangen van pathogenen en de presentatie van antigeen 9,10,11. Omdat dit proces echter niet-selectief en induceerbaar is, is het ook betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen. Inderdaad, eerdere studies suggereerden dat macropinocytose een belangrijke rol speelt bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, kanker, nefrolithiasis en atherosclerose 12,13,14,15,16. Bovendien hebben bepaalde bacteriën en virussen aangetoond macropinocytose te gebruiken om toegang te krijgen tot gastheercellen en infectie te induceren17,18. Interessant is dat stimulatie van macropinocytose ook kan worden gebruikt voor gerichte toediening van therapeutische middelen in verschillende ziekteomstandigheden 19,20.
Eerdere studies hebben macropinocytose onderzocht door geïnternaliseerde fluorescerend gelabelde vloeistoffasemarkers te kwantificeren in afwezigheid en aanwezigheid van farmacologische middelen die macropinocytose remmen met behulp van flowcytometrie en confocale beeldvorming21,22. Momenteel beschikbare farmacologische hulpmiddelen die macropinocytose remmen, zijn beperkt tot en bestaan uit 1) actinepolymerisatieremmers (cytochalasine D en latrunculinen), 2) PI3K-blokkers (LY-290042 en wortmannine) en 3) remmers van natriumwaterstofwisselaars (NHE) (amiloride en EIPA)5,14,15,23,24,25 . Omdat deze remmers echter endocytose-onafhankelijke effecten hebben, is het moeilijk om selectief de bijdrage van macropinocytose aan de opname van opgeloste stoffen en de pathogenese van ziekten te bepalen, vooral in vivo21.
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een type elektronenmicroscoop dat beelden met ultrahoge resolutie van cellen produceert met behulp van een gerichte bundel elektronen26. In macropinocytose-onderzoek wordt SEM-beeldvorming beschouwd als de gouden standaardtechniek om topografische en morfologische kenmerken van het plasmamembraan te visualiseren, membraanrommelvorming te kwantificeren en hun progressie naar macropinosoominternalisatie te onderzoeken. Bovendien biedt scanning elektronenmicroscopie in combinatie met de kwantificering van de opname van opgeloste stoffen, in de aan- en afwezigheid van macropinocytoseblokkers, een betrouwbare strategie om de internalisatie van macropinocytotische opgeloste stoffen in vitro te onderzoeken. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol over hoe cellen voor te bereiden op SEM, het celoppervlak te visualiseren, ruchesvorming te kwantificeren en hun voortgang naar bekersluiting en macropinosoominternalisatie te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. Hoewel het huidige protocol zich richt op macrofagen, hebben studies aangetoond dat membraanrommelvorming ook voorkomt op verschillende andere celtypen, waaronder dendritische cellen, fibroblasten, neuronen en kankercellen 11,12,14,21,30.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Libby Perry (Augusta University) voor haar hulp bij de SEM-monstervoorbereiding. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) en K99HL146954 (B.S.)] en American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
