Visualizzazione della formazione di increspature a membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione
Summary
La macropinocitosi è un processo endocitico altamente conservato avviato dalla formazione di proiezioni di membrana simili a fogli ricchi di F-actina, noti anche come volant di membrana. L’aumento del tasso di internalizzazione del soluto macropinocitotico è stato implicato in varie condizioni patologiche. Questo protocollo presenta un metodo per quantificare la formazione di volant di membrana in vitro utilizzando la microscopia elettronica a scansione.
Abstract
L’arruffamento della membrana è la formazione di sporgenze di membrana plasmatica mobile contenenti una rete di filamenti di actina appena polimerizzati. Le volant di membrana possono formarsi spontaneamente o in risposta a fattori di crescita, citochine infiammatorie e esteri di forbolo. Alcune delle sporgenze di membrana possono riorganizzarsi in volant circolari di membrana che si fondono ai loro margini distali e formano tazze che si chiudono e si separano nel citoplasma come vacuoli grandi ed eterogenei chiamati macropinosomi. Durante il processo, i volant intrappolano il fluido extracellulare e i soluti che si interiorizzano all’interno dei macropinosomi. La microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione (SEM) è una tecnica di imaging comunemente usata per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche chiuse sulla superficie cellulare. Il seguente protocollo descrive le condizioni di coltura cellulare, la stimolazione della formazione di volant di membrana in vitro e come correggere, disidratare e preparare le cellule per l’imaging utilizzando SEM. Sono inoltre descritti la quantificazione dell’increspamento della membrana, la normalizzazione dei dati e gli stimolatori e gli inibitori della formazione di volant di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della macropinocitosi nei processi fisiologici e patologici, studiare nuovi bersagli che regolano la formazione di increspature di membrana e identificare stimolatori fisiologici ancora non caratterizzati e nuovi inibitori farmacologici della macropinocitosi.
Introduction
La macropinocitosi è un processo endocitico responsabile dell’internalizzazione di una grande quantità di fluido extracellulare e del suo contenuto attraverso la formazione di sporgenze dinamiche e guidate dall’actina della membrana plasmatica chiamate increspature di membrana1. Molti di questi volant di membrana formano coppe che si chiudono e si fondono di nuovo sulla cellula e si separano dalla membrana plasmatica come grandi ed eterogenei endosomi intracellulari noti anche come macropinosomi1. Sebbene la macropinocitosi sia indotta da fattori di crescita come il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e il fattore di crescita epidermico (EGF) in una vasta gamma di tipi di cellule, un ulteriore processo unico e dipendente dal calcio noto come macropinocitosi costitutiva è stato osservato anche nelle cellule immunitarie innate 2,3,4,5,6,7,8.
La capacità delle cellule di internalizzare il materiale extracellulare attraverso la macropinocitosi ha dimostrato di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi fisiologici che vanno dall’assorbimento dei nutrienti alla cattura dei patogeni e alla presentazione dell’antigene 9,10,11. Tuttavia, poiché questo processo non è selettivo e inducibile, è stato anche implicato in una serie di condizioni patologiche. Infatti, studi precedenti hanno suggerito che la macropinocitosi svolge un ruolo importante nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson, nel cancro, nella nefrolitiasi e nell’aterosclerosi 12,13,14,15,16. Inoltre, alcuni batteri e virus hanno dimostrato di utilizzare la macropinocitosi per entrare nelle cellule ospiti e indurre l’infezione17,18. È interessante notare che la stimolazione della macropinocitosi può anche essere sfruttata per la somministrazione mirata di agenti terapeutici in varie condizioni di malattia19,20.
Studi precedenti hanno esplorato la macropinocitosi quantificando marcatori in fase fluida internati con tag fluorescenti in assenza e presenza di agenti farmacologici che inibiscono la macropinocitosi utilizzando la citometria a flusso e l’imaging confocale21,22. Gli strumenti farmacologici attualmente disponibili che inibiscono la macropinocitosi sono limitati e comprendono 1) inibitori della polimerizzazione dell’actina (citocalasina D e latrunculine), 2) bloccanti PI3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibitori degli scambiatori di idrogeno di sodio (NHE) (amiloride ed EIPA)5,14,15,23,24,25 . Tuttavia, poiché questi inibitori hanno effetti indipendenti dall’endocitosi, è difficile determinare selettivamente il contributo della macropinocitosi all’assorbimento del soluto e alla patogenesi della malattia, specialmente in vivo21.
La microscopia elettronica a scansione (SEM) è un tipo di microscopio elettronico che produce immagini ad altissima risoluzione di cellule utilizzando un fascio focalizzato di elettroni26. Nella ricerca sulla macropinocitosi, l’imaging SEM è considerato la tecnica gold standard per visualizzare le caratteristiche topografiche e morfologiche della membrana plasmatica, quantificare la formazione di volant di membrana e studiare la loro progressione verso l’internalizzazione dei macropinosomi. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione combinata con la quantificazione dell’assorbimento del soluto, in presenza e assenza di bloccanti della macropinocitosi, fornisce una strategia affidabile per esaminare l’internalizzazione del soluto macropinocitotico in vitro. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato su come preparare le cellule per il SEM, visualizzare la superficie cellulare, quantificare la formazione di volant ed esaminare i loro progressi verso la chiusura della coppa e l’internalizzazione dei macropinosomi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. Sebbene l’attuale protocollo si concentri sui macrofagi, gli studi hanno dimostrato che la formazione di volant di membrana si verifica anche su vari altri tipi di cellule tra cui cellule dendritiche, fibroblasti, neuroni e cellule tumorali 11,12,14,21,30.<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Libby Perry (Augusta University) per il suo aiuto nella preparazione del campione SEM. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) e K99HL146954 (BS)] e dall’American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
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