走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化
Summary
マクロピノサイトーシスは、膜フリルとしても知られるF-アクチンに富むシート状の膜突起の形成によって開始される高度に保存された内球性プロセスである。マクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションの速度の増加は、様々な病理学的状態に関与している。このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いて インビトロで 膜ラッフル形成を定量する方法を提示する。
Abstract
メンブレンフリルは、新しく重合されたアクチンフィラメントのメッシュワークを含む運動性原形質膜凸部の形成である。膜フリルは、自発的に、または成長因子、炎症性サイトカイン、およびホルボールエステルに応答して形成され得る。膜突起の一部は、遠位縁で融合し、マクロピノソームと呼ばれる大きくて不均一な液胞として細胞質に閉じて分離するカップを形成する円形の膜フリルに再編成することができる。このプロセスの間、フリルはマクロピノソーム内に内在化する細胞外液および溶質を捕捉する。高分解能走査型電子顕微鏡(SEM)は、細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および閉じた大尖頭カップを視覚化および定量化するために一般的に使用されるイメージング技術です。以下のプロトコールは、細胞培養条件、 インビトロでの 膜ラッフル形成の刺激、およびSEMを用いたイメージングのための細胞の固定、脱水、および調製方法を記載する。この方法は、生理学的および病理学的プロセスにおけるマクロピノサイトーシスの役割に関する重要な質問に答え、膜フリル形成を調節する新しい標的を調査し、まだ特徴付けられていない生理学的刺激因子およびマクロピノサイトーシスの新規薬理学的阻害剤を同定するのに役立つ。
Introduction
マクロピノサイトーシスは、メンブレンフリル1と呼ばれる動的でアクチン駆動の原形質膜突起の形成を介して、大量の細胞外液およびその内容物を内在化する内分泌過程である。これらの膜フリルの多くは、細胞を閉じて融合させ、マクロピノソーム1としても知られる大きくて不均一な細胞内エンドソームとして原形質膜から分離するカップを形成する。マクロピノサイトーシスは、広範囲の細胞型においてマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および上皮成長因子(EGF)などの成長因子によって誘導されるが、構成的マクロピノサイトーシスとして知られるさらなる独特のカルシウム依存性プロセスは、自然免疫細胞2、3、4、5、6、7、8においても観察されている。
マクロピノサイトーシスを介して細胞外物質をインターナライズする細胞の能力は、栄養素の取り込みから病原体の捕捉および抗原提示に至るまでの様々な生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている9、10、11。しかしながら、このプロセスは非選択的かつ誘導性であるため、多くの病理学的状態にも関与している。実際、以前の研究では、マクロピノサイトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、癌、腎結石症およびアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことが示唆された12,13,14,15,16。さらに、特定の細菌およびウイルスは、マクロピノサイトーシスを利用して宿主細胞に侵入し、感染を誘導することが示されている17,18。興味深いことに、マクロピノサイトーシスの刺激は、様々な疾患状態における治療剤の標的送達のためにも利用され得る19、20。
これまでの研究では、フローサイトメトリーおよび共焦点イメージング21,22を用いて、マクロピノサイトーシスを阻害する薬理学的薬剤の非存在下および存在下で、内在化された蛍光タグ付き液相マーカーを定量化することによってマクロピノサイトーシスを探索してきた21,22。マクロピノサイトーシスを阻害する現在利用可能な薬理学的ツールは、1)アクチン重合阻害剤(サイトカラシンDおよびラトルンクリン)、2)PI3K遮断薬(LY-290042およびワートマニン)、および3)ナトリウム水素交換剤(NHE)の阻害剤(アミロリドおよびEIPA)に限定され、5、14、15、23、24、25.しかしながら、これらの阻害剤はエンドサイトーシスに依存しない効果を有するため、特にインビボでの溶質取り込みおよび疾患病因に対するマクロピノサイトーシスの寄与を選択的に決定することは困難である21。
走査型電子顕微鏡(SEM)は、電子26の集束ビームを用いて細胞の超高分解能画像を生成する電子顕微鏡の一種である。マクロピノサイトーシス研究において、SEMイメージングは、原形質膜の地形学的および形態学的特徴を視覚化し、膜フリル形成を定量化し、マクロピノソーム内在化への進行を調べるためのゴールドスタンダード技術と見なされています。さらに、溶質取り込みの定量化と組み合わせた走査型電子顕微鏡は、マクロピノサイトーシス遮断薬の存在下および非存在下で、イン ビトロでマクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションを調べるための信頼できる戦略を提供する。この論文は、SEM用の細胞を調製し、細胞表面を視覚化し、フリル形成を定量化し、カップ閉鎖およびマクロピノソーム内在化へのそれらの進歩を調べる方法に関する詳細なプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。現在のプロトコールはマクロファージに焦点を当てているが、研究は、膜フリル形成が樹状細胞、線維芽細胞、ニューロン、および癌細胞を含む様々な他の細胞型においても起こることを示している11、12<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、SEMサンプル調製に協力してくれたLibby Perry(オーガスタ大学)に感謝している。この研究は、国立衛生研究所[R01HL139562(G.C.)およびK99HL146954(BS)]および米国心臓協会[17POST33661254(B.S.)]によって支援されました。
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
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