Summary

Visualisere membran ruffle formasjon ved hjelp av skanning elektron mikroskopi

Published: May 27, 2021
doi:

Summary

Makropinocytose er en svært konservert endokytisk prosess initiert av dannelsen av F-aktinrike arklignende membranprojeksjoner, også kjent som membran ruffles. Økt grad av makropinocytotisk solute internalisering har vært involvert i ulike patologiske forhold. Denne protokollen presenterer en metode for å kvantifisere membran ruffle formasjon in vitro ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.

Abstract

Membran ruffling er dannelsen av motile plasmamembran fremspring som inneholder et nettingverk av nylig polymeriserte aktinfilamenter. Membran ruffles kan dannes spontant eller som svar på vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbol estere. Noen av membranutstikkene kan omorganisere seg til sirkulære membran ruffles som smelter sammen ved deres distale marginer og danner kopper som lukker og skiller seg inn i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kalt makropinosomer. Under prosessen fanger ruffles ekstracellulær væske og løsemidler som internaliserer i makropinosomer. Høyoppløselig skanning elektronmikroskopi (SEM) er en vanlig brukt bildeteknikk for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverflaten. Følgende protokoll beskriver cellekulturforholdene, stimulering av membranen ruffle formasjon in vitro, og hvordan å fikse, dehydrere og forberede celler for avbildning ved hjelp av SEM. Kvantifisering av membran ruffling, data normalisering, og stimulatorer og hemmere av membran ruffle formasjon er også beskrevet. Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål om makropinocytoserollen i fysiologiske og patologiske prosesser, undersøke nye mål som regulerer membran ruffle dannelse, og identifisere ennå ukarakteriserte fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hemmere av makropinocytose.

Introduction

Makropinocytose er en endokytisk prosess som er ansvarlig for å internalisere en stor mengde ekstracellulær væske og dets innhold via dannelsen av dynamiske og aktindrevne plasmamembranutstikk som kalles membran ruffles1. Mange av disse membran ruffles danner kopper som lukker og smelter tilbake på cellen og skiller seg fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer også kjent som makropinosomer1. Selv om makropinocytose er indusert av vekstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vekstfaktor (EGF) i et bredt spekter av celletyper, har en ekstra unik, kalsiumavhengig prosess kjent som konstituerende makropinocytose også blitt observert i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.

Cellenes evne til å internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske prosesser som spenner fra næringsopptak til patogenfangst og antigenpresentasjon 9,10,11. Men fordi denne prosessen er ikke-selektiv og inducible, har den også blitt involvert i en rekke patologiske forhold. Faktisk antydet tidligere studier at makropinocytose spiller en viktig rolle i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kreft, nephrolithiasis og aterosklerose 12,13,14,15,16. Videre har visse bakterier og virus vist seg å bruke makropinocytose for å få inngang i vertsceller og indusere infeksjon17,18. Interessant nok kan stimulering av makropinocytose også utnyttes for målrettet levering av terapeutiske midler under ulike sykdomstilstander19,20.

Tidligere studier har utforsket makropinocytose ved å kvantifisere internaliserte fluorescerende taggede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse av farmakologiske midler som hemmer makropinocytose ved hjelp av strømningscytometri og konfomisk avbildning21,22. Tilgjengelige farmakologiske verktøy som hemmer makropinocytose er begrenset til og består av 1) aktinpolymerisasjonshemmere (cytochalasin D og latrunculins), 2) PI3K-blokkere (LY-290 042 og wortmannin) og 3) hemmere av natrium hydrogenvekslere (NHE) (amilorid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse inhibitorene har endokytoseuavhengige effekter, er det vanskelig å selektivt bestemme bidraget av makropinocytose til løsning av opptak og sykdomspatogenese spesielt in vivo21.

Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop som produserer bilder med ultrahøy oppløsning av celler ved hjelp av en fokusert stråle av elektroner26. I makropinocytoseforskning anses SEM-avbildning som gullstandardteknikken for å visualisere topografiske og morfologiske egenskaper ved plasmamembranen, kvantifisere membran ruffle formasjon og undersøke deres progresjon mot makropinosom internalisering. Videre gir skanning av elektronmikroskopi kombinert med kvantifisering av løsningsmiddelopptak, i nærvær og fravær av makropinocytoseblokkere, en pålitelig strategi for å undersøke makropinocytotisk solute internalisering in vitro. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll om hvordan du forbereder celler for SEM, visualiserer celleoverflaten, kvantifiserer ruffleformasjon og undersøker deres fremgang mot kopplukking og makropinosom internalisering.

Protocol

MERK: Følgende er en generell protokoll som brukes til å kvantifisere membran ruffle formasjon i RAW 264.7 makrofager ved hjelp av SEM mikroskopi. Optimalisering kan være nødvendig for forskjellige celletyper. 1. Cellelinje og cellekultur Vokse RAW 264.7 makrofager i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% (vol /vol) varme-inaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 100 IE /ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %CO2. B…

Representative Results

Her beskriver vi resultatene fra den presenterte teknikken. Representative SEM-bilder vist i figur 1 viser membran ruffle dannelse i RAW 264.7 makrofager etter behandling med PMA og M-CSF. Bilder ble først tatt med en forstørrelse på 3500x for kvantifiseringsformål og deretter ved høyere forstørrelsesnivåer (8500x til 16 000x) for å vise plasmamembranen med større detaljer. Forbehandling av makrofager med makropinocytosehemmeren EIPA svekket membran ruffle formasjon (<strong class="…

Discussion

Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på makrofager, har studier vist at membran ruffle formasjon også forekommer på ulike andre celletyper, inkludert dendritiske celler, fibroblaster, nevroner og kreftceller 11,12,14,21,30.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hennes hjelp med SEM-prøveforberedelsene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (B.S.)] og American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
2% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
4% Paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology 281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride Sigma Life Science A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs Electron Microscopy Sciences 77825-09
Dimethyl Sulfoxide Corning 25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cytiva Life Sciences SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Falcon 353047
Fetal Bovine Serum Gemini Bio 900-108
FitC-dextran Thermo Fisher Scientific D1823
FM 4-64 Thermo Fisher Scientific T13320
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater Anatech USA 58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass Thermo Fisher Scientific 12-545-82
Pen Strep Gibco 15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate Millipore Sigma 524400
RAW 264.7 macrophage ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF Peprotech 300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer Tousimis Research Corporation 8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts Electron Microscopy Sciences 75220
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Texas red-dextra Thermo Fisher Scientific D1864
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope

References

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ahn, W., Singla, B., Marshall, B., Csányi, G. Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e62658, doi:10.3791/62658 (2021).

View Video