Makropinocytose er en svært konservert endokytisk prosess initiert av dannelsen av F-aktinrike arklignende membranprojeksjoner, også kjent som membran ruffles. Økt grad av makropinocytotisk solute internalisering har vært involvert i ulike patologiske forhold. Denne protokollen presenterer en metode for å kvantifisere membran ruffle formasjon in vitro ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.
Membran ruffling er dannelsen av motile plasmamembran fremspring som inneholder et nettingverk av nylig polymeriserte aktinfilamenter. Membran ruffles kan dannes spontant eller som svar på vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbol estere. Noen av membranutstikkene kan omorganisere seg til sirkulære membran ruffles som smelter sammen ved deres distale marginer og danner kopper som lukker og skiller seg inn i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kalt makropinosomer. Under prosessen fanger ruffles ekstracellulær væske og løsemidler som internaliserer i makropinosomer. Høyoppløselig skanning elektronmikroskopi (SEM) er en vanlig brukt bildeteknikk for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverflaten. Følgende protokoll beskriver cellekulturforholdene, stimulering av membranen ruffle formasjon in vitro, og hvordan å fikse, dehydrere og forberede celler for avbildning ved hjelp av SEM. Kvantifisering av membran ruffling, data normalisering, og stimulatorer og hemmere av membran ruffle formasjon er også beskrevet. Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål om makropinocytoserollen i fysiologiske og patologiske prosesser, undersøke nye mål som regulerer membran ruffle dannelse, og identifisere ennå ukarakteriserte fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hemmere av makropinocytose.
Makropinocytose er en endokytisk prosess som er ansvarlig for å internalisere en stor mengde ekstracellulær væske og dets innhold via dannelsen av dynamiske og aktindrevne plasmamembranutstikk som kalles membran ruffles1. Mange av disse membran ruffles danner kopper som lukker og smelter tilbake på cellen og skiller seg fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer også kjent som makropinosomer1. Selv om makropinocytose er indusert av vekstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vekstfaktor (EGF) i et bredt spekter av celletyper, har en ekstra unik, kalsiumavhengig prosess kjent som konstituerende makropinocytose også blitt observert i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellenes evne til å internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske prosesser som spenner fra næringsopptak til patogenfangst og antigenpresentasjon 9,10,11. Men fordi denne prosessen er ikke-selektiv og inducible, har den også blitt involvert i en rekke patologiske forhold. Faktisk antydet tidligere studier at makropinocytose spiller en viktig rolle i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kreft, nephrolithiasis og aterosklerose 12,13,14,15,16. Videre har visse bakterier og virus vist seg å bruke makropinocytose for å få inngang i vertsceller og indusere infeksjon17,18. Interessant nok kan stimulering av makropinocytose også utnyttes for målrettet levering av terapeutiske midler under ulike sykdomstilstander19,20.
Tidligere studier har utforsket makropinocytose ved å kvantifisere internaliserte fluorescerende taggede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse av farmakologiske midler som hemmer makropinocytose ved hjelp av strømningscytometri og konfomisk avbildning21,22. Tilgjengelige farmakologiske verktøy som hemmer makropinocytose er begrenset til og består av 1) aktinpolymerisasjonshemmere (cytochalasin D og latrunculins), 2) PI3K-blokkere (LY-290 042 og wortmannin) og 3) hemmere av natrium hydrogenvekslere (NHE) (amilorid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse inhibitorene har endokytoseuavhengige effekter, er det vanskelig å selektivt bestemme bidraget av makropinocytose til løsning av opptak og sykdomspatogenese spesielt in vivo21.
Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop som produserer bilder med ultrahøy oppløsning av celler ved hjelp av en fokusert stråle av elektroner26. I makropinocytoseforskning anses SEM-avbildning som gullstandardteknikken for å visualisere topografiske og morfologiske egenskaper ved plasmamembranen, kvantifisere membran ruffle formasjon og undersøke deres progresjon mot makropinosom internalisering. Videre gir skanning av elektronmikroskopi kombinert med kvantifisering av løsningsmiddelopptak, i nærvær og fravær av makropinocytoseblokkere, en pålitelig strategi for å undersøke makropinocytotisk solute internalisering in vitro. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll om hvordan du forbereder celler for SEM, visualiserer celleoverflaten, kvantifiserer ruffleformasjon og undersøker deres fremgang mot kopplukking og makropinosom internalisering.
Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på makrofager, har studier vist at membran ruffle formasjon også forekommer på ulike andre celletyper, inkludert dendritiske celler, fibroblaster, nevroner og kreftceller 11,12,14,21,30.…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hennes hjelp med SEM-prøveforberedelsene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (B.S.)] og American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
Accuri C6 Flow Cytometer | |||
Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Zeiss LSM 780 confocal microscope |