Summary

Визуализация образования мембранных оборок с помощью сканирующей электронной микроскопии

Published: May 27, 2021
doi:

Summary

Макропиноцитоз представляет собой высококонсервативный эндоцитарный процесс, инициируемый образованием F-актин-богатых листообразных мембранных проекций, также известных как мембранные оборки. Повышенная скорость макропиноцитотической интернализации растворенного вещества была вовлечена в различные патологические состояния. Этот протокол представляет собой метод количественной оценки образования мембранных оборок in vitro с использованием сканирующей электронной микроскопии.

Abstract

Взъерошение мембраны представляет собой образование подвижных выступов плазматической мембраны, содержащих сетку из вновь полимеризованных актиновых нитей. Оборки мембран могут образовываться спонтанно или в ответ на факторы роста, воспалительные цитокины и сложные эфиры форбола. Некоторые из протрузий мембраны могут реорганизоваться в круглые оборки мембраны, которые сливаются на своих дистальных краях и образуют чашечки, которые закрываются и отделяются в цитоплазму в виде больших, гетерогенных вакуолей, называемых макропиносомами. Во время процесса оборки захватывают внеклеточную жидкость и растворенные вещества, которые интернализируются в макропиносомах. Сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением (SEM) является широко используемым методом визуализации для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборков, круговых выступов и закрытых макропиноцитарных чашек на поверхности клетки. Следующий протокол описывает условия клеточной культуры, стимуляцию образования мембранных рюшей in vitro, а также способы фиксации, обезвоживания и подготовки клеток к визуализации с использованием SEM. Также описана количественная оценка взъерошивания мембраны, нормализация данных, а также стимуляторы и ингибиторы образования мембранных рюшей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли макропиноцитоза в физиологических и патологических процессах, исследовать новые мишени, регулирующие образование мембранных оборок, и выявить еще не охарактеризованные физиологические стимуляторы, а также новые фармакологические ингибиторы макропиноцитоза.

Introduction

Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками1. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы1. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный фактор роста (EGF) в широком диапазоне типов клеток, дополнительный уникальный, кальций-зависимый процесс, известный как конститутивный макропиноцитоз, также наблюдался во врожденных иммунных клетках 2,3,4,5,6,7,8.

Было показано, что способность клеток интернализировать внеклеточный материал посредством макропиноцитоза играет важную роль в различных физиологических процессах, начиная от поглощения питательных веществ до захвата патогенов и представления антигена 9,10,11. Однако, поскольку этот процесс является неселективным и индуцируемым, он также был вовлечен в ряд патологических состояний. Действительно, предыдущие исследования показали, что макропиноцитоз играет важную роль в болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, раке, нефролитиазе и атеросклерозе 12,13,14,15,16. Кроме того, было показано, что некоторые бактерии и вирусы используют макропиноцитоз, чтобы проникнуть в клетки-хозяева и вызвать инфекцию17,18. Интересно, что стимуляция макропиноцитоза может быть также использована для адресной доставки терапевтических средств при различных заболеваниях19,20.

Предыдущие исследования изучали макропиноцитоз путем количественной оценки интернализованных флуоресцентно помеченных маркеров жидкой фазы в отсутствие и присутствие фармакологических агентов, которые ингибируют макропиноцитоз с использованием проточной цитометрии и конфокальной визуализации21,22. Доступные в настоящее время фармакологические средства, ингибирующие макропиноцитоз, ограничены и включают в себя 1) ингибиторы полимеризации актина (цитохалазин D и латрункулины), 2) блокаторы PI3K (LY-290042 и wortmannin) и 3) ингибиторы теплообменников натрия водорода (NHE) (амилорид и EIPA)5,14,15,23,24,25 . Однако, поскольку эти ингибиторы обладают независимыми от эндоцитоза эффектами, трудно выборочно определить вклад макропиноцитоза в поглощение растворенного вещества и патогенез заболевания, особенно in vivo21.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) – это тип электронного микроскопа, который производит изображения клеток со сверхвысоким разрешением с использованием сфокусированного пучка электронов26. В исследованиях макропиноцитоза визуализация SEM рассматривается как метод золотого стандарта для визуализации топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны, количественной оценки образования мембранных оборок и исследования их прогрессирования в направлении интернализации макропиносом. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия в сочетании с количественной оценкой поглощения растворенного вещества в присутствии и отсутствии блокаторов макропиноцитоза обеспечивает надежную стратегию для изучения интернализации макропиноцитотического растворенного вещества in vitro. В этой статье представлен подробный протокол о том, как подготовить клетки к SEM, визуализировать поверхность клеток, количественно оценить образование рюшей и изучить их прогресс в направлении закрытия чашки и интернализации макропиносом.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток. 1. Клеточная линия и клеточная культура …

Representative Results

Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количеств…

Discussion

Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. Хотя текущий протокол фокусируется на макрофагах, исследования показали,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Либби Перри (Университет Августы) за помощь в подготовке проб SEM. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01HL139562 (G.C.) и K99HL146954 (B.S.)] и Американской кардиологической ассоциацией [17POST33661254 (B.S.)].

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
2% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
4% Paraformaldehyde Santa Cruz Biotechnology 281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride Sigma Life Science A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs Electron Microscopy Sciences 77825-09
Dimethyl Sulfoxide Corning 25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium Cytiva Life Sciences SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Falcon 353047
Fetal Bovine Serum Gemini Bio 900-108
FitC-dextran Thermo Fisher Scientific D1823
FM 4-64 Thermo Fisher Scientific T13320
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater Anatech USA 58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass Thermo Fisher Scientific 12-545-82
Pen Strep Gibco 15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate Millipore Sigma 524400
RAW 264.7 macrophage ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF Peprotech 300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer Tousimis Research Corporation 8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts Electron Microscopy Sciences 75220
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Texas red-dextra Thermo Fisher Scientific D1864
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope

References

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ahn, W., Singla, B., Marshall, B., Csányi, G. Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e62658, doi:10.3791/62658 (2021).

View Video