Apoptose kan karakteriseres ved flowcytometrisk analyse af tidlige og sene apoptotiske biomarkører. Cellelinjen for livmoderhalskræft, SiHa, blev analyseret for apoptosebiomarkører efter behandling med Actinomycin D ved hjælp af et benchtop flowcytometer.
Apoptose biomarkører blev undersøgt i actinomycin D-behandlede SiHa livmoderhalskræftceller ved hjælp af et benchtop flow cytometer. Tidlige biomarkører (Annexin V og mitokondriemembranpotentiale) og sene biomarkører (caspase 3 og 7 og DNA-skader) af apoptose blev målt i eksperimentelle og kontrolkulturer. Kulturer blev inkuberet i 24 timer i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2. Cellerne blev derefter løsrevet ved hjælp af trypsin og opregnet ved hjælp af et flowcytometrisk celletællingsassay. Celler blev yderligere analyseret for apoptose ved anvendelse af et Annexin V-assay, et mitokondrielt elektrokemisk transmembranpotentialeassay, et caspase 3/7-assay og et DNA-skadeassay. Denne artikel giver et overblik over apoptose og traditionel flowcytometri og uddyber flowcytometriske protokoller til behandling og analyse af SiHa-celler. Resultaterne beskriver positive, negative og suboptimale eksperimentelle data. Også diskuteret er fortolkning og forbehold ved udførelse af flowcytometrisk analyse af apoptose ved hjælp af denne analytiske platform. Flowcytometrisk analyse giver en nøjagtig måling af tidlige og sene biomarkører for apoptose.
Apoptose, klassificeret som type 1 programmeret celledød1, sikrer en ligevægt mellem celleproliferation og celledød2. Apoptose er afgørende under menneskelig udvikling, efter skade og til forebyggelse af sygdomme som kræft3. Indre og ydre apoptotiske celledødssignalveje4 forårsager sekventielle biokemiske og morfologiske intracellulære ændringer 2,5,6. Morfologiske apoptotiske egenskaber kan identificeres ved mikroskopi, og den biokemiske forstyrrelse kan analyseres ved biokemiske assays, herunder flowcytometri (FC)7.
Flowcytometrisk analyse for at identificere apoptose og forstå de tilknyttede intracellulære mekanismer er vokset i løbet af de sidste to årtier8. FC er en videnskabelig metode, der analyserer celler i en væske, der passerer gennem enkelt- eller flerkanalslasere (figur 1) 9,10,11. Cellerne i væsken fokuseres i en enkelt fil af flowcytometerets fluidiksystem ved hjælp af hydrodynamisk fokusering. Når celler passerer gennem laseren, spredes eller udsendes lys fra cellerne. Det spredte lys kan være i fremadgående retning (fremadrettet spredning) eller mod siden (sidespredning) og giver information om henholdsvis cellestørrelse og cellegranularitet eller interne strukturer.
Derudover detekterer fluorescerende reagenser, såsom fluorescerende farvestoffer eller antistoffer mærket med fluoroforer, specifikke overflade- eller intracellulære strukturer eller molekyler. Når laseren ophidser fluoroforerne, udsendes lys ved en bestemt bølgelængde. Detektorer – almindeligvis fotomultiplikatorrør – kvantificerer det spredte og udsendte lys fra celleprøver. Detektorerne producerer en kvantificerbar strøm, der er proportional med lysspredningen og fluorescensemissionen. Det elektroniske output konverteres til digitale signaler ved hjælp af computersoftware til at identificere cellepopulationer baseret på cellestørrelse, cellegranularitet og den relative cellefluorescens af fluoroformærkede molekyler 9,12,13.
Figur 1: Skematisk beskrivelse af den tekniske drift og arbejdsgang for traditionel flowcytometri. Celler farves med fluorescerende reagenser og undersøges af en laser. De genererede fluorescenssignaler detekteres og konverteres til en elektronisk udgang, som yderligere digitaliseres og analyseres af computersoftware og statistiske programmer. Forkortelser: FSC = fremadrettet spredning; SSC = sidespredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
FC bruges i både forskning og sundhedsdiagnostik. De to mål for FC i nekrobiologi er belysning af molekylære og funktionelle egenskaber ved celledød og diskrimination af forskellige former for celledød 14,15,16,17,18. FC-applikationer inkluderer celletælling, sortering af cellepopulationer, immunofænotypning, biomarkørdetektion (f.eks. Apoptosebiomarkører), toksicitetsundersøgelser og proteinteknik12. Derudover anvendes FC almindeligvis til sundhedsdiagnostik for at hjælpe med diagnosticering og overvågning af patienter med hæmatologiske maligniteter. Fremskridt inden for instrumentering, fluoroforetektion og detektorsystemer udvider FC-applikationer til at omfatte billeddannelsescytometri, massecytometri og spektral cytometri med bredere forskningsapplikationer12.
Den flowcytometriske analyse af apoptose giver fordele i forhold til traditionelle teknikker, der anvendes til vurdering af cellesundhed. FC kan analysere mange enkeltceller i en heterogen prøve hurtigt og reproducerbart for at estimere apoptose 3,5. FC’s evne til at give kvantitativ information om cellefænotyper på individuel cellebasis og undgå bulkanalyse giver overlegen følsomhed over for Western blotting, enzymbundne immunosorbentassays (ELISA’er), fluorometri og spektrofotometriteknikker, der anvendes til analyse af apoptose 8,19. Desuden er den relative lethed ved FC-analyse i modsætning til de besværlige og dårligt reproducerbare manuelle trin i Western blots og ELISA’er fordelagtig. Den reproducerbare, nøjagtige og high-throughput analyse af FC er derfor gavnlig i kræftforskning20.
FC tillader også samtidig analyse af cellecyklusparametre for sunde og unormale apoptotiske cellepopulationer21. Da apoptose er en dynamisk proces, kan forskellige metoder producere variable resultater og er afhængige af det tidspunkt, hvor cellerne høstes22. Den samtidige kvantitative vurdering af flere parametre for cellefænotype gør det muligt at påvise mindre subpopulationer med høj nøjagtighed, f.eks. kan sjældne celleundergrupper med en lav frekvens på 0,01% detekteres23. Multiparametrisk FC-analyse er især nyttig, da apoptotisk død forekommer langs et spektrum af tidlige og sene biokemiske ændringer med celler på forskellige punkter langs det apoptotiske kontinuum. For eksempel muliggør brugen af dobbeltfarvning ved hjælp af Annexin V og propidiumiodid i FC-analyse af apoptotiske celler kategorisering af tidlige apoptotiske celler, sene apoptotiske celler og døde celler24. Den nøjagtige påvisning af apoptose i flere faser undgår fejlklassificering og falsk-negative resultater. Således forbedrer multiparametrisk analyse af FC den overordnede specificitet ved påvisning af cellefænotyper og undgår fejlklassificering af mindre populationer. Desuden tillader cellesortering ved FC isolering af cellepopulationer med høj renhed til efterfølgende analyse7.
Ulempen ved FC omfatter brugen af celler i suspension, hvilket kan være udfordrende i vævsanalyse, da disaggregering af væv i celler kan ændre cellulær funktion19. Desuden kan manglen på standardisering af FC-instrumentopsætning, dataanalyse og analyserapporter forårsage variation i resultater19, hvilket understreger behovet for optimalt at træne FC-operatører til at udføre og analysere og rapportere data. For eksempel kræver FC’s evne til at skelne ægte apoptotisk affald fra apoptotiske kerner i) korrekte erhvervelsesindstillinger, ii) brugen af kalibreringsperler til at identificere en diploide DNA-top og iii) negative og positive cellekontroller, der er cellespecifikke3. Desuden er multiparametrisk analyse begrænset af antallet af detektorer, og der skal udføres optimal kompensation for at undgå uspecifikke resultater og afsmittende virkninger af fluorescerende emission ved anvendelse af flere fluorescerende reagenser25. Fremskridt inden for instrument- og fluoroforteknologi har forbedret parameterdetektering til 30 parametre12.
Identifikationen af apoptotisk celledød er ikke altid enkel7, og følsomme og specifikke biomarkører bør overvejes. Nomenklaturudvalget for celledød (NCCD) anbefaler, at der anvendes mere end et assay til at undersøge og kvantificere processen med apoptose26. Mikroskopianalyse for klassiske apoptotiske træk26 anbefales også for at bekræfte apoptose og undgå falsk-positive resultater7. Fire kardinale biokemiske egenskaber, der spænder over tidlige og sene apoptotiske hændelser, er (1) tab af cellemembranasymmetri; (2) spredning mitokondrie membranpotentiale (ΔΨm); (3) caspase aktivering; og (4) DNA-skade26.
Under tidlig apoptose eksternaliseres phosphatidylserin til den ydre cellemembran 27 og kan detekteres ved Annexin V fluorescerende mærket med phycoerythrin27,28,29. Desuden skelner dobbeltfarvning med det fluorescerende DNA-bindende farvestof, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), levende, sen-apoptotiske og døde celler. Derfor pletter tidlige apoptotiske celler positivt for Annexin V og negativt for 7-AAD, i modsætning til sen-apoptotiske celler, der pletter positivt for begge farvestoffer24.
Intrinsiske apoptotiske signaler inducerer spredning af mitokondriemembranpotentialet (ΔΨm). Den forstyrrede ΔΨm forårsager frigivelse af tidlige pro-apoptotiske proteiner fra mitokondrieintermembranrummet ind i cytosolen27,29,30. Ændring i ΔΨm kan vurderes ved dobbeltfarvning med det positivt ladede, lipofile farvestof, tetramethylrhodamin ethylester, TMRE og 7-AAD. TMRE-farvestoffet akkumuleres i den indre membran af intakte mitokondrier, når membranpotentialet er højt. Depolariserede mitokondrier viser nedsat fluorescens. Levende celler med polariserede mitokondrier (intakt mitokondriemembran) pletter positive for TMRE og negative for 7-AAD. Døde celler med depolariserede mitokondrier pletter negative for TMRE og positive for 7-AAD31.
Caspaserne er en familie af intracellulære proteaser, der, når de aktiveres, signalerer og udfører apoptose26,27. De terminale bøddelkaspaser (3,6,7) effekt sen apoptose 29,32,33. Caspase-3 og -7 aktiviteter kan måles af et fluorescerende mærket substrat, som, når det spaltes, binder til DNA og udsender et fluorescerende signal. Desuden kan ethvert kompromis med cellemembranintegritet vurderes ved farvning med 7-AAD. Apoptotiske celler pletter positivt for det DNA-bindende farvestof, men negativt for 7-AAD. Senapoptotiske og døde celler pletter positivt for begge farvestoffer34.
Sen apoptose er karakteriseret ved DNA-skade27,29,35, som kan evalueres ved phosphoryleret ataxiatelangiectasia muteret kinase (ATM) og histon H2A.X. Dobbeltstrengede DNA-brud (DSB’er) forårsager phosphorylering af H2A.X. Fluorescerende mærkede antistoffer mod ATM og H2A. X kan bestemme DNA-skader. Negativ detektion af både ATM og H2A. X indikerer ingen DNA-skade, mens påvisning af begge farvestoffer indikerer tilstedeværelsen af dobbeltstrengsbrud i DNA36.
Actinomycin D er en potent inducer af apoptose og virker ved at binde til DNA for at blokere transkriptions- og translationshændelser37. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere biokemisk apoptose induceret af actinomycin D i SiHa-cellelinjen ved at analysere tidlige og sene biomarkører for apoptose. Fire biokemiske biomarkører for apoptose vurderede de sekventielle trin i den apoptotiske kaskade, der omfattede tab af cellemembranasymmetri, ændring i mitokondriemembranpotentiale, aktivering af terminale caspaser og DNA-skade.
I denne undersøgelse afslørede actinomycin D-behandlede SiHa-celler analyseret af FC signifikante tidlige og sene biomarkører for apoptose. Suboptimale betingelser for celleforberedelse, optælling og farvning identificerede unøjagtige resultater, hvilket understreger behovet for nøje overholdelse af producentens anvisninger, når FC udføres.
Denne undersøgelse af apoptose ved tidlig og sen biomarkøridentifikation er i overensstemmelse med NCCD-retningslinjerne1 til undersøgelse af apoptose. Actinomycin D-behandlede SiHa-kulturer viste positive biomarkører for tidlige og sene apoptotiske stadier. Annexin V/PI-analysen og mitokondriepermeabilitetsanalysen viste, at actinomycin D inducerede henholdsvis et PS-flip-mønster og spredning af mitokondriemembranovergangen. Når apoptotiske celler når point of no return induceret af mitokondriel forstyrrelse, aktiveres de terminale caspaser 3,7. Aktiveringen af de terminale caspaser 3 og 7 observeret i denne undersøgelse indikerer apoptose i sen fase. Desuden forårsager terminal caspaseaktivering internukleosomal DNA-spaltning og omfattende DNA-fragmentering, som klassisk er blevet rapporteret som et trinstigemønster observeret ved gelelektroforese28,38.
Den nukleare skade med ATM og H2A. X FC DNA-skadeanalyse viste dobbeltstrengsbrud i DNA og total DNA-skade. Disse resultater bekræftede klassisk nedstrøms caspase-induceret apoptotisk nuklear skade (karyorrhexis og karyorrlysis) i eksperimentelle kulturer. Anvendelsen af multipel flow cytometriske biomarkører detekterede således de sekventielle flertrinshændelser i apoptose og nøjagtigt og reproducerbart identificerede cellepopulationer i tidlige og sene apoptotiske stadier. Disse resultater er i overensstemmelse med de kendte pro-apoptotiske træk ved actinomycin D i kræftbehandling hos mennesker37,39,40,41 og understøtter yderligere brugen af actinomycin D som en positiv kontrol i FC-cellekultureksperimenter, der undersøger apoptose.
Gating af cellepopulationer i denne undersøgelse blev informeret af negative medium og opløsningsmiddelkontroller, som adskilte apoptotiske fra raske celler. Alternativt kan en blanding af populationer af positive og negative kontroller også anvendes til at definere levende og apoptotiske cellepopulationer for at fastsætte cellepopulationsportene 7,9. Når syge og sunde cellulære tilstande er defineret og gated, kan skabelonindstillingerne anvendes på alle efterfølgende eksperimentelle og kontrolkulturer.
Streng overholdelse af FC-protokollen er afgørende for at undgå falske resultater. Under optimeringen af protokollen blev følgende problemer observeret: (1) lav cellekoncentration, (2) høj cellekoncentration, (3) celleklumpning, (4) langvarig farvning og (5) dårlig prøvehåndtering. Disse problemer kan forhindres ved nøje overholdelse af optimerede protokolkrav. Dette understreger den afgørende karakter af præanalytiske og analytiske trin for FC for at opnå nøjagtige data. Under celleforberedelse skal trypsinisering, pipettering, centrifugering og fortyndinger udføres med omhu. Over-trypsinisering og kraftig pipettering kan resultere i henholdsvis kemisk og mekanisk klipning af celler. Langvarig centrifugering med høj hastighed kan resultere i cellenedbrydning og høje cellulære affaldstal. Optimal cellekoncentration er nødvendig for at minimere forkert erhvervelse af cellehændelser. Derfor bør primære cellesuspensioner fortyndes for at opnå optimal cellekoncentration.
Ved håndtering af prøver skal man desuden sørge for at forhindre celleklumpning og cellefragmentering og sikre, at cellerne forbliver suspenderet under analysen. Prøvehåndtering for at forhindre celleklumpning tillader enkelt laminær cellestrøm, forhindrer mekanisk blokering af instrumentets kapillærrør og bremser falske store cellestørrelsesindekser. En anden advarsel er at beskytte kulturer mod lys for at undgå fotooxidation og slukning af fluoroforerne i analyserne for at forhindre falsk-negative resultater. Der skal udvises omhu for at sikre minimal lyseksponering ved cellernes farvningstrin og efterfølgende behandlingstrin. Desuden kan forlængede immunfarvningstider resultere i falsk-positive resultater, da proteiner er ikke-specifikt farvede. Derfor er overholdelse af fabrikantens foreskrevne inkubationsfarvningsperioder vigtig.
Sammenfattende kan FC nøjagtigt detektere apoptose og skelne mellem tidlige og sene apoptosebiomarkører i cellekultur. Derudover har teknologiske fremskridt ført til fremstilling af stationære flowcytometre til ikke-ekspertforskere til at studere cellesundhed og komplekse intracellulære signalveje.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet økonomisk af National Research Foundation (NRF) og South African Medical Research Council (SAMRC). Vi vil gerne takke National Health Laboratory Service (NHLS) for købet af Guava Muse Cell Analyzer. Alle figurer i denne publikation blev oprettet med Biorender.com.
6-well plates | Lasec | P1PLA044C-000006 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
DMEM | ThermoFisher | 41966052 | |
Glutamine | Sigma-Aldrich | P10-040500 | |
Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | |
Microcentrifuge tubes/Eppendorf | Merck | EP0030122208-200EA | |
Muse Annexin V kit | Merck | MCH100105 | |
Muse Caspase-3/7 kit | Merck | MCH100108 | |
Muse Count and Viability kit | Merck | MCH600103 | |
Muse DNA Damage kit | Merck | MCH200107 | |
Muse MitoPotential kit | Merck | MCH100110 | |
PBS Buffer | ThermoFisher | 70013065 | |
Pen-strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
SiHa cells | ATCC | CRL-1550 | |
T25 culture flasks | Sigma-Aldrich | C6231 | |
Trypsin | Pan Biotech | P10-040500 |