Summary
בפרוטוקול זה, שיטות לסינתזה ואפיון של טיפות פורפירין מרובות מודאליות לשינוי פאזה מפורטות.
Abstract
טיפות שינוי פאזה הן סוג של סוכני ניגודיות אולטרסאונד שיכולים להמיר microbubbles echogenic במקום עם היישום של אנרגיה אקוסטית מספקת. הטיפות קטנות ויציבות יותר מעמיתיהן המיקרו-חלוקים. עם זאת, סוכני ניגודיות אולטרסאונד מסורתיים אינם ניתנים למעקב מעבר למדידות משוב אקוסטי, מה שהופך את כימות סוכן ניגוד ביו הפצה או הצטברות ex vivo קשה. ייתכן שהחוקרים יצטרכו להסתמך על חלקיקי אבחון נלווים פלואורסצנטיים או סופגים אופטית כדי להסיק ביו-הפצה. מטרת פרוטוקול זה היא לפרט שלבים ליצירת טיפות פורפירין מרובות מודאליות לשינוי פאזה בשיטת עיבוי. פורפירינים הם מולקולות פלואורסצנטיות עם רצועות ספיגה ייחודיות שניתן להטות על שומנים ולשלב בטיפות כדי להרחיב את הרבגוניות של הטיפות, מה שמאפשר הפצה ביולוגית חזקה יותר תוך שמירה על תכונות אקוסטיות. שבעה ניסוחים עם תוכן שומנים פורפירין-שומנים שונים ותכולת שומנים בסיסית נעשו כדי לחקור חלוקות microbubble וגודל טיפה. אפיונים המתאימים למבנים המכילים פורפירין מתוארים גם בפרוטוקול כדי להדגים את הרבגוניות האנליטית שלהם בפתרון. שינוי גודל הראה כי הקטרים הממוצעים לאחר מרוכז היו 1.72 עד 2.38 פעמים קטן יותר מאשר אוכלוסיות מבשר. אפיון הספיגה הראה כי מכלולים שלמים היו בעלי פס Q של 700 ננומטר, בעוד שלדגימות משובשות היה שיא ספיגה של 671 ננומטר. אפיון הפלואורסצנטיות הראה כי 30% מכלולי השומנים-פורפירין היו מרווים פלואורסצנטית (>97%), עם התאוששות פלואורסצנטית שהושגה עם ההפרעה. אידוי אקוסטי הראה כי טיפות פורפירין היו לא מהדהדות בלחצים נמוכים יותר וניתן להמירן למיקרו-חלוקים מהוגניים עם לחצים מספיקים. אפיונים אלה מראים את הפוטנציאל של טיפות פורפירין כדי לחסל את הצורך בספיגה או אסטרטגיות אבחון נלוות מבוססות פלואורסצנטיות כדי לכמת את ההפצה הביו-הפצתית של סוכן הניגודיות של אולטרסאונד למשלוח או יישומים טיפוליים ב- vivo או ex vivo.
Introduction
הדמיית אולטראסאונד היא צורה לא פולשנית, לא מייננות של הדמיה רפואית המשתמשת בגלים אקוסטיים. בעוד סורקי אולטרסאונד הם ניידים יותר והוא יכול לספק תמונות בזמן אמת, הדמיית אולטרסאונד יכול לסבול ניגודיות נמוכה, מה שמקשה על סונוגרפים להבחין באופן אמין תכונות פתולוגיות echogenic דומה. כדי לנטרל מגבלה זו, microbubbles ניתן להזריק לתוך המארח כדי לשפר את ניגודיות כלי הדם. Microbubbles הם סוכני ניגודיות מלא גז בגודל מיקרון כי הם מהדהדים מאוד גלים אקוסטיים יכול לספק ניגודיות כלימשופרת 1,2. הקונכיות וליבות הגז של microbubbles ניתן להתאים עבור יישומים שונים, כגון הדמיה, תרומבוליזה, פרמביליזציה קרום התא, או פתיחת כלי דם חולף2.
חיסרון של microbubbles הוא מחצית החיים במחזור הקצר שלהם. לדוגמה, מיקרוספרות שומנים פרפלוטרן זמין קלינית יש רק מחצית חיים של 1.3 דקות3. עבור מפגשי הדמיה ארוכים, זריקות מרובות של microbubbles נדרשים. חיסרון נוסף של microbubbles הוא הקטרים הגדולים שלהם. בעוד מיקרוספרות שומנים perflutren הם סביב 1 עד 3 מיקרומטר קוטר, קטן מספיק כדי להסתובב vasculature, הם גדולים מדי כדי extravasate ולהצטבר באופן פסיבי לתוך רקמות עניין, כגון גידולים4. אסטרטגיה אחת להתגבר על מגבלות אלה היא לדחוס את microbubbles ליבת הגז לתוך טיפות קטנות יותר, הליבה הנוזלית5,6. בעוד טיפות אינן echogenic במצב הנוזלי שלהם, הם יכולים להיות מתאדים לתוך microbubbles עם חשיפה לאולטרסאונד עם לחץ שלילי שיא גבוה מספיק, החזרת היכולת שלהם לספק ניגודיות. זה מאפשר לטיפות לנצל את הפרמקוקינטיקה החיובית יותר של ליבת נוזל קטנה, תוך שמירה על היכולת לספק ניגודיות כאשר אינסונציה ומבלי לשנות את ההרכב הכימי4,7.
Decafluorobutane הוא תרכובת פרפלואורוקרבון אידיאלית להזזת פאזה בין מצבים גזיים ונוזלים5,6,7. Decafluorobutane מאפשר עיבוי של microbubbles לתוך טיפות עם הפחתת טמפרטורה לבד, בעוד perfluorocarbons פחות צפוף דורשים לחץ נוסף5. שיטה עדינה זו ממזערת הרס של בועות במהלך עיבוי7,8,9. כמו הליבות שלהם הם נוזליים, טיפות אינן echogenic ובלתי נראות לאולטרסאונד. עם זאת, עם היישום של אנרגיה אקוסטית או תרמית מספיק, הליבות הנוזליות יכולות להתאדות בחזרה למצב גזי, יצירת microbubbles echogenic8. אידוי זה מאפשר שליטה על מתי והיכן ליצור microbubbles.
בעוד טיפות שימושיות עבור הצטברות פסיבית, באידוי במקום, או שיפור חמילות התא4, טיפות (ואת השברים שלהם) לא ניתן לדמיין או לכמת ex vivo. לכן, סוכן אבחון לוויה לכימות, כגון פלואורסצנטי4,10,11, חלקיקים מגנטיים12, סוכנים סופגים אופטית13, משמשים כאנלוגי כדי לאמוד משלוח טיפה לרקמות עניין. לדוגמה, Helfield ואח ' השתמש בזריקה משותפת של ננו-חרוזים פלואורסצנטיים לכימות תמונה היסתולוגית של איברי עכבר כמו טיפות לא ניתן היה לזהות פלואורסצנטי4. החיסרון של סוכני אבחון נלווים הוא הרכיב הניתן למעקב עשוי לפעול באופן עצמאי מהטיפת בהתאם לפרופיל הפרמקוקינטי הבודד שלו.
למרבה המזל, ניתן להתאים אישית את קליפת המיקרו-יבלות והטיפות. לדוגמה, Huynh ואח 'הדגים סוכני ניגודיות אולטרסאונד עם קליפות פורפירין-שומנים, יצירת microbubbles multi-מודאלי14. פורפירינים הם סוג של תרכובות אורגניות עם מבנה מקירו-דרגליארומטי 14,15. הם סופגים אופטית, פלואורסצנטיים, וניתן לכלאט למגוון רחב של מתכות להקרנות, הדמיה מבוססת רדיונוקלידים, או כימות מבוסס מתכת קורט14. דוגמה אחת של פורפירין היא pyropheophorbide (Pyro). על ידי הצמדת Pyro על שומנים, שילוב Pyro-שומנים ב microbubbles או טיפות לאפשר להם להיות תמונה ומעקב באמצעות שיטות מרובות: אקוסטית, פלואורסצנטית,ודרך ספיגה 14. סוכן ניגודיות רב-מודאלי זה יכול לשמש למעקב וכימות הצטברות. פעולה זו עשויה לבטל את הצורך של סוכני אבחון נלווים מכיוון שהרכיב הניתן לכימות מצומד כעת על המעטפת, ומאפשר כימות מסירה מדויק יותר16.
להלן פרוטוקול ליצירת טיפות פורפירין מרובות מודאליות לשינוי פאזה. כמו אולטרסאונד ניגודים סוכנים יכולים לשמש כפלטפורמה להעברת תרופות לרקמות מעניינות, כגון גידולים2,4, הרחבת יכולת הזיהוי שלהם מעבר אולטרסאונד יכול להוכיח שימושי עבור כימות יעילות המסירה. מטרת הטיפות הללו היא לספק סוכני ניגודיות אולטרסאונד הניתנים למעקב המסוגלים להצטברות פסיבית ב- vivo, באידוי ובאקוסטיקה, ועם פוטנציאל לכמת הפצה ביולוגית או הצטברות מאיברי ex vivo ללא הסתמכות על חיישנים משניים. שיטות אפיון מתארות גם כדי להציג את הפוטנציאל של טיפות פורפירין כחיישנים להפצה ביולוגית. ההשפעות של טעינת פירו-שומנים במעטפת (0% עד 50% על ידי יחס טחנת) נדונים גם.
Protocol
1. סרטי שומנים מיובשים
- חשב את המסות של כל אחד מרכיבי המעטפת הדרושים (ראה קובץ משלים "גיליון נוסחת שומנים").
הערה: עבור פרוטוקול זה, הרכב הקונכייה יהיה: 10 טוחנת % 1,2-דיסטרויל-סן-גלייצרו-3-פוספוטנולמין-N-[מתוקסי (פוליאתילן גליקול)-5000] מלח אמוניום (DSPE-PEG5K), x שיניים טחונות % פירופואפורביד 1-סטיארויל-2-הידרוקסי-sn-glycero-3-פוספוקולין (Pyro-SPC), ו -(90 - x) טוחנת % 1,2-דיסטרויל-sn-גליצרי-3-פוספוזולין (DSPC). כמות Pyro-SPC תהיה מגוונת על פני 7 קומפוזיציות פגז (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). בדוק את המשקל המולקולרי של DSPE-PEG5K על בקבוק המלאי.- שנה את קנה המידה של הפרוטוקול לכל נפח שומנים עם נפח מינימלי של 1 מ"ל. עבור פרוטוקול זה, נפח שומנים כולל של 10 מ"ל עם ריכוז שומנים כולל של 1 מ"ג למ"ל שימש עבור כל ניסוחים. הפתרון המרגש יהיה: 10% פרופילן גליקול, 10% גליצל ו-80% תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS, 1X, 7.4 pH) (% v/v/v) (ראה שלב 2.3 ו"גיליון נוסחת השומנים").
הערה: פרוטוקול סינתזה של Pyro-שומנים מתואר בקובץ המשלים "פרוטוקולים אחרים ונתונים" שלבים S1 כדי S1.19, אשר שונה מן העבודה שנעשתה על ידי Zheng ואח'15.
- שנה את קנה המידה של הפרוטוקול לכל נפח שומנים עם נפח מינימלי של 1 מ"ל. עבור פרוטוקול זה, נפח שומנים כולל של 10 מ"ל עם ריכוז שומנים כולל של 1 מ"ג למ"ל שימש עבור כל ניסוחים. הפתרון המרגש יהיה: 10% פרופילן גליקול, 10% גליצל ו-80% תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS, 1X, 7.4 pH) (% v/v/v) (ראה שלב 2.3 ו"גיליון נוסחת השומנים").
- בהתבסס על המסות המחושב (ראה שלב 1.1 ו"גיליון נוסחת השומנים"), שוקלים כל אחד מהליפידים שאינם פירו ומעבירים ל בקבוקון זכוכית בורוסיליקט בגודל מספיק עם מכסה בורג על.
- מכסים את הנקניקיון, מתייגים את הכובע והוויאל, ומכסים את החלק התחתון והקירות של מחמתן השומנים בנייר אלומיניום. פתחן זה ייקרא "Vial השומנים" למשך שארית הפרוטוקול. יש לאחסן את כוהן השומנים באזור קריר, יבש וחשוך.
- אם הניסוח מכיל Pyro-SPC, להמיס 10 מ"ג של סרט יבש Pyro-SPC (ראה "פרוטוקולים אחרים נתונים") לתוך 1 מ"ל של כלורופורם. מערבולת עבור 5 s, למדוד את הספיגה, ולחשב את הנפח המתאים להוסיף לנקניקיית השומנים.
זהירות: כלורופורם מהווה סכנה בריאותית, מגרה ורעיל. ללבוש חלוק מעבדה מגן, הגנה על העיניים, כפפות, ולהימנע אדי נשימה.
הערה: מכיוון ש- Pyro-SPC רגיש לאור, הפחית את האורות באזור העבודה במידת האפשר בעת טיפול ב- Pyro-SPC. יש לשמור על Pyro-SPC אטום ומכוסה כאשר אינו בשימוש.- על הספקטרופוטומטר הנראה לעין אולטרה סגול, הגדר אותו למדידת ספיגה מטווח גל של 800 ננומטר עד 300 ננומטר עם תוספת קבועה של 0.5 ננומטר, ולמדוד קו בסיס עם 2000 μL של מתנול טהור בקובט אורך נתיב תואם של 1 ס"מ.
זהירות: מתנול מהווה סכנה בריאותית, מגרה, רעיל ודליק. ללבוש חלוק מעבדה מגן, הגנה על העיניים, כפפות, ולהימנע אדי נשימה. יש להרחיק ניצוצות וחום. - הוסף 2 μL של Pyro-SPC בכלורופורם לתוך 2000 μL של מתנול, ומערבולת עבור 30 s. מעבירים אותו לקובט נקי ותואם של 1 ס"מ, ומודדים את הספיגה. התאם גורם דילול זה אם שיא הספיגה ב- 667 ננומטר מתוך טווח הספיגה של הספקטרופוטומטר הנראה במיוחד.
הערה: בכל פעם שמעבירים כלורופורם או מתנול, השתמשו במזרק זכוכית נקי או בצינורה עם תזוזה חיובית ולא בצינור מכני לדיוק טוב יותר. - חזור על שלב 1.4.2 פעמיים נוספות כדי לקבל ערכי ספיגה משולשים.
- ממוצע ערכי שיא הספיגה ב 667 ננומטר ולהשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את הנפח של Pyro-SPC בכלורופורם הדרוש עבור Vial השומנים14,15:
כאשר V הוא הנפח של Pyro-SPC בכלורופורם הדרוש, m הוא המסה הנדרשת של Pyro-SPC (ראה שלב 1.1 ו "גיליון נוסחת השומנים"), M הוא המשקל המולקולרי של Pyro-SPC ב 1040.317 g·mol-1, A הוא הספיגה הממוצעת ב 667 ננומטר, d הוא גורם הדילול המבוסס על מתנול ו Pyro-SPC בנפחי כלורופורם (שלב 1.4.2), L הוא אורך נתיב cuvette ב 1 ס"מ, ε הוא 667 ננומטר מקדם ההנחיה הטוחנת של Pyro-SPC ב 45000 L·mol-1·ס"מ-1.
הערה: המכנה של המשוואה הוא חוק באר-למברט, המתייחס לריכוז של ניתוח בפתרון לספיגה האופטית הנמדדת על פני מרחק. - הוסף את הנפח המחושב של Pyro-SPC בכלורופורם מהשלב הקודם ל בקבוקון השומנים באמצעות מזרק זכוכית נקי (איור 1A) ולאחר מכן כובע ולכסות את בקבוקון.
הערה: איור 1 מציג רק את ניסוח ה-Pyro-lipid של 30% בלבד. - אם נשאר פירו-SPC בכלורופורם: במכסה אדים, בטל את ה-Pyro-SPC + מחמת הכלורופורם מ-שלב 1.4, הטה חלקית את הגיוחן לצדו והזרימו ללא הרף גז חנקן בעדינות רבה ככל האפשר לתוך ה-Pyro-SPC/כלורופורם השמינייה. סובב את ה- Vial כדי לייבש את הכלורופורם באמצעות זרימת גז החנקן ולכסות באופן שווה את Pyro-SPC על הקיר הפנימי של הקרבון כפי שהוא מתייבש. ודא שלא נעשות התזות ואף אחד מהפתרון לא נופל.
- לאחר שסרט השומנים Pyro-SPC נראה יבש ומצופה על קיר של הבוילה, לכבות את זרימת גז החנקן. מכסים את המצופה, אוטמים את צוואר הנקניקיון בסרט שעווה ומאחסנים את הנקיל ב-20 מעלות צלזיוס ובחושך.
- על הספקטרופוטומטר הנראה לעין אולטרה סגול, הגדר אותו למדידת ספיגה מטווח גל של 800 ננומטר עד 300 ננומטר עם תוספת קבועה של 0.5 ננומטר, ולמדוד קו בסיס עם 2000 μL של מתנול טהור בקובט אורך נתיב תואם של 1 ס"מ.
- הכן פתרון של 90% כלורופורם ו 10% מתנול (% v/ v), ולהוסיף 5 מ"ל ממנו ללווייתן השומנים. מכסים את מקטורן השומנים, ומערבבים בעדינות כדי להומוגניזציה של התוכן (איור 1B).
הערה: אם הניסוח מכיל שומנים חומצה פוספטידית (כגון 1,2-distearoyl-sn-גלייצרו-3-פוספט מלח נתרן (DSPA)), להוסיף: 60% כלורופורם, 32% מתנול, ו 8% מים כפולים (% v / v / v) ל Vial השומנים במקום. מערבולת אינטנסיבית יותר עשויה להיות נחוצה כדי להמיס באופן מלא את תוכן השומנים. - במכסה המנוע אדים, בטל את מכסה את מקטורן השומנים, הטה חלקית את מקטוריית השומנים לצדו וזרימו ללא הרף גז חנקן בעדינות רבה ככל האפשר לתוך נטל השומנים. סובבו את מקטוריית השומנים כדי לייבש את הפתרון באמצעות זרימת גז החנקן וציפו באופן שווה את סרט השומנים על הקיר הפנימי של קריאל השומנים כשהוא מתייבש. ודא שלא נעשות התזות ואף אחד מהפתרון לא נופל.
- ברגע שהשומנים נראים יבשים ומכופתרים על הקירות הפנימיים של בקבוקון השומנים (איור 1C),מכבים את זרימת גז החנקן, מכסים את החלק התחתון והקיר של בקבוקון השומנים בנייר אלומיניום, ומכסים את הפתח העליון בנייר אלומיניום עם כמה חורים עם מחט לאוורור (איור 1D).
- יש לתייג ולהניח את בקבוקון השומנים המקורה בתוך מייבש אבק ולאפשר לליפידים להתייבש עוד יותר למשך 24 שעות לפחות, אך לא יותר מ-72 שעות.
הערה: ניתן לחדש את הפרוטוקול מאוחר יותר, לאחר 24 עד 72 שעות.
2. הידרציה שומנים בדם
- מלא sonicator אמבטיה עם מים לחמם אותו ל 70 °C (70 °F). הפעל את sonication כדי לעזור לערבב את המים.
זהירות:המים והסוניטור נמצאים בטמפרטורות גבוהות. הימנעו מלגעת במים ובסוניקטור. ללבוש הגנה על העיניים, חלוק מעבדה מגן, וכפפות מגן. - לאחר sonicator האמבטיה הגיע 70 °C (70 °F), להסיר את בקבוקון השומנים מן חיטוי ואקום. הפחת את האורות באזור העבודה במידת האפשר.
- הכן פתרון אקספיציה של 10% פרופילן גליקול, 10% גליצל, 80% PBS (% v/v/v) והוסף 10 מ"ל ממנו לצעיפידון (ראה שלב 1.1.1 ו"גיליון נוסחת השומנים").
הערה: אם אתם משתמשים בצנרת סטנדרטית להעתקת אוויר, השתמשו בטיפול בעת טיפול בממסים צמיגים כמו פרופילן גליקול גליצריל. שאפו וצללו את הנפח לאט והמתינו לנפח השיורי שיגיע לתחתית קצה הפיפטה. ודא שהנוזל אינו נצמד לחלק החיצוני של קצה הפיפטה בעת העברת נפחים על-ידי תנועה איטית. - מכסים את לוויה השומנים, מסירים את כיסוי האלומיניום ומסובבים בעדינות את הלוויאל בסוניקטור האמבטיה למשך 15 דקות בזמן שהסוניקציה על מנת להמיס את השומנים. תוודא שהצוואר של ליפדון הוא מעל המים. מדי פעם בדקו אם מכסה המצקה סגור באופן מאובטח.
- מדי פעם, להסיר את השומנים Vial מאמבט המים. החזק אותו בקצרה באור כדי לבדוק אם התוכן מומס במלואו(איור 1E).
- אם התוכן של ליפיד ויאלי אינם הומוגניים, להסיר את השומנים Vial מן sonicator האמבטיה. אבטחו את המכסה, מערבבים באגרסיביות רבה יותר, והחזירו אותו לסוניקאטור האמבטיה.
- הסר את נבצר השומנים מן sonicator האמבטיה, ולכבה את sonicator האמבטיה. יבשו את החלק החיצוני של ליפדון עם מגבות נייר, ותייגו מחדש את מקטורן השומנים.
- מכסים את נטל השומנים בנייר אלומיניום, ומצננים את נטל השומנים בטמפרטורת החדר באזור קריר, חשוך ויבש למשך 10 דקות.
- Aliquot את תכולת בקבוקון השומנים: כ 2 מ"ל של תמיסת השומנים ב 3 מ"ל זכוכית borosilicate זכוכית ברורה בקבוקונים (7 מ"מ קוטר הפה הפנימי, קוטר 13 מ"מ הפה החיצוני).
הערה: פרוטוקולים מסוימים עשויים להשתמש 1.5 מ"ל של פתרון שומנים בדם ב 3 מ"ל בון7. - מכסים את בקבוקוני הסרום עם פקקי גומי כלורובוטיל אפורים בסגנון ליופיליזציה (קוטר פה פנימי בקוטר 7 מ"מ, קוטר הפה החיצוני של 13 מ"מ) ומאבטחים את פקק הגומי עם חותמות אלומיניום קורעות (קוטר 13 מ"מ חיצוני בפה) וקרימפר(איור 1F).
- ואקום, דגה ולחץ מחדש על תמיסת השומנים בכל אחד מבקבוקוני הסרום4,5,7 ( איור2).
הערה: עיין ב"פרוטוקולים ונתונים אחרים" לקבלת הוראות כיצד להרכיב את מחליף הגז ופרטים נוספים.- סגור כל שסתום בין וכולל שסתום לחץ A ושסתום גליל גז (איור 2). חבר את בקבוקוני הסרום למחטים הסעפת, ולאחר מכן לפתוח את שסתומי סעפת המקביל, ולאחר מכן לפתוח שסתום ואקום A שסתום ואקום B, ואקום ב -90 kPa (-13 פסאיי, -900 mbar) במשך 5 דקות כדי להסיר אוויר אטמוספרי. אל תשאוב אף אחד מהנוזלים (ראה "פרוטוקולים ונתונים אחרים" שלבים S3 ל- S3.1.5).
זהירות:משאבת הוואקום יכולה להתפוצץ אם מטפלים בה בצורה לא נכונה. אין להשתמש במשאבת הוואקום עם כימיקלים אורגניים, חומציים או בסיסיים. - כשהוואקום עדיין דלוק, החזק בקבוקון בסרום (כדי למנוע ממנו להתנדנד) והקש עליו במהירות עם עט או סמן לדגה. ממשיכים להקיש עד שלא נוצרות בועות ואין בועות בקסימה. אל תתנו כל נוזל להיות שואב החוצה. הפסק להקיש במידת הצורך. חזור על הפעולה עבור כל בקבוקוני הסרום המחוברים. לאחר סילוק כל בקבוקוני הסרום, סגור שסתום ואקום A ושסתום ואקום B ולכבה את משאבת הוואקום (ראה "פרוטוקולים ונתונים אחרים" שלבים S3.2 ל- S3.2.3).
- עם בקבוקון הסרום עדיין מחובר למחט עם משאבת ואקום כבוי, לאט לאט להפוך את שסתום גליל גז 1/16 כדי 1/8 (על 22.5 עד 45 ° של מהפכה מלאה) נגד כיוון השעון כדי לפתוח חלקית, ולאחר מכן לפתוח את שסתום T-Handle, לאט להפוך את שסתום ויסת האוויר בכיוון השעון ל 3 psi (20.7 kPa) מד. לאחר מכן, פתח שסתום לחץ A שסתום לחץ B (ראה "פרוטוקולים אחרים ונתונים" שלבים S3.3 כדי S3.3.21).
זהירות: צילינדר הגז decafluorobutane נמצא תחת לחץ והוא יכול להתפוצץ אם מחומם. יש להרחיק את החום והפגיעה. גז Decafluorobutane עלול לגרום תזוזת חמצן וחנק. יש ללבוש הגנה נכונה על העיניים ולטפל במכסה המנוע. אם מטופלים באופן שגוי, ניתן לשאוב את בלון הגז, אשר יכול לגרום דה-לחץ מהיר וקיסה. פתיחת שסתום גליל גז יותר מ 1/8 סיבוב יכול לפגוערגולטור האוויר. - לאחר 30 s של לחץ (מד עדיין צריך לקרוא 3 psi (20.7 kPa)), לסגור את כל שסתומים סעפת עם בקבוקונים בסרום, לנתק את בקבוקוני הסרום, נדן את המחטים, ולסגור את שסתום גליל הגז.
- להקל על הלחץ המובנה על ידי פתיחה חלקית שסתום סעפת יחיד עד מחט מד מווסת האוויר הולך למצב המנוחה שלה. ואז לסגור את הכל בין וכולל שסתומים סעפת ואת T-ידית.
- סגור כל שסתום בין וכולל שסתום לחץ A ושסתום גליל גז (איור 2). חבר את בקבוקוני הסרום למחטים הסעפת, ולאחר מכן לפתוח את שסתומי סעפת המקביל, ולאחר מכן לפתוח שסתום ואקום A שסתום ואקום B, ואקום ב -90 kPa (-13 פסאיי, -900 mbar) במשך 5 דקות כדי להסיר אוויר אטמוספרי. אל תשאוב אף אחד מהנוזלים (ראה "פרוטוקולים ונתונים אחרים" שלבים S3 ל- S3.1.5).
- יש לתייג בקבוקוני סרום ולאחסן אותם ב-4 מעלות צלזיוס ובחשיכה. ודא שכל שסתומי מחליף הגז סגורים ומשאבת הוואקום כבויה לאחר מכן.
הערה: הנסיוב צריך להיות יציב עד 4 חודשים במצב זה. בשלב זה, הפרוטוקול ניתן לחדש מאוחר יותר, לאחר 4 חודשים לבסוף.
3. בקבוקונים של Decafluorobutane
- עם בקבוקונים נקיים, ריקים 3 מ"ל זכוכית borosilicate סרום ברור (7 מ"מ קוטר הפה הפנימי, 13 מ"מ קוטר הפה החיצוני), כובע אותם עם פקקי גומי כלורובוטיל אפור בסגנון ליופיליזציה (7 מ"מ קוטר הפה הפנימי, קוטר הפה החיצוני 13 מ"מ) ולאבטח את פקק הגומי עם חותמות אלומיניום קורעות (קוטר הפה החיצוני 13 מ"מ) ו crimper4, 7,8.
- בצע את שלב 2.9.1 כדי לשאוב את האוויר האטמוספרי (ראה "פרוטוקולים ונתונים אחרים" שלבים S3.1 ל- S3.1.5).
- דלג על ביטול הגז ובצע את שלבים 2.9.3 עד 2.9.5 כדי ללחוץ מחדש על הבוחנה (ראה שלבים S3.3 ל- S3.3.21 של פרוטוקולים אחרים).
- לתייג את בקבוקוני decafluorobutane ולאחסן אותם ב 4 °C (5 °F) בחושך. ודא שכל שסתומי מחליף הגז סגורים ומשאבת הוואקום כבויה לאחר מכן.
הערה: בקבוקוני סרום מלאים בגז decafluorobutane יהיה צורך עיבוי טיפה. הם צריכים להיות יציבים עד 4 חודשים במצב הזה. בשלב זה, הפרוטוקול ניתן לחדש מאוחר יותר, לאחר 4 חודשים לבסוף.
4. היווצרות טיפה
- יש להסיר ממקרר תמיסה שומנית מיובשת בפקעת הסרום (מ-שלב 2.10).
- באמצעות decapper, להסיר את חותם האלומיניום על בקבוקון הסרום ולהעביר 1 מ"ל של תמיסה שומנים ל בקבוקון מדגם זכוכית borosilicate 1.85 מ"ל (עם כובע בורג פנולי) על ידי מתן פתרון השומנים לזרום במורד הקיר הפנימי. אל תיצור בועות.
- אם יש פתרון שומנים שנותר בחתינה בסרום, בצע את שלבים 2.9 עד 2.10 כדי degas ולחץ מחדש על מקטורן הסרום לאחסון (ראה "פרוטוקולים אחרים ונתונים" שלבים S3 ל S3.3.21).
- עם 1.85 מ"ל בוחן מדגם, לזרום בעדינות בגז decafluorobutane לתוך שטח הראש של מחמת המשתמשים מדגם באמצעות מחליף הגז (ראה איור 2 עבור שמות שסתומים ספציפיים).
- ודא שכל השסתומים במחליף הגז סגורים כראוי והמשאבה כבויה.
זהירות: אם נעשה באופן שגוי, ניתן לשאוב את בלון הגז הגורם להפחתת לחץ וקיסה מהירה. - פתח שסתום סעפת אחד ופתח בזהירות את המחט המתאימה מהסעפת.
זהירות:חפץ חד, הימנע ממגע/פירסינג. - פתח שסתום לחץ A שסתום לחץ B ולהפוך את שסתום גליל גז 1/16 כדי 1/8 (על 22.5 עד 45 ° של מהפכה מלאה) נגד כיוון השעון כדי לפתוח חלקית ולאחר מכן לפתוח את שסתום T-Handle.
זהירות: אל תפתח את שסתום גליל הגז יותר מזה כפי שהוא יכול לגרום נזק לרגולטור האוויר. - פרקו את פקעת מקטורן הדגימה עם תמיסה שומנים ולהזיז אותו כך מחט סעפת הוא מעל ממשק אוויר נוזלי בתוך המשחקון. תחזיק את הקרבון שם.
-
סובבו באיטיות את שסתום רגולטור האוויר בכיוון השעון עד שמחט מד מווסת האוויר נעה מעט מעמדת המנוחה שלה וגז פרפלואורוקרבון זורם בעדינות מתוך המחט המגוזרת. תן לגז perfluorocarbon לזרום בעדינות לתוך מרחב הראש של הוויאלי במשך 30 s. אל תיצור בועות. התאם את שסתום רגולטור האוויר במידת הצורך.
הערה: ממשק האוויר הנוזלי צריך להיות מוטרד מעט על ידי זרימת הגז decafluorobutane. מכיוון שהמערכת פתוחה כעת, מד הרגולטור האווירי אינו יכול לקרוא כראוי את הלחץ. - לאחר 30 s, בזהירות ובמהירות מכסה את ביקן המדגם מבלי להזיז את הקרבון יותר מדי.
- סגור את שסתום גליל הגז (בכיוון השעון), שסתום T-ידית, שסתום וסת אוויר (נגד כיוון השעון), שסתום לחץ A, שסתום לחץ B, שסתום סעפת.
- בזהירות נדן המחט.
- תייגו את מקטורן הדגימה וחתמו את הצוואר עם סרט שעווה בכיוון השעון(איור 3A ו-3B).
הערה: איורים 3B עד 3F רק להראות את ניסוח 30% פירו-שומנים.
- ודא שכל השסתומים במחליף הגז סגורים כראוי והמשאבה כבויה.
- יש לאחסן את מקטורן הדגימה בחושך וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות או עד 24 שעות.
הערה: בשלב זה, ניתן לחדש את הפרוטוקול מאוחר יותר, 24 שעות ביממה ליותר. - מניחים כ-100 גרם קרח יבש (פחמן דו-חמצני) במיכל מבודד ומניחים קרח רגיל במיכל מבודד אחר. יש לאחזר בקבוקוני סרום decafluorobutane מוכנים המוזכרים בשלב 3, שתי מחטים 3.81 ס"מ (1.5 אינץ '), מזרק פלסטיק 1 מ"ל (unstick הבוכנה לפני השימוש), מיכל 200 מ"ל, מלקחיים מתכת, ומדחום (-20 עד 100 °C (100 °F).
הערה: אם רק עושים microbubbles, אז אין צורך איזופרופנול, קרח יבש, וקרח. - מניחים את בוחן המדגם עם תמיסת השומנים בתסיסה המכנית ומסיתים עבור 45 s (איור 3C).
- לאחר התסיסה המכנית, עמדו בצד ימין של מחמת הדגימה, מוגנים מהאור, והתחלו ספירה לאחור של 15 דקות כדי לקרר את הוויאל ולבחור את המיקרו-יבלות8,17.
- כאשר הספירה לאחור של 15 דקות הגיעה ל -10 דקות (5 דקות נותרו בספירה לאחור), מלא מיכל עם כ 200 מ"ל של איזופרופנול ולקרר אותו למי -20 °C עם קרח יבש באמצעות מלקחיים מתכת.
הערה: טמפרטורת היעד היא -15 עד -17 °C (7 °F), אך האיזופרופנול יתחמם תוך כדי טיפול במיקרו-חלוקים.
זהירות:איזופרופנול דליק. יש להרחיק מחום וניצוצות. קרח יבש יכול לגרום נזק לעור. להתמודד עם מלקחיים. ללבוש כפפות, הגנה על העיניים, וחלוק מעבדה מגן.
- כאשר הספירה לאחור של 15 דקות הגיעה ל -10 דקות (5 דקות נותרו בספירה לאחור), מלא מיכל עם כ 200 מ"ל של איזופרופנול ולקרר אותו למי -20 °C עם קרח יבש באמצעות מלקחיים מתכת.
- לאחר שהמיקרו-יבלים נבחרו בגודל במשך 15 דקות, חפשו את המחיצה שנבחרה בגודל בתוך קובץ הבחירה לדוגמה(איור 3D).
- שמירה על בקבוקון מדגם בצד ימין למעלה, בזהירות לפתוח את בקבוקון המדגם, ולמשוך על 0.7 מ"ל של המחיצה התחתונה עם מחט 1.5 אינץ '20 מד מחובר מזרק פלסטיק 1 מ"ל. ודא שאף אחת מהמחיצה העליונה אינה נסוגה. אין להעיף את המזרק כדי להסיר כיסי אוויר.
- הכנס מחט אחרת 20-מד לתוך מקין סרום decafluorobutane (שמירה על המחט ליד החלק העליון של בון הסרום) לפרוק ולאחר מכן להכניס את המחט / מזרק עם microbubbles שנבחרו גודל.
- העבר לאט לאט את המיקרו-יבלים שנבחרו בגודל. הטה את הקטוריון וזווית המזרק כדי לאפשר לנוזל להחליק במורד הקיר הפנימי של מקטורן סרום decafluorobutane.
- לאחר שכל פתרון המיקרו-bblbble שנבחר בגודלו הועבר, הסירו את המחט עם המזרק אך שמרו על מחט האוורור כדי להקל על הלחץ השלילי(איור 3E).
- אם אתם מכינים רק מיקרו-יבלים שנבחרו בגודל, עצרו כאן. שמור את מחט האוורור פנימה והיד למעלה. שומרים את הקרבון בחושך ובטמפרטורה בחדר.
- הוסף כמויות קטנות של קרח יבש או איזופרופנול טמפרטורת החדר לאמבט איזופרופנול כדי להבטיח את טמפרטורת האמבטיה היא בין -15 ל -17 °C (7 °F).
- עם מחט אוורור 20 מד מוכנס ליד החלק העליון של הבקבוקון בסרום, למקם את הבקבוקון בסרום באמבט איזופרופנול, שמירה על רמת microbubble מתחת לרמה של איזופרופנול אבל צוואר הבקבוקון מעליו, לסירוגין מערבבים את הבקבוקון בסרום במשך 2 דקות כדי לדחוס את microbubbles.
הערה: שלב זה שונה מהעבודה שנעשתה על ידי שירן ואח '6- אין לסובב את מקטרת הסרום ברציפות באיזופרופנול ואל תתנו לפתרון לקפוא. מערבבים בערך 5 s, ולהרים את ביון הסרום מתוך isopropanol. בדוק אם יש גרעיני קרח, ותמשיך להסתחרר באיזופרופנול. אם יש היווצרות קרח, מערבבים את מקטורון הסרום באוויר עד שהוא מתפוגג.
- לאחר ה עיבוי של 2 דקות, להסיר את מחמת הסרום מאמבט איזופרופנול ולהסיר את מחט האוורור.
הערה: המיקרו-חלוקים היו צריכים להיות מרוכזים לטיפות, כפי שמעיד השינוי בשקיפות (איור 3E לעומת איור 3F עבור ניסוח 30% פירו-שומנים). - נגב את בנאל הסרום, תייג אותו והניח אותו על קרח רגיל במיכל כהה ומבודד עד שיהיה מוכן לשימוש. טיפות אלומיניום שלא נפתחו (אטם אלומיניום שלם) צריכות להיות יציבות במצב זה עד 6 שעות כל עוד הקרח המומס מוחלף לפי הצורך.
- כאשר מוכן לשימוש, להסיר את חותם האלומיניום עם decapper. שמור טיפות (אפילו בקבוקונים פתוחים) על קרח בחושך בזמן שלא בשימוש. יש לשמור על מיקרו-חלוקים בחושך ובטמפרטורה של החדר.
5. אפיון מורפולוגי ואופטי
- הכן 1% טריטון על ידי: הוספת 5 מ"ל של טריטון X-100 לתוך 500 מ"ל של PBS (1x, pH 7.4) ומערבבים עם מוט ערבוב מגנטי עד הומוגני14.
הערה: טריטון X-100 מאוד צמיג. אם אתם משתמשים בצינור סטנדרטי להעתקת אוויר, השתמשו בטיפול בעת הטיפול. לשאוף ולצלל את הנפח לאט ולחכות נפח שיורית להגיע לתחתית הפיפטה. ודא שהנוזל אינו נצמד לחלק החיצוני של קצה הפיפטה בעת העברת נפחים על-ידי תנועה איטית. - הכן טיפות (שלב 4). אם גם מיקרו-בועות מאופיינות, אספו נפח קטן של המיקרו-בועות שנבחרו בגודל לפני ה עיבוי (שלב 4.9).
- גודל המיקרו-חלוקים או הטיפות על מונה קולטר (CC) מ- 0.2 ל- 6 מיקרומטר כדי להשיג חלוקות וריכוזים בגודל(איור 4).
- מלא נקי 20 מ"ל cuvette עם 10 מ"ל של אלקטרוליט CC שסונן דרך מסנן קרום פוליאתרסולפון 0.2 מיקרומטר נקבוביות. מדוד אותו על CC עם שלוש ריצות כדי לקבל בסיס.
- באותו אלקטרוליט CC, להוסיף 5 μL של microbubble או טיפה מדגם ומערבבים בעדינות.
הערה: 2 עד 20 μL של מדגם ניתן להוסיף בהתאם כמה מרוכז המדגם. - הפעל את המדגם ב- CC (3 ריצות), הפחת את קו הבסיס הממוצע וחשב את התפלגות הגודל והריכוז (מספר למ"ל).
- מדדו את ספיגת הטיפות באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis(איור 5).
הערה: איור 5 מציג רק את ניסוח ה-Pyro-lipid של 30% בלבד.- בספקטרופוטומטר UV-Vis, קבע את מדידת הספיגה כ- 800 ננומטר עד 300 ננומטר אורכי גל עם תוספת קבועה של 0.5 ננומטר ואפשר תיקון בסיסי.
- בעזרת cuvette באורך נתיב נקי של ס"מ אחד מלא PBS, בצע מדידה בסיסית. ודא שהנפח גבוה מספיק כדי להצטלב בנתיב קרן הספקטרוסקופ.
- לדלל את טיפות פירו-שומנים לתוך PBS (מומלץ 2 μL כדי 500 μL של טיפות לתוך 2000 μL של דילול) ולערבב על ידי pipetting.
הערה: אל תמערבולת אחרת האסיפות יושמדו. - מעבירים את הטיפות המדוללות לקובט נקי ומודדים את הספיגה. לשנות את הדילול במידת הצורך.
- חזור על שלבים 5.4.1 עד 5.4.4 אך השתמש ב- 1% טריטון במקום PBS. לאחר דילול, מעבירים דגימה למערבולת ומערבולת אטומים/מכוסים למשך 30 לפני המדידה.
- מדדו את הפלואורסצנטיות של מיקרו-טבלים או טיפות(איור 6).
הערה: איור 6 מציג רק את ניסוח ה-Pyro-lipid של 30% בלבד.- על ספקטרופוטומטר פלואורסצנטיות, להגדיר את אורך גל העירור כמו 410 ננומטר ואת טווח גל הפליטה מ 600 עד 750 ננומטר עם תוספת של 1 ננומטר.
- למדוד את הפלואורסצנטיות של דילול PBS כדי לקבל בסיס באמצעות cuvette כי הוא תואם עם ספקטרופוטומטר פלואורסצנטיות.
- לדלל את microbubbles פירו-שומנים או טיפות לתוך PBS (מומלץ 0.5 μL כדי 10 μL של טיפות לתוך 2000 μL של דילול) ולערבב על ידי pipetting.
הערה: אל תמערבולת אחרת האסיפות יושמדו. - מעבירים את הדגימה המדוללת לקובט המנוקה, הבסיסית ומודדים את הפלואורסצנטיות. לשנות את הדילול במידת הצורך ולהימנע רוויית אותות.
- חזור על שלבים 5.5.1 עד 5.5.4 אך השתמש ב- 1% טריטון במקום ב- PBS. לאחר דילול ב 1% טריטון, להעביר את המדגם המדולל למערבולת אטום / capped במשך 30 s לפני מדידה. הוסף מספיק נפח כדי להבטיח בועות שנוצרו מערבולת הם מעל נתיב הלייזר.
הערה: אות הפלואורסצנטיות של המדגם בטריטון יהיה גבוה בהרבה מאשר ב- PBS בשל פלואורסצנטיות בלתי מתישה (איור 6).
6. הדמיית אידוי
- מלא מיכל מים בגודל המתאים במים דה-יונים ותן לו לנוח במשך 24 שעות כדי לשקם את הגזים במים עם האטמוספירה.
- מכינים טיפות ושומרים על קרח וחשוך עד לשימוש.
- הפוך צינור פנטום זרימה מ 2% אגר כפי שתואר על ידי Pellow ואח'18 להטביע את הפנטום לתוך מיכל מים מחומם ל 37 °C (50 °F).
- לחמם PBS ל 37 °C (7 °F) ולזרום דרך הפנטום.
- עם מערכת אולטרסאונד פרה קלינית ומתמר מערך ליניארי 21MHz (ראה טבלה של חומרים ), ליישר את התצוגה לפנטום הזרימה, להגדיר אותו הדמיה במצב B, להגדיר את לחצי הפלט, ולתפוס קטעי וידאו או תמונות כדי לרכוש קווי בסיס בכל לחץ.
- לדלל 20 μL של טיפה לתוך 50 מ"ל של 37 °C PBS ומערבבים בעדינות. העבר את הפתרון לתוך מזרק פלסטיק 30 מ"ל ולדחוף את הפתרון דרך פנטום אגר.
- שמירה על יישור זהה לשלב 6.5, הגבירו את לחצי הפלט עד לצפייה באידוי (כתמים בהירים בפנטום, ראו איור 7).
הערה: איור 7 מציג את דגימת טיפת השומנים של 30%. מתמר מערך ליניארי זה זמין מסחרית של 21 מגה-הרץ מסוגל הן להדמיה והן לאדות טיפות.
Representative Results
דגימות מיקרו-חלוק מרוכזות מראש שנבחרו בגודל (n = 3) ודגימות טיפה מרוכזות מראש (n = 3) גודלו על מונה קולטר (CC) עם צמצם של 10 מיקרומטר. מגבלה של צמצם 10 מיקרומטר היא שהוא לא יכול למדוד חלקיקים קטנים מ-200 ננומטר, מה שיכול להטות את הגודל והריכוז הממוצעים. איור 4 מציג את נתוני גודלם של כל אחד מהניסוחים של תוכן השומנים פירו. טבלה 1 מציגה סטטיסטיקה המבוססת על נתוני שינוי גודל. באמצעות יחס של קטרים ממוצעים לפני ולאחר עיבוי, התוצאות הראו כי ניסוח 0% פירו-שומנים היה השינוי הקטן ביותר בקוטר ממוצע ב 1.72 ± 0.02. ניסוח 50% פירו-שומנים היה הקוטר הממוצע הגדול ביותר ב 2.38 ± 0.08. המדגם טיפת פירו-שומנים 1% היה הריכוז הגבוה ביותר שנצפה ב (2.71 ± 0.13) × 1010 / מ"ל בעוד מדגם טיפת פירו-שומנים 40% היה הריכוז הנמוך ביותר שנצפה ב (7.36 ± 0.81) × 109 /mL. נתוני שינוי גודל הראו את המדגם טיפת פירו-שומנים 10% היה דימטר השיא הקטן ביותר ב 261 ± 13 ננומטר בעוד מדגם טיפת השומנים פירו 50% היה הגדול ביותר ב 390 ± 55 ננומטר. בדרך כלל, ככל שתכולת השומנים של Pyro גדלה, הריכוז ירד וקוטר הממוצע גדל. כמו דגימות לאחר מרוכז מבוססים על מדגם microbubble הקדמה, המגמה התרחשה עבור שני סוגי סוכני ניגוד אולטרסאונד. ככל שתכולת השומנים של Pyro גדלה, החלה להיווצר תת-מזון microbubble (עם גודל שיא של כ-2000 מיקרומטר). שיא משני זה לא היה נוכח במדגם 0% פירו-שומנים microbubble הבולט ביותר באוכלוסיות 40% ו 50% פירו-שומנים.
איור 5 מציג מדידות ספיגה מייצגות של דגימת טיפת השומנים 30%. שיא המדגם השלם ב-PBS היה 700 ננומטר בעוד המדגם שהופרע בטריטון הסיט את הפסגה ל-671 ננומטר. זה הראה כי הרכבות שלמות יש תכונות אופטיות שונות בהשוואה לרכיבי השומנים בודדים, לא מורכבים.
איור 6A מציג מדידות פלואורסצנטיות מייצגות של דגימת המיקרו-חלוק המרוכזת מראש ואילו איור 6B מציג דגימת טיפה לאחר עיבוי עם 30% פירו-שומנים. המדגם שלם ב- PBS היה שיא פלואורסצנטיות ב 704 ננומטר בעוד הצורה משובשת היה שיא ב 674 ננומטר. חיסור השטח המשובש מתחת לעקומה עם האזור השלם מתחת לעקומה, וחלוקת ההפרש על ידי האזור המופרע מתחת לעקומה מעניקים את יעילות מרווה, אשר עובד להיות 98.61% ו 98.07% עבור 30% דגימת microbubble פירו-שומנים ודגימת טיפה, בהתאמה.
כדי להדגים טיפות המרה microbubbles, טיפות מדוללות צולמו והתאדו בפנטום זרימה 37 °C עם מערכת אולטרסאונד. איור 7 מציג תמונות אולטרסאונד מייצגות של דגימת טיפת השומנים 30% בתמונה בלחצים שונים. בלחצים נמוכים (איור 7A),היה מעט מאוד אות, רק אות רקע מבועות אוויר תקוע מסינתזת אגר. הסיבה לכך היא טיפות אינן echogenic ולא לפזר אולטרסאונד. בעוצמה מעט גבוהה, נוצרו כמה מיקרו-יבלים (איור 7B) כפי שניתן לראות בהופעת כתמים בהירים. ככל שהלחץ גדל, נוצרו יותר מיקרו-יבלים(איור 7C ו-7D). זה גם הוכיח כי טיפות לא באופן ספונטני להתאדות ב 37 °C (50 °F).
איור 1: תמונות של השלבים ליצירת תמיסה של 30% פירו-שומנים. A) אבקת שומנים בתוספת Pyro-SPC בכלורופורם. B) פתרון המסה הוסיף. ג)סרט השומנים מיובש ומצופה על קיר פנימי של 800 קואל. D)מקטורן שומנים עטוף בנייר אלומיניום (רדיד חיצוני מודבק לשימוש חוזר). E) תמיסה שומנים מיובשים. F) פתרון שומנים בדם בפקעת סרום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2:מחליף הגז בעל 10 הסעפות. השסתומים המוזכרים בפרוטוקול מסומנים. ראה קובץ משלים "פרוטוקולים ונתונים אחרים" לקבלת הוראות כיצד להרכיב את מחליף הגז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: A) פתרונות השומנים של 7 ניסוחים (0% עד 50% Pyro-SPC) בבקבוקונים לדוגמה. איורים ב' עד ד' מראים תמונות של הצעדים שננקטו כדי ליצור טיפות פירו-שומנים 30%. B) 30% תמיסה פירו-שומנים בוויאל מדגם. ג)פוסט-עצבנות. ד) 15 דקות גודל נבחר. E) מחיצה תחתונה מועברת לנקיל decafluorobutane. ד)לאחר עיבוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4:נתוני שינוי גודל של מיקרו-קבאבל ולטיפות שנבחרו בגודל עם תוכן שונה של מעטפת השומנים פירו(n = 3). הקווים הירוקים המוצקים מייצגים מיקרו-יבלות וקווי הציאן המנוקדים מייצגים טיפות. A) 0% פירו-SPC. ב)1% פירו-SPC. ג)10% פירו-SPC. ד)20% פירו-SPC. E) 30% פירו-SPC. ו)40% פירו-SPC. ז)50% פירו-SPC. H) סך הריכוזים שנצפו של דגימות microbubble ו טיפה מן CC מבוסס על תוכן Pyro-SPC במעטפת. כל קווי השגיאה מציינים סטיית תקן. כל המדידות בוצעו באמצעות צמצם 10 מיקרומטר אשר יש טווח גודל של 200 ננומטר עד 6000 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מדידות ספיגה ספקטרוסקופיות אולטרה סגולות (UV-Vis) מייצגות בין 300 ל-800 ננומטר של דגימת טיפת ה-Pyro-lipid המרוכזת ב-PBS וב-1% טריטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: פליטת פלואורסצנטיות ייצוגית מ-600 ל-750 ננומטר נרגשת ב-410 ננומטר. A) מדגם מיקרו-חלוק פירו-שומנים שנבחר בגודלו, מרוכז מראש ב-30% ב-PBS וב-1% טריטון. B) לאחר מרוכז 30% דגימת טיפת פירו-שומנים ב- PBS וב 1% טריטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות אולטרסאונד מייצגות של פנטום זרימת אגר 37 °C שצולם עם מתמר מערך ליניארי פרה-קליני 21 MHz במצב B (ראה טבלה של חומרים). העמודה הימנית (איורים A, C, Eו- G) מציגה פקדי PBS. העמודה הימנית (איורים B, D, F, ו- H) מציגה 20 μL של לאחר מרוכז 30% דגימת טיפת פירו-שומנים מדולל לתוך 50 מ"ל של 37 °C PBS. כל שורה מייצגת לחצים שליליים שיא שדה חופשי, אשר הוערכו מהעבודה שנעשתה על ידי שירן ואח'8 המשולשים הצהובים מצביעים על עומק המוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שיטת | סוכן | פירו מעטפת % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| עותק | בועות | תנחיתה [/מ"ל] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| עותק | בועות | שיא [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| עותק | בועות | ממוצע [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| עותק | בועות | חציון [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| עותק | טיפות | תנחיתה [/מ"ל] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| עותק | טיפות | שיא [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| עותק | טיפות | ממוצע [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| עותק | טיפות | חציון [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
טבלה 1: שינוי גודל סטטיסטיקת נתונים של דגימות microbubble ו טיפה עם תוכן Pyro-SPC שונה ממונה קולטר (CC) (n = 3). כל השגיאות מצביעות על סטיית תקן.
מידע משלים - גיליון נוסחת השומנים: לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
מידע משלים - פרוטוקולים ונתונים אחרים: לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
לאחר הוספת כל רכיבי השומנים יחד (שלבים 1.2 ו-1.4.5, איור 1A), נוספה פתרון של כלורופורם ומתנול (ומים אם קיימים שומנים חומצה פוספטידית כמו DSPA) כדי להבטיח שרכיבי השומנים פירו-שומנים ולא פירו היו הומוגניים לחלוטין (שלב 1.5, איור 1B). כדי למנוע היווצרות שלפוחיות שומנים בדם עם הרכב שומנים הטרוגניים, השומנים המומסים התייבשו וציפו על פנים קיר הפיקדון כסרט דק (איור 1C). הציפוי (שלב 1.6) גם מקל על הידרציה (שלב 2.1 עד 2.4) מכיוון שהוא מגדיל את שטח הפנים של הסרט היבש. הייבוש (שלב 1.6, איור 1C)ושאיבה (שלב 1.8, איור 1D)נעשו כדי להבטיח שכלורופורם ומתנול יתאדו לחלוטין מכיוון שכימיקלים אלה יכולים לשבש את היווצרות המיקרו-נובבלים. בעוד הפרוטוקול ניתן להקטין כדי להפוך את נפחי פתרון השומנים נמוך כמו 1 מ"ל, אמצעי אחסון גדולים יותר יכולים להפחית וריאציה בקבוקון ל בקבוקון. אמנם זה עלול להסתכן של השפלת Pyro-SPC בזמן שאינו בשימוש, מצב האחסון של פתרון השומנים (שלב 2.9 עד 2.10) נועד להפחית את הסיכון. שלב הסילוק מהגז עם מחליף הגז (שלב 2.9.2, איור 1F ואיור 2) משמש למניעת חמצון רב ככל האפשר. לא מומלץ לאחסן פתרונות שומנים המכילים שומנים פורפירין בעוד גזים אטמוספריים עדיין מומסים בתמיסה (איור 1E).
בשלב 2.10, תמיסת השומנים נמצאת בחתלתול בסרום עם מרחב ראש בלחץ, בדומה לאופן שבו נמכרים מיקרוספרות השומנים של סוכן השומנים שאושר קלינית (בדומה לאיור 1F). עבודה פנימית הראתה מיקרו-חלוקים יציבים לא יכול להיווצר באמצעות תסיסה מכנית עם נוכחות של Pyro-שומנים אם המכסה היה חומר רך כמו פקק גומי. לכן, תמיסת השומנים הועברה לבקן מדגם עם כובע פנולי שאינו גומי (שלבים 4.1 עד 4.4, איור 3A ו- 3B). כאשר גז decafluorobutane הוזרם לתוך בוחן מדגם (שלבים 4.1 עד 4.4), decafluorobutane צפוף צריך לעקור את האוויר האטמוספרי במרחב הראש של מחמת הקרבון. נכון לעכשיו, לא ידוע מדוע Pyro-שומנים אינם מסוגלים ליצור microbubbles עם פקקי גומי. ללא Pyro-שומנים, microbubbles יציב יכול להיעשות ישירות בבקבוקונים בסרום עם פקקי גומי4,7. לכן, מומלץ להשתמש מחליף הגז כדי degas ולחץ מחדש על בישול הסרום ואז להסעיר את ביון הסרום עצמו עבור ניסוחים שאינם פירו-שומנים4,5,6,7 (ראה "פרוטוקולים אחרים נתונים"). היתרון של היכולת להתסיס מכנית בחתנת הסרום הוא ניתן ללחוץ על מרחב הראש ובחירת הגודל יכולה להיעשות על ידי היפוך מקטורן הסרוםהפוך 8. בפרוטוקול זה, ניסוח 0% פירו-שומנים הועבר לנקיל מדגם (שלבים 4.1 עד 4.4) כדי להיות עקבי עם ניסוחים כי הכיל Pyro-שומנים. בנוסף, אורך שרשרת השומנים אציל ארוך יותר לגרום טיפות יציבות יותר בשל אינטראקציות ואן דר Waals טוב יותר19. הרכב קליפת השומנים נבחר על סמך מה שהיה זמין מסחרית, אורך שרשרת 18-אציל לכל סוגי השומנים. DSPE-PEG5K שולבה בכל הניסוח (שלב 1.1) כמו נוכחות של שרשראות פוליאתילן גליקול מונעת התמזגות של מבנים באמצעות כוחות סטריים דוחים19. במהלך הידרציה שומנים בדם, אמבט sonicator האמבטיה נקבע 70 °C (שלב 2.1) גבוה מספיק כדי לפזר באופן מלא את 18-אכיל שרשרת שרשרת סרט שומנים18. עבור אורך שרשרת אציל ארוך יותר, טמפרטורות גבוהות יותר יידרשו.
טעינת פירו-שומנים גבוהה יותר תגביר את הריכוז של רכיבים סופגים ופלואורסצ'ים אופטיים, אשר עשויים להיות הרצויים עבור יישומים מסוימים הנהנים טעינת פורפירין מקסימלית. עם זאת, ככל שתכולת השומנים של הפירו גדלה, ריכוז הטיפות הנצפה ירד והקטרים גדלו (איור 4 ושולחן 1). זה ממחיש החלפה בין פלואורסצנטיות אופטית ומאפייני ספיגה לעומת ריכוז וקוטר טיפה. לחוקרים שחייבים לתעדף קטרים קטנים עבור הצטברות in vivo באמצעות כלי דולף קטן או אם ריכוז גבוה של טיפות צריך להיות מוזרק, הגדלת טעינת פירו-שומנים לא יכול להיות שווה את הגידול טיפה dimeter או ירידה בריכוז טיפה. אם ריכוזי טיפות גבוהים ו/או קטרי טיפות קטנים הם בעלי חשיבות עליונה, יש לקחת בחשבון סוכני אבחון לוויה בגודל דומה במקום פירו-שומנים. בעוד 1% טיפות פירו-שומנים לא לגרום לירידה בריכוז או עלייה בגודל, 1% טעינת פירו-שומנים עשוי להיות נמוך מדי כדי להיות מזוהה באופן סביר מרקע רקמה פלואורסצנטית. עם זאת, הגמישות של moiety פורפירין מספק אפשרויות מרובות לפונקציונליזציה אשר יעניק אמצעים חלופיים של כימות מתאים יותר עבור יישומים בריכוז נמוך. לדוגמה, Pyro-שומנים ניתן לכלאט עם נחושת-64 עבור הדמיית טומוגרפיה פליטת פוזיטון וספירת גמא20, או עם פלדיום לכימות עקבות מתכת באמצעות ספקטרומטריית מסה, או עם מנגן להדמיית תהודה מגנטית14.
בעוד ניסויים מסוימים עשויים רק לדרוש נפח קטן של פתרון טיפה, 1 מ"ל של פתרון השומנים יש צורך למלא את 1.85 מ"ל בוחן מדגם. גרץ ואח ' הוכיח כי שינויים בטיפול, לחץ מרחב הראש, יחס נוזל לגז, ואפילו צורת המשחקון יכול להשפיע על אוכלוסיות microbubble17. טמפרטורת הוויאליה במהלך עצבנות ובחירת גודל יכולה להשפיע גם על התפלגות הגודל. לכן, עבור השיטות הממוטבות על ידי משתמש הקצה, חשוב להיות עקבי ככל האפשר בעת ביצוע טיפות. טיפות שלא נפתחו עשויות להיות קפואות (-20 °C (20 °F) ולהפשיר מאוחר יותר לשימוש עתידי, אך הדבר ישפיע על אוכלוסיות הגודל.
הליך התסיסה המפעיל תמיסת שומנים למיקרו-חלוקים אינו מייצר אוכלוסייה הומוגנית מורפולוגית (שלב 4.6); במקום זאת, המדגם מלא microbubbles, שלשולים multilamellar, ליפוזומים, ומיצלים18,21,22. בעוד גדלי microbubble משתרעים על פני טווח מיקרון וננומטר, המבנים האחרים הם בעיקר מתחת 800 ננומטר 23. טכניקות גודל שנעשה בהן שימוש אינן מבדילות בין מבנים שונים אלה, ולכן יש להניח את דגימות המיקרו-חלוק לאחר ההסתה (שלב 4.6, איור 3C)לבין דגימות הטיפות המרוכזות לאחר (שלב 4.14, איור 3F) כתערובות. מכלולים ללא רגישות אולטרסאונד (שלפוחיות multilamellar, ליפוזומים, ומיצלים) סביר להניח נשמר לאחר עיבוי ולא ישתנה גודל כפי שאין להם ליבות פאזה לשנות. מכיוון שדלפק קולטר אינו יכול להבחין בין מכלולים על-קוליים שונים אלה, יש לפרש את השינוי בגודל האוכלוסייה לאחר עיבוי בהנחה שחלק מהמבנים הננומטריים אינם ניתנים לערעור ותורמים לאוכלוסייה הנצפית באזור גודל זה. בנוסף, מבנים אלה תורמים חתימות ספקטרוסקופיות פלואורסצנטיות של דגימות אלה14. חתימות הפלואורסצנטיות והספיגה של מיצלים, ליפוזום/שלל והטיפות דומות כולן, כולל מידת הפלואורסצנטיות שלהן מרווה14. לכן, חשוב לקחת בחשבון שיש תערובת של מכלולים באיורים 3C עד 3F, איור 4, המדגם המדולל PBS באיור 5, ואת המדגם המדולל PBS באיור 6.
לאחר בחירת גודל ולפני עיבוי (שלב 4.9), ניתן לחסל את מכלולי שאינם בועה על ידי צנטריפוגה מדגם microbubble כדי להפריד את בועות הציפה מן מכלולים שאינם ציפה כפי שתואר על ידי Feshitan ואח'21 מידת ההפרדה יכולה להיות נשלטת על ידי התאמת כוח הספין ומשך. עם זאת, ניסויים של עיבוי microbubble של דגימות מבודדות בגודל כזה גילו כי באמצעות אוכלוסיות microbubble הקדמה גדול יותר שנבחרו באמצעות נהלי בידוד גודל הניב טיפות גדולות יותר (ראה "פרוטוקולים אחרים ונתונים" שלב S5 עבור בועה לאחר הסתובב וגודל טיפה). מאז יישום מיועד של טיפות המיוצר עם פרוטוקול זה היא פלטפורמה עבור פזרנות פסיבית הצטברות בשל גודלם הקטן לעומת microbubbles4,8, אוכלוסיות טיפות כי הם קטנים ככל האפשר היו הרצויים. לכן, פרוטוקול זה השתמש בדגימות מיקרו-חלוק לאחר התסיסה שלא היו מבודדות בגודל באמצעות צנטריפוגה, גם אם זה אומר מיקרופולים, ליפוזומים ושלפוחיות שאינם רגישים לאולטרסאונד היו נוכחים בתמיסה הסופית. זה מרמז על כך שהליכי כימות להפצה ביולוגית יפיקו איתות לכל המבנים המוזרקים ואינם מוגבלים רק טיפות. עם זאת, מאז מבנים בגודל דומה אלה ככל הנראה לצבור באמצעות מנגנון פסיבי כי הוא מוכתב בעיקר על ידי גודל, אין חשד כי זה צריך לשנות את המסקנות העיקריות שניתן לעשות אם פלטפורמה זו יש להשתמש vivo, אם כי כל היבטים אלה צריך להיחשב בנפרד בהתאם להקשר שבו הפלטפורמה עשויה לשמש. בדיקות באמצעות זרועות ניסיוניות עם ובלי אולטרסאונד ניתן לבצע כדי להבטיח כי זה טיפות רגישות אולטרסאונד האחראים על כל שינוי ביו-הפצה, כמו רק מכלולי הליבה perfluorocarbon בפתרון יגיב אולטרסאונד.
לאחר התסיסה, הונח המבחן במשך 15 דקות ומחיצה נצפתה בוויאליה(איור 3C לעומת 3D). גודל-בחירה באמצעות ציפה היא שיטה פשוטה של ביטול המבנים / בועות גדולים יותר מפתרון microbubble מופעל8,17. במקרה זה, חלקיקים עם קטרים הגדולים מ-5 מיקרומטר הוסרו ברובם לאחר בחירת הגודל(איור 4). ניתן לכוונן את מידת בחירת הגודל על-ידי שליטה במשך הבחירה בגודל17. שירן ואח ' הראו כי אי בחירת גודל יכולה לגרום למיקרו-חלוקים שנוצרו שחוסמים כלי ים8.
Perfluorocarbons יש את היתרון של להיות אינרטי ביולוגית7. בעוד שנקודת הרתיחה של decafluorobutane היא -1.7 מעלות צלזיוס, מעל טמפרטורת הגוף, הטיפות אינן מתאדות באופן מיידי כאשר נחשפות ל -37 מעלות צלזיוס(איור 7B). כמו טיפות הם meta-יציב ב 37 °C (50 °F), אנרגיה אקוסטית נוספת יש צורך לאדות את הטיפות כדי microbubbles7,9. פופרוסקי ואח ' הדגימו טיפות פורפירין מרוכזות באמצעות לחץ22. זוהי שיטה בת קיימא ואפילו חיונית בעת שימוש perfluorocarbons צפוף פחות אבל לחצים גבוהים עלול להרוס כמה בועות בתהליך. אוקטפלואורופרופן (C3F8) יש נקודת רתיחה של -36 °C ,7 °C, כך הן קירור ולחץ נדרשים עיבוי טיפה. עם זאת, perfluorocarbon קל יותר מוביל טיפות פחות יציב. Dodecafluoropentane (C5F12) יכול להוביל טיפות יציבות יותר עם נקודת רתיחה של 28 °C (5 F). עם זאת, זהו נוזל בטמפרטורת החדר ויהיה צורך אנרגיות אקוסטיות חזקות יותר כדי לאדות. לכן, הבחירה של הגז המכיל של סוכן ניגוד אולטרסאונד צריך לשקול את התנאים של היישום הביולוגי המיועד שלה בנוסף הפרמטרים של הייצור שלה. בפרוטוקול זה, אמבט איזופרופנול לתחוב הוגדר ל- -15 עד -17 °C (שלב 4.7.1 ושלב 4.13) בעוד פרוטוקולים אחרים המשמשים -10 °C 5,6. אפילו עם ליבת decafluorobutane משותף, טמפרטורת העיבוי עשויה להשתנות בהתאם להרכב מרגש, ריכוז השומנים הכולל, הרכב קליפת השומנים. אם משתמשים בניסוחים אחרים, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה כדי להבטיח עיבוי טיפה תקין מבלי לגרום לפתרון להקפיא.
כמו טיפות הם קטנים ויציבים יותר מאשר מבשר microbubble שלהם7, הם יכולים לנצל טוב יותר של מנגנוני הצטברות פסיבית כדי extravasate לתוך רקמות מסוימות של עניין, כגון חדור משופרת ואת אפקט השמירה של סוגים מסוימים של גידול4,24. עם שיטות פלואורסצנטיות, סופגות אופטית ואקוסטיות של זיהוי14, ניתן להשתמש ניסוח יחיד כדי לכמת את ספיגה. בנוסף, פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי לחקור אם אידוי אקוסטי של טיפות יכול לשפר את שבר הסוכן נמסר מעבר לרמות פסיביות16. כדי לכמת את ההפצה הביולוגית של הסוכן ברקמות ובאיברים מעניינים לאחר ההזרקה, יש להזריק כמות ידועה של טיפות פירו-שומנים לחיה, אולטרסאונד עשוי או לא יכול להיות מיושם בהתאם ערכת הבקרה, החיה צריכה להיות מוקרבת נקודת זמן שצוינה מראש, ואת האיברים יש להסיר ולשקול. האיברים צריכים להיות הומוגניים, מסוננים, מדוללים בחומר פעילי שטח (דטרגנט) כדי לבטל את הרקמה, וכימות עם פלואורסצנטיות או ספקטרוסקופיה UV-Vis כדי להשיג אחוזי מינון מוזרקים לכל מסת איבר בהתבסס על אותות Pyro. עבור שלב 5.4.5 (איור 5) ושלב 5.5.5 (איור 6),טריטון X-100 חומר פעילי שטח (חומר ניקוי) שימש לשיבוש הדגימות מכיוון שהוא אינו פלואורסצנטי ב- 410 ננומטר ואורכי הגל הספיגה שלו אינם חופפים לזה של פירו.
מיקרו-חלוקים לא התאפיינו בספיגת UV-Vis. מכיוון שמקור הלייזר של ספקטרוסקופ UV-Vis מקביל לגלאי, כל בועות גדולות יכולות לפזר אור הרחק מהגלאי, ולגרום להן להיראות סופגות יותר מבחינה אופטית14. שלא כמו ספקטרופוטומטר UV-Vis, גלאי ספקטרופוטומטר הפלואורסצנטיות הוא / צריך להיות מאונך למקור הלייזר כדי למנוע מהמקור להפריע לגלאי. UV-Vis שימש לכימות הספיגה של דגימות טיפות שלמות ומשבשות (שלב 5.4, איור 5). 300 עד 800 ננומטר נבחרו כארכי גל הספיגה כשתי רצועות הספיגה העיקריות של פירו-ליפיד, להקת סורט (340 עד 500 ננומטר) ו- Q-band (640 עד 730 ננומטר), נופלות בטווח זה14. כאשר מרכיבים אותה לטיפה (או למבנים על-קולריים אחרים), פסגת ה-Q-band של פירו-ליפיד מועברת באדום מ-671 ננומטר ל-700 ננומטר(איור 5). כאשר מבנה על-זמני זה משובש על ידי פעילי שטח כמו טריטון, הפסגה נעה חזרה ל-671 ננומטר14,15. בהתבסס על שינוי זה, ניתן לדעת אם הפיראו-שומנים נמצאים במצב מורכב או במצב משובש. ניתן להשתמש ביחס בין שתי הפסגות כדי להעריך את ריקבון האסיפות לאורך זמן.
עבור מדידות הפלואורסצנטיות (שלב 5.5, איור 6), נבחר אורך גל של 410 ננומטר מכיוון שהוא מתאים לשיא להקת סורט עבור פירו-שומנים לא מאורכבים14. טווח גל פליטה בין 600 ל 800 ננומטר נבחר כמו פסגות של מכלולים שלמים PBS ושיבש פירו-שומנים בטריטון כלולים בטווח זה. השינוי והעלייה בפלואורסצנטיות(איור 6)בין הדגימות של שלמות (704 ננומטר ב-PBS) לבין דגימות משובשות (674 ננומטר בטריטון) התרחשו עקב מרווה שנגרם על-ידי מבנה. בצורה המורכבת, מולקולות השומנים פירו היו ארוזים קרוב זה לזה כך פוטונים שנוצרו נספגו על ידי מולקולות פירו-שומנים סמוכים. זה ניכר ביעילות מרווה ללא פגע לעומת משובשת. לכן, יש צורך לדלל דגימות פעילי שטח (דטרגנט) כמו 1% טריטון X-100 כדי להקל על מרווה ולמקסם אותות לכימות ביו-הפצה14.
לפשטות, אותו מתמר אולטרסאונד מערך ליניארי שימש הן לאידוי והן לתמונה (שלבים 6.5 ו- 6.7, איור 7). מתמר אולטרסאונד זה (שולחן החומרים) היה מסוגל להגיע ללחצים השליליים שיא הדרושים כדי לאדות טיפות8. מילוי מיכל במים מתויגים מהברז מייצר גזים שמתמוססים במים (שלב 6.1). כדי למזער את ההפרעות מהגזים המומסים במים עם אידוי והדמיה, המים נחו במשך 24 שעות במיכל כדי לאפשר לגזים במים להתפרק עם האטמוספירה (שלב 6.1). לחלופין, ניתן לנטרל את המים המהותיים במיכל בגודל מספיק, אטום המחובר לוואקום חזק מספיק. תמונות האולטרסאונד הדגימו שהמיקרו-חלוקים התעבו בהצלחה מכיוון שהטיפות לא היו ניתנות להשמדה/לא מהדהדות בלחצים נמוכים(איור 7B). רק בלחצי תפוקה גבוהים יותר התאדו הטיפות למיקרו-חלוקים נצפים והדוגניים(איור 7D,7F, 7H). בעוד מדגם טיפה לאחר מרוכז מכיל micelles ו liposomes / שלל, מכלולים אלה אינם echogenic ורק טיפות יכול להתאדות לתוך microbubbles echogenic. פקד PBS זורם דרך הפנטום כדי ליצור תמונותבסיסיות (איורים 7A, 7C, 7E, 7G). ככל שהלחץ גבר ב-PBS, לא נוצר ניגוד. זה הצביע על כך שהלחצים הגבוהים מהמתמר לא יכלו לייצר cavitation ספונטני במדיום על בסיס מים בלבד, ולכן כל ניגודיות שנוצרה אחרת ניתן לייחס סוכן ניגוד אולטרסאונד המועסק. אם לחץ הפלט גבוה מדי, ניתן להשמיד מיקרו-יבלים שנוצרו. על ידי הגדלת הלחץ בהדרגה והתבוננות בניגוד שנוצר, הלחץ האופטימלי ניתן למצוא8. מחצית החיים במחזור של הטיפות ניתן לקבוע באופן דומה על ידי אידוי הטיפות הם מרווחי זמן מסוימים התבוננות הניגוד שנוצר לאורך זמן7.
לסיכום, טיפות שינוי פאזה מרובות מודאלי עם תוכן Pyro-שומנים שונים נוצרו עם שיטת ה עיבוי. גודל הראה כי היה החלפה בין טעינת פירו-שומנים וריכוז microbubble / טיפה. אפיונים הראו כי היו הבדלים בצורות שלמות ושיבשו הן בספיגה והן בפלואורסצנטיות. הדמיית אולטרסאונד הראתה טיפות היו לא echogenic ב 37 °C והיו vaporizable לתוך microbubbles echogenic בלחצים מספיקים. אפיונים הראו גם את הפוטנציאל של טיפות פירו-שומנים להחליף סוכני אבחון נלווים עבור טיפה ביו הפצה או בדיקות הצטברות. עבודה עתידית תחקור את סף האידוי בפתרון, את היציבות בתמיסה ואת משכי זרימת הדם של vivo בעכברים עירומים.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד"ר ברנדון הלפילד על שעזר לבנות את מחליף הגז ואת ד"ר מיפי הוק יאן צ'אנג לדיונים טכניים. המחברים רוצים להודות למקורות המימון הבאים: מלגת בוגרים באונטריו, המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מכון המחקר טרי פוקס וקרן הסרטן של הנסיכה מרגרט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
