Summary
В настоящем протоколе изложены способы синтеза и характеристики мультимодальных капель порфирина с фазовым переходом.
Abstract
Капли фазового изменения представляют собой класс ультразвуковых контрастных веществ, которые могут превращаться в эхогенные микропузырьки in situ с применением достаточной акустической энергии. Капли меньше и стабильнее, чем их микросубблы. Однако традиционные ультразвуковые контрастные вещества не отслеживаются за пределами измерений акустической обратной связи, что затрудняет количественное определение биораспределения или накопления контрастных веществ ex vivo. Исследователям, возможно, придется полагаться на флуоресцентные или оптически абсорбирующие сопутствующие диагностические частицы, чтобы сделать вывод о биораспределении. Целью данного протокола является детализация этапов создания мультимодальных капель порфирина с фазовым переходом с использованием метода конденсации. Порфирины представляют собой флуоресцентные молекулы с отчетливыми полосами поглощения, которые могут быть конъюгированы с липидами и включены в капли для расширения универсальности капель, обеспечивая более надежное биораспределения при сохранении акустических свойств. Семь составов с различным содержанием порфирин-липидов и базовых липидов были изготовлены для исследования распределения микросубблок и капель по размерам. Характеристики, подходящие для порфиринсодержащих структур, также описаны в протоколе, чтобы продемонстрировать их аналитическую универсальность в растворе. Размер показал, что средние диаметры после конденсации были в 1,72-2,38 раза меньше, чем популяции прекурсоров. Характеристика поглощения показала, что неповрежденные сборки имели пик Q-диапазона 700 нм, в то время как разрушенные образцы имели пик поглощения на уровне 671 нм. Флуоресцентная характеристика показала, что неповрежденные 30% порфирин-липидных сборок были флуоресцентно закалены (>97%), при этом восстановление флуоресценции достигалось при разрушении. Акустическая испарение показало, что капли порфирина не имеют эхогенных при более низких давлениях и могут быть преобразованы в эхогенные микропузырьки с достаточным давлением. Эти характеристики показывают потенциал капель порфирина для устранения необходимости в сопутствующих диагностических стратегиях на основе абсорбции или флуоресценции для количественной оценки биораспределения ультразвукового контрастного агента для доставки или терапевтического применения in vivo или ex vivo.
Introduction
Ультразвуковая визуализация является неинвазивной, неионизирующей формой медицинской визуализации, которая использует акустические волны. В то время как ультразвуковые сканеры более портативны и могут предоставлять изображения в режиме реального времени, ультразвуковая визуализация может страдать от низкой контрастности, что затрудняет для сонографистов надежное различение аналогично эхогенных патологических особенностей. Чтобы противодействовать этому ограничению, микропузырьки могут быть введены хозяину для улучшения сосудистого контраста. Микропузырьки представляют собой заполненные газом контрастные вещества микронных размеров, которые очень эхогенны для акустических волн и могут обеспечивать повышенную контрастность сосудов1,2. Оболочки и газовые ядра микропузырьков могут быть адаптированы для различных применений, таких как визуализация, тромболизис, пермеабилизация клеточной мембраны или переходное сосудистое отверстие2.
Недостатком микропузырьков является их короткий период полураспада циркуляции. Например, клинически доступные перфлутреновые липидные микросферы имеют период полураспада только 1,3минуты 3. Для длительных сеансов визуализации необходимы множественные инъекции микропузырьков. Еще одним недостатком микропузырьков является их большой диаметр. В то время как перфлутреновые липидные микросферы имеют диаметр от 1 до 3 мкм, достаточно маленькие, чтобы циркулировать в сосудистой ткани, они слишком велики, чтобы экстравазироваться и пассивно накапливаться в тканях, представляющих интерес, таких как опухоли4. Одна из стратегий преодоления этих ограничений заключается в конденсации газовых микропузырьков в более мелкие капли с жидким ядром5,6. Хотя капли не являются эхогенными в своем жидком состоянии, они могут испаряться в микропузырьки при воздействии ультразвука с достаточно высоким пиковым отрицательным давлением, восстанавливая их способность обеспечивать контраст. Это позволяет капельке воспользоваться преимуществами более благоприятной фармакокинетики небольшого жидкого ядра, сохраняя при этом способность обеспечивать контраст при инсонировании и без изменения химического состава4,7.
Декафторбутан является идеальным перфторуглеродным соединением для фазового сдвига между газообразным и жидким состояниями5,6,7. Декафторбутан позволяет конденсировать микропузырьки в капли только с понижением температуры, тогда как менее плотные перфторуглероды требуют дополнительного герметизации5. Этот щадящий метод минимизирует разрушение пузырьков при конденсации7,8,9. Поскольку их ядра жидкие, капли не эхогенны и невидимы для ультразвука. Однако при применении достаточной акустической или тепловой энергии жидкие ядра могут испаряться обратно в газообразное состояние, генерируя эхогенные микропузырьки8. Это испарение позволяет контролировать, когда и где генерировать микропузырьки.
В то время как капли полезны для пассивного накопления, испарения in situ или улучшения проницаемости клеток4,капли (и их фрагменты) не могут быть визуализированы или количественно определены ex vivo. Поэтому поддающиеся количественной оценке сопутствующие диагностические агенты, такие как флуоресцентный4,10,11,магнитные частицы12,оптически абсорбирующие агенты13,используются в качестве аналога для измерения доставки капель в интересующие ткани. Например, Helfield et al. использовали коинъекцию флуоресцентных наношарик для количественной оценки гистологического изображения органов мыши, поскольку капли не могли быть обнаружены флуоресцентно4. Недостатком сопутствующих диагностических средств является то, что отслеживаемый компонент может действовать независимо от капли в зависимости от ее индивидуального фармакокинетического профиля.
К счастью, оболочку из микропузырьков и капель можно настроить. Например, Huynh et al. продемонстрировали ультразвуковые контрастные вещества с порфирин-липидными оболочками, создающими мультимодальные микропузырьки14. Порфирины представляют собой класс органических соединений с ароматической макроциловой структурой14,15. Они являются оптически абсорбирующими, флуоресцентными и могут быть хелатированы к широкому спектру металлов для лучевой терапии, визуализации на основе радионуклидов или количественной оценки на основе следовых металлов14. Одним из примеров порфирина является пирофеофорбид (Pyro). Конъюгируя Pyro с липидами, включение pyro-lipids в микропузырьки или капли позволяет их визуалировать и отслеживать с помощью нескольких модальностей: акустически, флуоресцентно и через поглощение14. Этот мультимодальный контрастный агент может быть использован для отслеживания и количественной оценки накопления. Это может устранить необходимость в сопутствующих диагностических агентах, поскольку поддающийся количественной оценке компонент теперь сопряжен с оболочкой, что позволяет более точно определять доставку16.
Здесь изложен протокол создания мультимодальных капель порфирина с фазовым переходом. Поскольку ультразвуковые контрасты агентов могут быть использованы в качестве платформы для доставки лекарств к тканям, представляющим интерес, таким как опухоли2,4,расширение их обнаруживаемости за пределы ультразвука может оказаться полезным для количественной оценки эффективности доставки. Целью этих капель является обеспечение отслеживаемых ультразвуковых контрастных веществ, способных к пассивному накоплению in vivo, испарению in situ и акустике, а также с потенциалом для количественной оценки биораспределения или накопления из органов ex vivo без опоры на вторичные датчики. Методы характеризации также изложены для демонстрации потенциала капель порфирина в качестве датчиков биораспределения. Также обсуждаются эффекты пиролипидной нагрузки в оболочку (от 0% до 50% по молярному соотношению).
Protocol
1. Обезвоженные липидные пленки
- Рассчитайте массы каждого из необходимых компонентов оболочки (см. Дополнительный файл "Лист липидных формул").
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола состав оболочки будет состоять из: 10 молярных % 1,2-дистеароил-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-5000] аммониевой соли (DSPE-PEG5K), x молярного % пирофеофорбида, конъюгированного 1-стеароил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолина (Pyro-SPC) и (90 - х)моляра % 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC). Количество Pyro-SPC будет варьироваться в 7 составах раковин(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Проверьте молекулярную массу DSPE-PEG5K на бульонной бутылке.- Масштабируйте протокол до любого липидного объема с минимальным объемом 1 мл. Для этого протокола для всех составов использовался общий липидный объем 10 мл с общей концентрацией липидов 1 мг на мл. Вспомогательный раствор будет состоять из: 10% пропиленгликоля, 10% глицерина и 80% фосфатного буферного физиологического раствора (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (см. Этап 2.3 и «Лист липидной формулы»).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол синтеза пиролипидов изложен в Дополнительном файле "Другие протоколы и данные" Этапы S1-S1.19, который был изменен по сравнению с работой, проделанной Zheng et al.15.
- Масштабируйте протокол до любого липидного объема с минимальным объемом 1 мл. Для этого протокола для всех составов использовался общий липидный объем 10 мл с общей концентрацией липидов 1 мг на мл. Вспомогательный раствор будет состоять из: 10% пропиленгликоля, 10% глицерина и 80% фосфатного буферного физиологического раствора (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (см. Этап 2.3 и «Лист липидной формулы»).
- Исходя из рассчитанных масс (см. Шаг 1.1 и «Лист липидной формулы»), взвесьте каждый из непиро-липидов и переложите в достаточно большой боросиликатный стеклянный флакон с завинчиваемым колпачком.
- Закройте флакон, пометьте крышку и флакон, а дно и стенки липидного флакона покрыть алюминиевой фольгой. Этот флакон будет называться «Липидный флакон» для остальной части протокола. Храните липидный флакон в прохладном, сухом, темном месте.
- Если препарат содержит Pyro-SPC, растворите 10 мг сухой пленки Pyro-SPC (см. раздел «Другие протоколы и данные») в 1 мл хлороформа. Вихрь в течение 5 с, измерьте поглощение и рассчитайте соответствующий объем для добавления в липидный флакон.
ВНИМАНИЕ:Хлороформ представляет опасность для здоровья, раздражает и токсичен. Носите защитное лабораторное пальто, защиту глаз, перчатки и избегайте дыхательных паров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку Pyro-SPC является светочувствительным, уменьшите освещение в рабочей зоне, если это возможно при работе с Pyro-SPC. Держите Pyro-SPC герметичным и закрытым, когда он не используется.- На ультрафиолетово-видимом спектрофотометре установите его для измерения поглощения от диапазона длин волн от 800 нм до 300 нм с шагом 0,5 нм и измерьте базовую линию с 2000 мкл чистого метанола в совместимой кювете длиной 1 см.
ВНИМАНИЕ:Метанол представляет опасность для здоровья, раздражает, токсичен и легковоспламеняется. Носите защитное лабораторное пальто, защиту глаз, перчатки и избегайте дыхательных паров. Хранить вдали от искр и тепла. - Добавьте 2 мкл Pyro-SPC в хлороформе в 2000 мкл метанола и вихрь в течение 30 с. Переложите его в чистую, совместимую кювету 1 см и измерьте впитываемость. Отрегулируйте этот коэффициент разбавления, если пик поглощения достигает 667 нм из диапазона поглощения ультрафиолетового спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе хлороформа или метанола используйте чистый стеклянный шприц или пипетку с положительным смещением, а не механическую пипетку для повышения точности. - Повторите шаг 1.4.2 еще два раза, чтобы получить тройные значения поглощения.
- Усредняйте пиковые значения поглощения при 667 нм и используйте следующее уравнение для расчета объема Pyro-SPC в хлороформе, необходимого для липидного флакона14,15:
где V - объем Pyro-SPC в необходимом хлороформе, m - требуемая масса Pyro-SPC (см. Шаг 1.1 и "Лист липидной формулы"), M - молекулярная масса Pyro-SPC при 1040,317 г·моль-1, A - усредненное поглощение при 667 нм, d - коэффициент разрежения, основанный на метаноле и Pyro-SPC в объемах хлороформа (этап 1.4.2), L - длина пути кюветы в 1 см, а ε - 667 нм коэффициент затухания пиро-SPC при 45000 l·mol-1·см-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Знаменателем уравнения является закон Бира-Ламберта, который связывает концентрацию анализируемого вещества в растворе с измеренным оптическим поглощением на расстоянии. - Добавьте рассчитанный объем Pyro-SPC в хлороформе с предыдущего этапа в липидный флакон с помощью чистого стеклянного шприца(рисунок 1A),а затем крышкой и крышкой флакона.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан только 30% пиролипидный состав. - Если в хлороформе остался какой-либо Pyro-SPC: в вытяжном капюшоне откупорите флакон Pyro-SPC + хлороформ с этапа 1.4, частично наклоните флакон в его сторону и непрерывно течь газообразным азотом как можно более осторожно в флакон Pyro-SPC/хлороформа. Поверните флакон, чтобы высушить хлороформ с помощью потока газообразного азота и равномерно покрыть Pyro-SPC на внутреннюю стенку флакона по мере его высыхания. Убедитесь, что брызги не брызг не производятся, и ни один раствор не выпадает.
- Как только липидная пленка Pyro-SPC окажется сухой и покрытой на стенке флакона, отключите поток газообразного азота. Заткните флакон, запечатайте шейку флакона восковой пленкой и храните флакон при -20 °C и в темноте.
- На ультрафиолетово-видимом спектрофотометре установите его для измерения поглощения от диапазона длин волн от 800 нм до 300 нм с шагом 0,5 нм и измерьте базовую линию с 2000 мкл чистого метанола в совместимой кювете длиной 1 см.
- Готовят раствор 90% хлороформа и 10% метанола (% v/v) и добавляют 5 мл его во флакон с липидами. Замапойный флакон с липидами и аккуратно закрутите его, чтобы гомогенизировать содержимое(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если препарат содержит липиды фосфатидной кислоты (такие как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатная натриевая соль (DSPA)), добавьте: 60% хлороформ, 32% метанола и 8% двойной деионизированной воды (% v/v/v) в липидный флакон. Для полного растворения липидного содержимого может потребоваться более интенсивное закручивание. - В вытяжном капюшоне отсоедините липидный флакон, частично наклоните липидный флакон в сторону и непрерывно потейте газообразный азот как можно более мягко в липидный флакон. Поверните липидный флакон, чтобы высушить раствор, используя поток газообразного азота, и равномерно положите липидную пленку на внутреннюю стенку липидного флакона по мере его высыхания. Убедитесь, что брызги не брызг не производятся, и ни один раствор не выпадает.
- Как только липиды окажутся сухими и покрытыми на внутренних стенках липидного флакона(рисунок 1С),отключите поток газообразного азота, накройте дно и стенку липидного флакона алюминиевой фольгой, а верхнее отверстие закройте алюминиевой фольгой, проткнутой несколькими отверстиями иглой для вентиляции(рисунок 1D).
- Наклейте этикетку и поместите покрытый липидный флакон внутрь вакуумного осушителя и дайте липидам высохнуть в течение не менее 24 ч, но не более 72 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть возобновлен позже, через 24-72 ч.
2. Увлажнение липидов
- Наполните ванну ультразвуком водой и нагрейте ее до 70 °C. Включите ультразвук, чтобы помочь смешать воду.
ВНИМАНИЕ:Вода и ультразвук находятся при высоких температурах. Избегайте прикосновения к воде и ультразвуковику. Носите защиту глаз, защитное лабораторное пальто и защитные перчатки. - Как только ультразвуковой аппарат для ванны достигнет 70 °C, извлеките липидный флакон из вакуумного адсорбатора. По возможности уменьшите освещение в рабочей зоне.
- Приготовьте раствор эксципиента из 10% пропиленгликоля, 10% глицерина, 80% PBS (% v/v/v) и добавьте 10 мл его в липидный флакон (см. Этап 1.1.1 и «Лист липидной формулы»).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стандартной пипетки с воздушным вытеснением соблюдайте осторожность при обращении с вязкими растворителями, такими как пропиленгликоль и глицерин. Аспирировать и медленно погружать объем и ждать, пока остаточный объем достигнет нижней части кончика пипетки. Убедитесь, что жидкость не цепляется за внешнюю сторону наконечника пипетки при передаче объемов, медленно перемещаясь. - Закройте крышкой липидный флакон, снимите алюминиевую крышку и осторожно закрутите флакон в ультразвуковом аппарате ванны в течение 15 минут, пока идет обработка ультразвуком, чтобы растворить липиды. Убедитесь, что шея липидного флакона находится над водой. Иногда проверяйте, надежно ли закрыта крышка флакона.
- Время от времени извлекайте липидный флакон с водяной бани. Кратко поддержите его к свету, чтобы проверить, полностью ли раствореносодержимое (рисунок 1E).
- Если содержимое липидного флакона не гомогенизируется, удалите флакон с липидами из звукового аппаратчика ванны. Закрепите колпачок, закрутите более агрессивно и верните его в ванну синикатора.
- Извлеките липидный флакон из звукового износа ванны и выключите сиконатор для ванны. Высушите флакон снаружи с бумажными полотенцами и перемаркируйте липидный флакон.
- Накройте липидный флакон алюминиевой фольгой и охладите липидный флакон при комнатной температуре в прохладном, темном, сухом месте в течение 10 минут.
- Содержимое липидного флакона: около 2 мл раствора липидов в 3 мл боросиликатного стекла прозрачных сывороточных флаконов (диаметр внутреннего рта 7 мм, наружный диаметр рта 13 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы могут использовать 1,5 мл раствора липидов во флаконе 7 мл3мл. - Облицовка сывороточных флаконов серыми хлорбутилкаучуковыми пробками типа лиофилизации (внутренний диаметр рта 7 мм, наружный диаметр рта 13 мм) и закрепите резиновую пробку отрывными алюминиевыми уплотнениями (наружный диаметр рта 13 мм) и обжимной(рисунок 1F).
- Вакуум, дегаз и повторное давление липидного раствора в каждом из сывороточных флаконов4,5,7 (фиг.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к «Другим протоколам и данным» для получения инструкций о том, как собрать газообменник и более подробную информацию.- Закройте каждый клапан между клапаном давления А и клапаном газового баллона включите их(рисунок 2). Подключите флаконы сыворотки к иглам коллектора, затем откройте соответствующие клапаны коллектора, затем откройте вакуумный клапан A и вакуумный клапан B и вакуумный клапан B и вакуум при -90 кПа (-13 фунтов на кв. дюйм, -900 мбар) в течение 5 минут для удаления атмосферного воздуха. НЕ выпыливайте жидкость (см. шаги S3-S3-S3.1.5 в разделе "Другие протоколы и данные").
ВНИМАНИЕ:Вакуумный насос может лопнуть при неправильном обращении. Не используйте вакуумный насос с органическими, кислотными или основными химическими веществами. - Когда вакуум все еще включен, держите флакон с сывороткой (чтобы он не раскачивался) и быстро постукивайте по нему ручкой или маркером для дегаза. Продолжайте постукивать до тех пор, пока не образуются пузырьки и пузырьки во флаконе. НЕ позволяйте жидкости пылесосить. При необходимости приостановите касание. Повторить для всех подключенных флаконов сыворотки. После дегазирования всех флаконов для сыворотки закройте вакуумный клапан A и вакуумный клапан B и выключите вакуумный насос (см. шаги S3.2-S3.2.3 в разделе «Другие протоколы и данные»).
- Когда флакон сыворотки все еще подключен к игле и вакуумный насос выключен, медленно поверните клапан газового баллона с 1/16 до 1/8 (примерно от 22,5 до 45 ° полного оборота) против часовой стрелки, чтобы частично открыть, затем откройте клапан T-Handle и МЕДЛЕННО поверните клапан регулятора воздуха по часовой стрелке до 3 фунтов на кв. дюйм (20,7 кПа). Затем откройте клапан давления A и клапан давления B (см. "Другие протоколы и данные" Этапы S3.3-S3.3.21).
ВНИМАНИЕ:Газовый баллон с декафторбутаном находится под давлением и может взорваться при нагревании. Держитесь подальше от жары и удара. Газ декафторбутан может вызвать вытеснение кислорода и удушье. Носите надлежащую защиту глаз и ручку в вытяжном капюшоне. При неправильном обращении газовый баллон можно пропылесосить, что может привести к быстрому снижению и имплозии. Открытие клапана газового баллона более чем на 1/8 оборота может повредить регулятор воздуха. - После 30 с наддувочного давления (датчик должен по-прежнему читать 3 фунтов на кв. дюйм (20,7 кПа)), закройте все клапаны коллектора с помощью флаконов для сыворотки, отсоедините флаконы для сыворотки, оболочку иглы и ЗАКРОЙТЕ клапан газового баллона.
- Снимите накопленное давление, частично открыв один клапан коллектора до тех пор, пока калибровочная игла регулятора воздуха не перейдет в положение покоя. Затем закройте все, что связано с клапанами коллектора и Т-рукояткой.
- Закройте каждый клапан между клапаном давления А и клапаном газового баллона включите их(рисунок 2). Подключите флаконы сыворотки к иглам коллектора, затем откройте соответствующие клапаны коллектора, затем откройте вакуумный клапан A и вакуумный клапан B и вакуумный клапан B и вакуум при -90 кПа (-13 фунтов на кв. дюйм, -900 мбар) в течение 5 минут для удаления атмосферного воздуха. НЕ выпыливайте жидкость (см. шаги S3-S3-S3.1.5 в разделе "Другие протоколы и данные").
- Флаконы с сывороткой маркируют и хранят при 4 °C и в темноте. Убедитесь, что все клапаны газообменника закрыты, а вакуумный насос выключен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка должна быть стабильной до 4 месяцев в этом состоянии. На этом этапе протокол может быть возобновлен позже, максимум через 4 месяца.
3. Флаконы с декафторбутаном
- С чистыми, пустыми флаконами из боросиликатного стекла 3 мл (внутренний диаметр рта 7 мм, наружный диаметр рта 13 мм), облицовкайте их серыми хлорбутилкаучуковыми пробками типа лиофилизации (внутренний диаметр рта 7 мм, наружный диаметр рта 13 мм) и закрепите резиновую пробку отрывными алюминиевыми уплотнениями (наружный диаметр рта 13 мм) и обжимнойматрицей 4, 7,8.
- Следуйте этапу 2.9.1 для вакуума атмосферного воздуха (см. "Другие протоколы и данные" Этапы S3.1-S3.1.5).
- Пропустите дегазирование и выполните шаги 2.9.3-2.9.5 для повторного нажатия на флакон (см. шаги S3.3-S3.3.21 "Другие протоколы и данные").
- Маркируете флаконы с декафторбутаном и храните их при 4 °C и в темноте. Убедитесь, что все клапаны газообменника закрыты, а вакуумный насос выключен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для капельной конденсации понадобятся флаконы для сыворотки, заполненные газообразным декафторбутаном. Они должны быть стабильными до 4 месяцев в этом состоянии. На этом этапе протокол может быть возобновлен позже, максимум через 4 месяца.
4. Образование капель
- Извлеките гидратированный липидный раствор из флакона сыворотки (из Шага 2.10) из холодильника.
- Используя декапер, снимите алюминиевое уплотнение на флаконе сыворотки и перенесите 1 мл липидного раствора в флакон с образцом боросиликатного стекла 1,85 мл (с фенольной винтовой крышкой), позволив липидному раствору течь по внутренней стенке. Не создавайте пузырьки.
- Если во флаконе сыворотки остался липидный раствор, выполните шаги 2.9-2.10 для дегаза и повторного прессовития флакон сыворотки для хранения (см. шаги S3-S3-S3.3.21 «Другие протоколы и данные»).
- С помощью флакона с образцом 1,85 мл осторожно вливайте газ декафторбутан в пространство пробирки образца с помощью газообменника (см. Рисунок 2 для конкретных названий клапанов).
- Убедитесь, что все клапаны газообменника правильно закрыты, а насос выключен.
ВНИМАНИЕ:Если все сделано неправильно, можно вакуумировать газовый баллон, вызывая быструю декомпрессию и имплозию. - Откройте один коллекторный клапан и аккуратно отстегнивайте соответствующую иглу от коллектора.
ВНИМАНИЕ:Острый предмет, избегайте контакта / пирсинга. - Откройте клапан давления A и клапан давления B и поверните клапан газового баллона на 1/16 до 1/8 (примерно от 22,5 до 45 ° полного оборота) против часовой стрелки, чтобы частично открыть, а затем открыть клапан T-Handle.
ВНИМАНИЕ:Не открывайте клапан газового баллона больше, чем это, так как это может привести к повреждению регулятора воздуха. - С помощью раствора липидов с отсоедините флакон с образца и переместите его так, чтобы игла Manifold находились над границей раздела жидкость-воздух внутри флакона. Держите там флакон.
-
МЕДЛЕННО поворачивайте клапан регулятора воздуха по часовой стрелке, пока калибровочная стрелка регулятора воздуха не слегка не сдвинется с позиции покоя, а перфторуглеродный газ мягко не вытечет из иглы коллектора. Пусть перфторуглеродный газ мягко течет в пространство над головой флакона в течение 30 с. Не создавайте пузырьки. При необходимости отрегулируйте клапан регулятора воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс жидкость-воздух должен быть слегка возмущен потоком газа декафторбутана. Поскольку система теперь открыта, датчик регулятора воздуха не может правильно считывать давление. - Через 30 с тщательно и быстро замыкайте флакон с образцом, не перемещая флакон слишком сильно.
- Закройте клапан газового баллона (по часовой стрелке), клапан T-Handle, клапан регулятора воздуха (против часовой стрелки), клапан давления A, клапан давления B и клапан коллектора.
- Тщательно обхватить иглу.
- Маркировать флакон с образцом и запечатать горловину восковой пленкой по часовойстрелке (рис. 3А и 3В).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунках с 3B по 3F показан только 30% пиролипидный состав.
- Убедитесь, что все клапаны газообменника правильно закрыты, а насос выключен.
- Храните флакон с образцом в темноте и при 4 °C в течение не менее 10 мин или до 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть возобновлен позже, не более чем через 24 часа. - Поместите около 100 г сухого льда (углекислого газа) в изолированный контейнер и поместите обычный лед в другой изолированный контейнер. Извлеките подготовленные флаконы с декафторбутановой сывороткой, упомянутые в Шаге 3, две иглы 20 калибра 3,81 см (1,5 дюйма), пластиковый шприц объемом 1 мл (отклеить плунжер перед использованием), контейнер на 200 мл, металлические щипцы и термометр (от -20 до 100 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если только делать микропузырьки, то нет необходимости в изопропаноле, сухом льде и льде. - Поместите флакон с липидным раствором в механическую мешалку и перемешивайте в течение 45 с(рисунок 3С).
- После механического перемешивания встаньте флакон с образцом правой стороной вверх, защищенный от света, и начните 15-минутный обратный отсчет до охлаждения флакона и размера - выберите микропузырьки8,17.
- Когда 15-минутный обратный отсчет достигнет 10 минут (5 минут осталось на обратный отсчет), заполните контейнер примерно 200 мл изопропанола и охладите его до -20 °C сухим льдом с помощью металлических щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая температура составляет от -15 до -17 °C, но изопропанол будет нагреваться при работе с микропузырьками.
ВНИМАНИЕ:Изопропанол легковоспламеняется. Хранить вдали от жары и искр. Сухой лед может привести к повреждению кожи. Ручка щипцами. Носите перчатки, защиту глаз и защитное лабораторное пальто.
- Когда 15-минутный обратный отсчет достигнет 10 минут (5 минут осталось на обратный отсчет), заполните контейнер примерно 200 мл изопропанола и охладите его до -20 °C сухим льдом с помощью металлических щипцов.
- После того, как микропузырьки были выбраны в течение 15 минут, найдите выбранный размер раздела внутри флакона с образцом(рисунок 3D).
- Держа флакон с образцом правой стороной вверх, осторожно разблокируйте флакон с образца и выньте около 0,7 мл нижней перегородки с помощью 1,5-дюймовой иглы 20-го калибра, прикрепленной к пластиковому шприцу объемом 1 мл. Убедитесь, что ни один из верхних разделов не снят. Не щелкайте шприцем, чтобы удалить воздушные карманы.
- Вставьте другую иглу 20-го калибра в флакон с сывороткой декафторбутана (держа иглу в верхней части флакона сыворотки), чтобы проветрить, а затем вставьте иглу / шприц с микропузырьками выбранного размера.
- Медленно переносите выбранные по размеру микропузырьки. Наклоните флакон и наклоните шприц, чтобы жидкость скользила по внутренней стенке флакона с декафторбутановой сывороткой.
- После того, как весь выбранный по размеру микросубблок будет перенесен, удалите иглу шприцем, но держите вентиляционную иглу, чтобы уменьшить отрицательное давление(рисунок 3E).
- Если вы делаете только микропузырьки выбранного размера, остановитесь здесь. Держите вентиляционную иглу в верхней части и рядом с ней. Храните флакон в темноте и при комнатной температуре.
- Добавьте небольшое количество сухого льда или изопропанола комнатной температуры в изопропаноловую ванну, чтобы температура ванны была от -15 до -17 °C.
- С помощью вентиляционной иглы 20-го калибра, вставленной в верхнюю часть флакона сыворотки, поместите флакон сыворотки в изопропаноловую ванну, сохраняя уровень микропузырька ниже уровня изопропанола, но шейку флакона над ним, и периодически вращать флакон сыворотки в течение 2 минут, чтобы конденсировать микропузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг был изменен по сравнению с работой, проделанной Sheeran et al.6- Не закручивайте флакон сыворотки непрерывно в изопропаноле и не дайте раствору замерзнуть. Закрутите около 5 с и выньте флакон сыворотки из изопропанола. Проверьте зарождение льда и возобновите закручивание изопропанола. Если есть образование льда, закрутите флакон сыворотки в воздухе, пока он не рассеется.
- После 2-минутной конденсации извлеките флакон сыворотки из изопропанольной ванны и удалите вентиляционную иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микропузырьки должны были быть конденсированы в капли, о чем свидетельствует изменение полупрозрачность(Рисунок 3E по сравнению с Рисунком 3F для 30% пиролипидного состава). - Протрите флакон сыворотки, наклейте на него этикетку и поместите на обычный лед в темный изолированный контейнер до готовности к использованию. Неоткрытые (неповрежденные алюминиевые уплотнения) капли должны быть стабильными в этом состоянии до 6 ч до тех пор, пока растаяние лед заменяется по мере необходимости.
- Когда он будет готов к использованию, снимите алюминиевое уплотнение с помощью декаппера. Храните капли (даже открытые флаконы) на льду и в темноте, пока они не используются. Храните микропузырьки в темноте и при комнатной температуре.
5. Морфологическая и оптическая характеристика
- Приготовить 1% Тритона путем: добавления 5 мл Тритона Х-100 в 500 мл PBS (1x, рН 7,4) и перемешивания магнитным перемешиваемым стержнем до однородности14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 очень вязкий. Если вы используете стандартную пипетку для вытеснения воздуха, будьте осторожно при обращении. Аспирировать и медленно погружать объем и ждать, пока остаточный объем достигнет дна пипетки. Убедитесь, что жидкость не цепляется за внешнюю сторону наконечника пипетки при передаче объемов, медленно перемещаясь. - Подготовьте капли (Шаг 4). Если микропузырьки также характеризуются, соберите небольшой объем микропузырьков выбранного размера до конденсации (шаг 4.9).
- Размер микропузырьков или капель на счетчике сошника (CC) от 0,2 до 6 мкм для получения размерных распределений и концентраций(рисунок 4).
- Заполните чистую кювету объемом 20 мл 10 мл электролита CC, который был отфильтрован через мембранный фильтр с порами 0,2 мкм. Измерьте его на CC с тремя прогоном, чтобы получить базовый уровень.
- В тот же электролит CC добавляют 5 мкл микросубблемента или капельного образца и аккуратно перемешивают.
ПРИМЕЧАНИЕ: От 2 до 20 мкл образца могут быть добавлены в зависимости от того, насколько концентрирован образец. - Запустите выборку на CC (3 прогоны), вычтите усредненную базовую линию и рассчитайте распределение размеров и концентрацию (число на мл).
- Измерьте поглощение капель с помощью спектроскопии UV-Vis(рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5 показан только 30% пиролипидный состав.- На спектрофотометре UV-Vis установите измерение поглощения как от 800 нм до 300 нм длин волн с шагом 0,5 нм и включите коррекцию базовой линии.
- Используя чистую кювету длиной 1 см, заполненную PBS, выполните базовое измерение. Убедитесь, что объем достаточно высок, чтобы пересечь траекторию пучка спектроскопа.
- Разбавляют пиролипидные капли в PBS (рекомендуется от 2 мкл до 500 мкл капель в 2000 мкл разбавителяющего вещества) и смешивают путем пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ вихрь, иначе сборки будут уничтожены. - Переложите разбавленные капли в очищенную кювету и измерьте впитываемость. При необходимости измените разведения.
- Повторите шаги с 5.4.1 по 5.4.4, но используйте 1% Triton вместо PBS. После разбавления перед измерением перенесите образец в герметичный/закрытый флакон и вихрь в течение 30 с.
- Измерьте флуоресценцию микропузырьков или капель(рисунок 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 6 показан только 30% пиролипидный состав.- На флуоресцентном спектрофотометре установлена длина волны возбуждения как 410 нм, а длина волны излучения от 600 до 750 нм с шагом 1 нм.
- Измерьте флуоресценцию разбавителя PBS, чтобы получить базовую линию, используя кювету, совместимую с флуоресцентным спектрофотометром.
- Разбавить пиролипидные микропузырьки или капли в PBS (рекомендуется от 0,5 мкл до 10 мкл капель в 2000 мкл разбавителя) и перемешать путем пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ вихрь, иначе сборки будут уничтожены. - Перенесите разбавленный образец в очищенную кювету с исходным уровнем и измерьте флуоресценцию. При необходимости измените разбавления и избегайте насыщения сигнала.
- Повторите шаги с 5.5.1 по 5.5.4, но используйте 1% Triton вместо PBS. После разбавления в 1% тритоне перенесите разбавленный образец в герметичный/закрытый флакон и вихрь в течение 30 с перед измерением. Добавьте достаточно объема, чтобы пузырьки, образующиеся в результате вихря, были выше лазерного пути.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный сигнал образца в Тритоне будет намного выше, чем в PBS из-за нетуха флуоресценции(Рисунок 6).
6. Визуализация испарения
- Заполните резервуар для воды соответствующего размера деионизированной водой и дайте ему отдохнуть в течение 24 часов, чтобы уравновесить газы в воде с атмосферой.
- Приготовьте капли и держите на льду и в темноте до использования.
- Сделайте поток фантомной трубки из 2% агара, как описано Пеллоу и др.18 Погружайте фантом в резервуар для воды, нагретый до 37 °C.
- Разогрейте PBS до 37 °C и протейте через фантом.
- С помощью доклинской ультразвуковой системы и линейного преобразователя 21 МГц (см. Таблицу материалов)выровняйте вид с фантомом потока, установите его в B-режим изображения, установите выходное давление и захватите видео или изображения для получения исходных линий при каждом давлении.
- Разбавьте 20 мкл капли в 50 мл 37 °C PBS и аккуратно перемешайте. Переложите раствор в пластиковый шприц объемом 30 мл и протолкнуть раствор через агаровый фантом.
- Сохраняя то же выравнивание, что и на шаге 6.5, увеличивайте выходное давление до тех пор, пока не будет наблюдаться испарение (яркие пятнышки в фантоме, см. Рисунок 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 7 показан 30% образец пиролипидных капель. Этот коммерчески доступный преобразователь линейной решетки 21 МГц способен как к визуализации, так и к испарениям капель.
Representative Results
Предварительно конденсированные, выбранные по размеру микросуббные образцы(n = 3) и образцы капель с постконденсацией(n = 3) были рассчитаны на счетчике коултера (CC) с диафрагмой 10 мкм. Ограничением апертуры 10 мкм является то, что она не может измерять частицы размером менее 200 нм, что может искажать средний размер и концентрацию. На рисунке 4 показаны данные о размерах для каждого из составов пиролипидного содержания. В таблице 1 приведены статистические данные, основанные на данных о размерах. Используя соотношение средних диаметров до и после конденсации, результаты показали, что 0% пиролипидная композиция имела наименьшее смещение среднего диаметра при 1,72 ± 0,02. 50% пиролипидная композиция имела наибольший средний диаметр в 2,38 ± 0,08. Образец 1% пиролипидных капель имел самую высокую наблюдаемую концентрацию при (2,71 ± 0,13) × 1010 / мл, в то время как 40% образец пиролипидных капель имел самую низкую наблюдаемую концентрацию при (7,36 ± 0,81) × 109 / мл. Данные о размерах показали, что 10% образец пиролипидных капель имел наименьший пиковый диметр при 261 ± 13 нм, в то время как 50% образец пиролипидных капель имел самый большой при 390 ± 55 нм. Как правило, по мере увеличения содержания пиролипидов концентрация уменьшалась, а средний диаметр увеличивался. Поскольку постконденсированные образцы основаны на микросубблном образце предшественника, тенденция наблюдалась для обоих типов ультразвуковых контрастных веществ. По мере увеличения содержания пиролипидов начала формироваться микросубблная субпопуляция (с пиковым размером примерно 2000 мкм). Этот вторичный пик отсутствовал в образце 0% пиролипидных микросубблов и наиболее очевиден в 40% и 50% пиролипидных популяциях.
На рисунке 5 показаны репрезентативные измерения поглощения 30% образца пиролипидных капель. Пик интактного образца в PBS составил 700 нм, в то время как разрушенный образец в Тритоне сместил пик до 671 нм. Это показало, что неповрежденные сборки имеют различные оптические свойства по сравнению с отдельными, несобранными липидными компонентами.
На рисунке 6A показаны репрезентативные измерения флуоресценции предварительно конденсированного микросубблированного образца, в то время как на рисунке 6B показан образец после конденсации капель с 30% пиролипидов. Неповрежденный образец в PBS имел пик флуоресценции на 704 нм, в то время как нарушенная форма имела пик на 674 нм. Вычитание нарушенной области под кривой с неповрежденной областью под кривой и деление разницы на нарушенную область под кривой дает эффективность закалки, которая составляет 98,61% и 98,07% для 30% образца пиролипидного микросубблона и образца капель соответственно.
Чтобы продемонстрировать превращение капель в микропузырьки, разбавленные капли были визуализированы и испарились в фантоме потока 37 °C с ультразвуковой системой. На рисунке 7 показаны репрезентативные ультразвуковые изображения образца 30% пиролипидных капель, изображенных при различных давлениях. При низких давлениях(рисунок 7А)сигнала было очень мало, только фоновый сигнал от пузырьков воздуха застрял от синтеза агара. Это связано с тем, что капли не эхогенны и не рассеивают ультразвук. При слегка высокой мощности было сгенерировано несколько микропузырьков(рисунок 7B),о чем свидетельствует появление ярких пятнышек. По мере увеличения давления генерировалось больше микропузырьков(рис. 7C и 7D). Это также продемонстрировало, что капли не будут самопроизвольно испаряться при 37 °C.
Рисунок 1:Изображения этапов формирования 30% пиролипидного раствора. A)Липидный порошок плюс Pyro-SPC в хлороформе. Б)Растворяющий раствор добавлен. C)Липидная пленка высушивается и наносится на внутреннюю стенку флакона. D)Липидный флакон, обернутый в алюминиевую фольгу (внешняя фольга, заклеенная для повторного использования). E)Гидратированный липидный раствор. F)Раствор липидов во флаконе сыворотки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:10-коллекторный газообменник. Клапаны, упомянутые в протоколе, маркируются. Смотрите дополнительный файл «Другие протоколы и данные» для получения инструкций о том, как собрать газообменник. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: А)Липидные растворы 7 составов (от 0% до 50% Pyro-SPC) во флаконах для образцов. На рисунках B-D показаны изображения шагов, предпринятых для получения 30% пиролипидных капель. B)30% пиролипидный раствор во флаконе с образцом. C)Пост-агитация. D) 15 мин выбранный размер. Д)Нижняя перегородка переносится на декафторбутановый флакон. D)Постконденсация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Данные о размерах счетчика сошника (CC) выбранных по размеру микросубблов и капель с различным содержанием пиролипидной оболочки(n = 3). Сплошные зеленые линии представляют собой микропузырьки, а пунктирные голубые линии представляют капли. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H)Общие наблюдаемые концентрации образцов микросубблок и капель из КК на основе содержания Pyro-SPC в оболочке. Все полосы ошибок указывают на стандартное отклонение. Все измерения проводились с использованием диафрагмы 10 мкм, которая имеет диапазон размеров от 200 нм до 6000 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативные измерения поглощения спектроскопии от 300 до 800 нм образца после конденсации 30% пиролипидных капель, разбавленных в PBS и в 1% тритоне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Репрезентативное флуоресцентное излучение от 600 до 750 нм, возбуждаемого при 410 нм. A) Выбранный по размеру, предварительно конденсированный 30% пиролипидный микросуббл в PBS и в 1% Тритоне. B)Постконденсированный 30% образец пиролипидных капель в PBS и в 1% тритоне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Репрезентативные ультразвуковые изображения фантома агарова 37 °C, сделанные с помощью доклинических преобразователей линейной решетки 21 МГц в B-режиме (см. Таблицу материалов). В левомстолбце (рисунки A, C, Eи G)показаны элементы управления PBS. Правая колонка(рисунки B, D, Fи H)показывает 20 мкл постконденсированного 30% пиролипидного образца капли, разбавленного в 50 мл 37 °C PBS. Каждая строка представляет собой пиковые отрицательные давления свободного поля, которые были оценены из работы, проделанной Sheeran et al.8 Желтые треугольники указывают на глубину фокусировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Метод | Агент | Пиро-оболочка % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| КУБОВЫЙ | Пузыри | Конс. [/мл] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| КУБОВЫЙ | Пузыри | Пик [нм] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| КУБОВЫЙ | Пузыри | Среднее [нм] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| КУБОВЫЙ | Пузыри | Медиана [нм] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| КУБОВЫЙ | Капель | Конс. [/мл] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| КУБОВЫЙ | Капель | Пик [нм] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| КУБОВЫЙ | Капель | Среднее [нм] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| КУБОВЫЙ | Капель | Медиана [нм] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Таблица 1: Статистика данных о размерах образцов микросубблов и капель с различным содержанием Pyro-SPC из счетчика сошника (CC)(n = 3). Все ошибки указывают на стандартное отклонение.
Дополнительная информация - Лист липидных формул: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная информация - Другие протоколы и данные: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
После добавления всех липидных компонентов вместе (этапы 1.2 и 1.4.5, фиг.1А)добавляли раствор хлороформа и метанола (и воды, если присутствуют липиды фосфатидной кислоты, такие как DSPA), чтобы обеспечить полную гомогениду пиролипидных и непиролипидных компонентов (этап 1.5, фиг.1В). Для предотвращения образования липидных везикул с гетерогенным липидным составом растворенные липиды сушили и наносили на внутреннюю часть стенки флакона тонкой пленкой(рисунок 1С). Покрытие (Этап 1.6) также облегчает гидратацию (Этап 2.1-2.4), поскольку оно увеличивает площадь поверхности высушенной пленки. Сушка (этап 1.6, рисунок 1С)и вакуумирование (этап 1.8, рисунок 1D)были выполнены для обеспечения полного испарения хлороформа и метанола, поскольку эти химические вещества могут нарушить образование микропузырьков. В то время как протокол может быть уменьшен, чтобы сделать объемы липидного раствора до 1 мл, большие объемы могут уменьшить вариации флакона на флакон. Хотя это может привести к деградации Pyro-SPC во время отсутствия использования, условия хранения раствора липидов (этапы 2.9-2.10) были предназначены для снижения этого риска. Этап дегазации с газообменниками (этап 2.9.2, фиг.1F и фиг.2)служит для устранения как можно большего количества кислорода для предотвращения окисления. Не рекомендуется хранить липидные растворы, содержащие порфирин-липиды, пока атмосферные газы еще растворяются в растворе(рисунок 1Е).
На этапе 2.10 раствор липидов находится во флаконе сыворотки с напорным пространством, аналогично тому, как продается клинически одобренное ультразвуковое контрастное вещество перфлутреновые липидные микросферы (аналогично рисунку 1F). Внутренняя работа показала, что стабильные микропузырьки не могут быть получены путем механического перемешивания с присутствием пиролипидов, если колпачок был мягким материалом, таким как резиновая пробка. Поэтому липидный раствор переносили во флакон с флаконом с нерезовым феноличим колпачком (этапы 4.1-4.4, фиг.3А и 3В). Когда газ декафторбутан поступал во флакон для образца (этапы 4.1-4.4), более плотный декафторбутан должен вытеснять атмосферный воздух в пространстве над головой флакона образца. В настоящее время неизвестно, почему пиролипиды не могут образовывать микропузырьки с резиновыми пробками. Без пиролипидов, стабильные микропузырьки могут быть изготовлены непосредственно в сывороточных флаконах с резиновыми пробками4,7. Таким образом, рекомендуется использовать газообменник для дегазирования и повторного надавливать флакон сыворотки, а затем перемешивать сам флакон сыворотки для непиролипидных составов4,5,6,7 (см. раздел «Другие протоколы и данные»). Преимущество возможности механического перемешивания во флаконе сыворотки заключается в том, что пространство над головой может находиться под давлением, а выбор размера может быть выполнен путем переворачивания флакона сыворотки вверхногами 8. В этом протоколе 0% пиролипидный состав переносили во флакон с образцом (этапы с 4.1 по 4.4), чтобы соответствовать составам, которые содержали пиролипиды. Кроме того, более длинная длина ациловой липидной цепи приводит к более стабильным каплям из-за лучших взаимодействий Ван-дер-Ваальса19. Композиция липидной оболочки была выбрана на основе того, что было коммерчески доступной, длины 18-ациловой цепи для всех типов липидов. DSPE-PEG5K был включен во все составы (этап 1.1), так как присутствие полиэтиленгликоля цепей предотвращает слияние структур посредством отталкивающих стерических сил19. Во время гидратации липидов ванна с ультразвуком была установлена на 70 °C (шаг 2.1) как достаточно высокую, чтобы полностью рассеять липидную пленку 18 длиной18ациловой цепи. Для более длинных ацильных цепей потребуются более высокие температуры.
Более высокая пиролипидная нагрузка увеличит концентрацию оптически поглощающих и флуоресцентных компонентов, что может быть желательно для определенных применений, которые выигрывают от максимальной нагрузки порфирина. Однако по мере увеличения содержания пиролипидов наблюдаемая концентрация капель уменьшалась, а диаметры увеличивались(рисунок 4 и таблица 1). Это иллюстрирует компромисс между оптической флуоресценцией и абсорбирующими свойствами и концентрацией и диаметром капель. Для исследователей, которые должны отдавать приоритет малым диаметрам для накопления in vivo через небольшие протекающие сосуды или если необходимо вводить высокую концентрацию капель, увеличение пиролипидной нагрузки может не стоить увеличения диметра капель или снижения концентрации капель. Если высокие концентрации капель и/или малые диаметры капель имеют первостепенное значение, следует рассмотреть возможность применения диагностических агентов аналогичного размера вместо пиролипидов. В то время как 1% пиролипидных капель не приводил к уменьшению концентрации или увеличению размера, 1% пиролипидная нагрузка может быть слишком низкой, чтобы ее можно было разумно обнаружить по тканевому фону флуоресцентно. Однако гибкость порфиринового муляжета обеспечивает множество вариантов функционализации, которые придадут альтернативные средства количественной оценки, более подходящие для применений с низкой концентрацией. Например, пиролипиды могут быть хелатированы медью-64 для позитонно-эмиссионной томографии и гамма-счета20,или палладием для количественной оценки след-металлов с использованием масс-спектрометрии, или марганцем для магнитно-резонансной томографии14.
В то время как для некоторых экспериментов может потребоваться только небольшой объем капельного раствора, для заполнения флакона с образцом 1,85 мл требуется 1 мл раствора липидов. Goertz et al. продемонстрировали, что изменения в обработке, давлении в пространстве над головой, соотношении жидкости к газу и даже форме флакона могут влиять на популяции микросубблов17. Температура флакона во время перемешивания и выбора размера также может влиять на распределение по размерам. Поэтому для методов, оптимизированных конечным пользователем, важно быть максимально последовательными при изготовлении капель. Неоткрытые капли могут быть заморожены (-20 ° C) и разморожены позже для будущего использования, но это повлияет на размер популяций.
Процедура перемешивания, которая активирует раствор липидов в микропузырьки, не производит морфологически однородную популяцию (этап 4.6); скорее, образец заполнен микропузырьками, многоламельными везикулами, липосомами и мицеллами18,21,22. В то время как размеры микросубблок охватывают микронный и нанометровый диапазон, другие структуры в значительной степени ниже 800 нм 23. Используемые методы оцифровки не проводят различия между этими различными структурами, и, таким образом, образцы микросубблов после перемешивания (этап 4.6, рисунок 3C)и образцы капель после конденсации (этап 4.14, рисунок 3F)должны рассматриваться как смеси. Нечувствительные к ультразвуку сборки (многоламелярные везикулы, липосомы и мицеллы), вероятно, сохраняются после конденсации и не изменят размер, поскольку они не имеют фазовых сердечников. Поскольку счетчик Култера не может различать эти различные супрамолекулярные сборки, сдвиг в размере популяции после конденсации следует интерпретировать с предположением, что некоторая часть наноразмерных структур неконвертируема и вносит вклад в наблюдаемую популяцию в этой области размера. Кроме того, эти структуры способствуют спектроскопическим и флуоресцентным сигнатурам этих образцов14. Флуоресцентные и абсорбционные сигнатуры мицелл, липосом/везикул и капель схожи, включая степень их флуоресцентного гашения14. Таким образом, важно учитывать, что на рисунках 3C до 3F, рисунок 4,существует смесь сборок, разбавленный образец PBS на рисунке 5и разбавленный образец PBS на рисунке 6.
После выбора размера и до конденсации (этап 4.9) можно устранить непузырьковые сборки путем центрифугирования микропузырькового образца для отделения плавучих пузырьков от неживучих сборок, как описано Feshitan et al.21 Степень разделения можно контролировать, регулируя силу и продолжительность вращения. Однако эксперименты по конденсации микропузырьков таких изолированных по размеру образцов показали, что использование более крупных популяций микропузырьков-предшественников, которые отбираются с использованием процедур выделения размеров, дает более крупные капли (см. «Другие протоколы и данные» Шаг S5 для размера пузырьков и капель после раскрутки). Поскольку предполагаемое применение капель, полученных с помощью этого протокола, является платформой для пассивной экстравазации и накопления из-за их небольшого размера по сравнению с микропузырьками4,8,популяции капель, которые являются как можно меньше, были желательными. Таким образом, в этом протоколе использовались постперемешанные микросубблированные образцы, которые не были выделены по размеру с помощью центрифугирования, даже если это означало, что в конечном растворе присутствовали нечувствительные к ультразвуку мицеллы, липосомы и везикулы. Это означает, что процедуры количественной оценки для биораспределения будут получать сигнал для всех введенных структур и не ограничиваются только каплями. Однако, поскольку эти структуры аналогичного размера, скорее всего, накапливаются через пассивный механизм, который в первую очередь диктуется размером, не подозревается, что это должно изменить основные выводы, которые могут быть сделаны, если эта платформа будет использоваться in vivo,хотя все эти аспекты должны рассматриваться индивидуально в зависимости от контекста, в котором платформа может быть использована. Тесты с использованием экспериментальных рук с ультразвуком и без него могут быть выполнены, чтобы убедиться, что именно ультразвукочувствительные капли ответственны за любые изменения в биораспределении, поскольку только перфторуглеродные сборки ядра в растворе будут реагировать на ультразвук.
После перемешивания флакон отдыхали в течение 15 минут и во флаконе наблюдался перегородка(рисунок 3C против 3D). Выбор размера с помощью плавучести представляет собой простой метод устранения более крупных структур/пузырьков из активированного микропузырьковогораствора8,17. В этом случае частицы диаметром более 5 мкм в основном удалялись после выбора размера(рисунок 4). Степень выбора размера может быть настроена путем управления продолжительностью выбора размера17. Sheeran et al. показали, что невыбор размера может привести к генерации микропузырьков, которые засоряют сосудистую8.
Перфторуглероды имеют преимущество в том, что они биологически инерты7. В то время как температура кипения декафторбутана составляет -1,7 ° C, выше температуры тела, капли не сразу испаряются при воздействии 37 °C(рисунок 7B). Поскольку капли метастабилены при 37 °C, для испарения капель в микропузырьки7,9необходима дополнительная акустическая энергия. Poprosky et al. продемонстрировали капли порфирина, конденсированные под давлением22. Это жизнеспособный и даже важный метод при использовании менее плотных перфторуглеродов, но высокое давление может разрушить некоторые пузырьки в процессе. Октафторпропан (C3F8)имеет температуру кипения -36,7 °C, поэтому для конденсации капель необходимо как охлаждение, так и давление. Однако более легкий перфторуглерод приводит к менее стабильным каплям. Додекафторпентан (C5F12)может привести к более стабильным каплям с температурой кипения 28 °C. Тем не менее, это жидкость при комнатной температуре, и для испарения потребуется более сильная акустическая энергия. Таким образом, при выборе содержащего газ ультразвукового контрастного вещества следует учитывать условия его предполагаемого биологического применения в дополнение к параметрам его изготовления. В этом протоколе изопропанольные ванны для конденсации были установлены на -15---17 °C (этап 4.7.1 и этап 4.13), в то время как в других протоколах использовали -10 °C 5,6. Даже при общем декафторбутановом ядре температура конденсации может изменяться в зависимости от состава эксципиента, общей концентрации липидов и состава липидной оболочки. При использовании других составов может потребоваться оптимизация для обеспечения надлежащей конденсации капель, не вызывая замерзания раствора.
Поскольку капли меньше и более стабильны, чем их микросуббл-предшественник7,они могут лучше использовать пассивные механизмы накопления для экстравазирования в определенные ткани, представляющие интерес, такие как повышенная проницаемость и эффект удержания определенных типов опухолей4,24. С помощью флуоресцентных, оптически абсорбирующих и акустических методов обнаружения14 можноиспользовать один состав для количественной оценки поглощения. Кроме того, эта платформа может быть использована для исследования того, может ли акустическое испарение капель улучшить доставляемую агентную фракцию за пределами пассивных уровней16. Для количественной оценки биораспределения агента в тканях и органах, представляющих интерес после инъекции, животному следует ввести известное количество пиролипидных капель, ультразвук может или не может быть применен в зависимости от контрольного набора, животное должно быть принесено в жертву заранее указанной точке времени, а органы должны быть удалены и взвешены. Органы должны быть гомогенизированы, отфильтрованы, разбавлены в поверхностно-активном веществе (моющем средстве) для децеллюляризации ткани и количественно оценены с помощью флуоресценции или спектроскопии UV-Vis для получения процентов введенных доз на массу органа на основе сигналов Pyro. Для этапа 5.4.5(рисунок 5)и шага 5.5.5(рисунок 6)поверхностно-активное вещество (моющее средство) Triton X-100 использовалось для разрушения образцов, поскольку оно не флуоресцентное при 410 нм и его длины волн поглощения не перекрываются с поджигающими.
Микропузырьки не характеризовались поглощением UV-Vis. Поскольку лазерный источник спектроскопа UV-Vis параллельен детектору, любые большие пузырьки могут рассеивать свет от детектора, заставляя их казаться более оптически поглощаемыми14. В отличие от спектрофотометра UV-Vis, детектор флуоресцентного спектрофотометра является / должен быть перпендикулярным лазерному источнику, чтобы предотвратить вмешательство источника в детектор. UV-Vis использовали для количественной оценки поглощения неповрежденных и разрушенных образцов капель (шаг 5.4, рисунок 5). В качестве длин волн поглощения было выбрано от 300 до 800 нм, поскольку две основные полосы поглощения пиролипидов, полоса Сорета (от 340 до 500 нм) и Q-диапазон (от 640 до 730 нм), попадают в этот диапазон14. При сборке в каплю (или другие супрамолекулярные структуры) пик Q-диапазона пиролипидов смещен красным цветом от 671 нм до 700 нм(рисунок 5). Когда эта супрамолекулярная структура нарушается поверхностно-активным веществом, таким как тритон, пик смещается обратно к 671 нм14,15. Основываясь на этом сдвиге, можно сказать, находятся ли пиролипиды в собранном состоянии или в нарушенном состоянии. Соотношение двух пиков может быть использовано для оценки распада сборок с течением времени.
Для измерений флуоресценции (шаг 5.5, рисунок 6)была выбрана длина волны возбуждения 410 нм, поскольку она соответствует пику полосы Сорет для несобранного пиролипида14. Диапазон длин волн излучения от 600 до 800 нм был выбран, поскольку пики неповрежденных сборок в PBS и разрушенных пиролипидов в тритоне содержатся в этом диапазоне. Сдвиг и увеличение флуоресценции(рисунок 6)между интактными (704 нм в PBS) и нарушенными (674 нм в тритоне) образцами происходили из-за структуро-индуцированного гашения. В собранном виде пиролипидные молекулы были упакованы близко друг к другу, поэтому сгенерированные фотоны были поглощены близлежащими пиролипидными молекулами. Это проявляется в неповрежденной и нарушенной эффективности закалки. Таким образом, необходимо разбавлять образцы в поверхностно-активном веществе (моющем средстве), подобном 1% Triton X-100, чтобы облегчить закалку и максимизировать сигнал для количественной оценки биораспределения14.
Для простоты один и тот же ультразвуковой преобразователь линейной решетки использовался как для испарения, так и для изображения (шаги 6.5 и 6.7, рисунок 7). Этот ультразвуковой преобразователь (Таблица материалов) был способен достигать необходимого пика отрицательных давлений, необходимых для испарения капель8. Заполнение резервуара деионизированной водой из-под крана приводит к возникновению газов, которые растворяются в воде (этап 6.1). Чтобы свести к минимуму помехи от растворенных газов в воде с испарением и визуализацией, воду отдыхали в течение 24 ч в резервуаре, чтобы газы в воде уравновешивались с атмосферой (этап 6.1). Альтернативно, деионизированная вода может быть дегазирована с помощью достаточно большого размера, герметизируемого контейнера, подключенного к достаточно мощному вакууму. Ультразвуковые изображения показали, что микропузырьки были успешно конденсированы, поскольку капли были ненаблюдаемыми / неэкогенными при низком давлении(рисунок 7B). Только при более высоких выходных давлениях капли испарялись в наблюдаемые, эхогенные микропузырьки(рисунок 7D,7F, 7H). В то время как образец после конденсации капель содержит мицеллы и липосомы / везикулы, эти сборки не являются эхогенными и только капли могут испаряться в эхогенные микропузырьки. Управление PBS проходило через фантом для установления базовых изображений(рисунки 7A, 7C, 7E, 7G). По мере увеличения давления в PBS контраст не создавался. Это указывало на то, что высокое давление от преобразователя не могло производить спонтанную кавитацию только в среде на водной основе, и, таким образом, весь другой генерируемый контраст можно было отнести к используемому ультразвуковому контрастному веществу. Если выходное давление слишком высокое, образующиеся микропузырьки могут быть уничтожены. Постепенно увеличивая давление и соблюдая создаваемый контраст, оптимальное давление можно найти8. Период полураспада циркуляции капель можно определить аналогичным образом путем испарения капель через определенные промежутки времени и наблюдения контраста, образующегося с течениемвремени 7.
Таким образом, мультимодальные капли фазового изменения с изменяющимся содержанием пиролипидов были созданы методом конденсации. Размер показал, что существует компромисс между пиролипидной нагрузкой и концентрацией микросуббля/капель. Характеристики показали, что существуют различия в интактных и нарушенных формах как в абсорбции, так и во флуоресценции. Ультразвуковая визуализация показала, что капли были неэкогенными при 37 °C и испарялись в эхогенные микропузырьки при достаточном давлении. Характеристики также показали потенциал пиролипидных капель для замены сопутствующих диагностических агентов для тестов на биораспределение или накопление капель. Будущая работа будет исследовать пороги испарения в растворе, стабильность в растворе и продолжительность циркуляции in vivo у обнаженных мышей.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Брэндона Хелфилда за помощь в строительстве газообменника и д-ра Миффи Хока Ян Ченга за технические обсуждения. Авторы хотели бы поблагодарить следующие источники финансирования: стипендию для выпускников Онтарио, Канадские институты исследований в области здравоохранения, Научно-исследовательский институт Терри Фокса и Фонд рака принцессы Маргарет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
