Summary
I detta protokoll beskrivs metoder för att syntetisera och karakterisera multimodala fas-change porfyrin droppar.
Abstract
Fasförändringsdroppar är en klass av ultraljudskontrastmedel som kan omvandlas till echogenic mikrobubblor på plats med tillämpning av tillräcklig akustisk energi. Droppar är mindre och stabilare än sina motsvarigheter till mikrobubblor. Traditionella ultraljud kontrastmedel är dock inte spårbara utöver akustisk feedback mätningar, vilket gör kvantifierande kontrast agent bio-distribution eller ackumulering ex vivo svårt. Forskare kan behöva förlita sig på fluorescerande eller optiskt absorberande kompletterande diagnostiska partiklar för att härleda biodistribution. Syftet med detta protokoll är att beskriva steg för att skapa multimodala fas-ändra porfyrin droppar med hjälp av en kondenseringsmetod. Porfyriner är fluorescerande molekyler med distinkta absorbansband som kan konjugeras på lipider och införlivas i droppar för att förlänga droppens mångsidighet, vilket möjliggör en mer robust biofördelning samtidigt som akustiska egenskaper bibehålls. Sju formuleringar med varierande porfyrin-lipid och bas lipid innehåll gjordes för att undersöka mikrobubble och droppe storlek distributioner. Karakteriseringar som är lämpade för porfyrininnehållande strukturer beskrivs också i protokollet för att visa deras analytiska mångsidighet i lösningen. Storleksanpassa visade att de postkondenserade medeldiametrar var 1,72 till 2,38 gånger mindre än prekursorpopulationer. Absorbans karakterisering visade intakta enheter hade en Q-band topp på 700 nm medan störda prover hade en absorbans topp på 671 nm. Fluorescens karakterisering visade intakt 30% porfyrin-lipid sammansättningar var fluorescerande släckta (>97%), med fluorescens återhämtning uppnås vid störningar. Akustisk förångning visade att porfyrin droppar var icke-echogenic vid lägre tryck och kunde omvandlas till echogenic microbubbles med tillräckliga tryck. Dessa karakteriseringar visar potentialen för porfyrin droppar att eliminera behovet av absorbans eller fluorescens-baserade följeslagare diagnostiska strategier för att kvantifiera ultraljud kontrast agent biodistribution för leverans eller terapeutiska applikationer in vivo eller ex vivo.
Introduction
Ultraljud imaging är en icke-invasiv, icke-joniserande form av medicinsk avbildning som använder akustiska vågor. Medan ultraljudsskannrar är mer bärbara och kan ge realtidsbilder, kan ultraljudsavbildning drabbas av låg kontrast, vilket gör det svårt för sonografer att på ett tillförlitligt sätt skilja på liknande ekogena patologiska egenskaper. För att motverka denna begränsning kan mikrobubblor injiceras i värden för att förbättra vaskulär kontrast. Mikrobubblor är mikronstora gasfyllda kontrastmedel som är mycket ekogena till akustiska vågor och kan ge förbättrad kärlkontrast1,2. Skal och gaskärnor av mikrobubblor kan skräddarsys för olika tillämpningar, såsom avbildning, trombolys, cellmembranpermeabilisering eller övergående vaskulär öppning2.
En nackdel med mikrobubblor är deras korta halvering av cirkulationen. Till exempel har kliniskt tillgängliga perflutren lipidmikrosfärer bara en halveringstid på 1,3 minuter3. För långa bildsessioner behövs flera injektioner av mikrobubblor. En annan nackdel med mikrobubblor är deras stora diametrar. Medan perflutren lipidmikrosfärer är cirka 1 till 3 μm i diameter, tillräckligt små för att cirkulera i vaskulatur, är de för stora för att extravasera och passivt ackumuleras i vävnader av intresse, såsom tumörer4. En strategi för att övervinna dessa begränsningar är att kondensera gaskärnmikrobubblorna till mindre droppar med flytande kärna5,6. Medan droppar inte är echogenic i sitt flytande tillstånd, de kan förångas till mikrobubblor vid exponering för ultraljud med tillräckligt hög topp undertryck, återfå sin förmåga att ge kontrast. Detta gör det möjligt för droppen att dra nytta av den mer gynnsamma farmakokinetiken hos en liten flytande kärna, samtidigt som förmågan att ge kontrast när den insoneras och utan att ändra den kemiskasammansättningen 4,7.
Dekafluorbutan är en idealisk perfluorkarbonförening för fasförskjutning mellan gasformiga och flytande tillstånd5,6,7. Dekafluorbutan möjliggör kondensering av mikrobubblor i droppar med enbart temperatursänkning, medan mindre täta perfluorkarboner kräver ytterligare trycksättning5. Denna milda metod minimerar förstörelsen av bubblor underkondensation 7,8,9. Eftersom deras kärnor är flytande är droppar icke-ekogena och osynliga för ultraljud. Men med tillämpning av tillräcklig akustisk eller termisk energi kan de flytande kärnorna förångas tillbaka till ett gasformigt tillstånd, vilket genererar echogenic mikrobubblor8. Denna förångning möjliggör kontroll av när och var man kan generera mikrobubblor.
Medan droppar är användbara för passiv ackumulering, in situ-förångning eller förbättring av cellgenomsläpplighet4,kan droppar (och deras fragment) inte avbildas eller kvantifieras ex vivo. Därför används kvantifierbart följediagnostikmedel, såsom fluorescerande4,10,11, magnetiska partiklar12, optiskt absorberande medel13, som en analog för att mäta droppleverans till vävnader av intresse. Till exempel använde Helfield et al. en saminjektion av fluorescerande nanopärlor för histologibild kvantifiering av musorgan eftersom droppar inte kunde detekteras fluorescerande4. Nackdelen med medföljande diagnostiska medel är att den spårbara komponenten kan fungera oberoende av droppen beroende på dess individuella farmakokinetiska profil.
Lyckligtvis kan skalet av mikrobubblor och droppar anpassas. Till exempel visade Huynh et al. ultraljud kontrastmedel med porfyrin-lipid skal, vilket skapar multimodala mikrobubblor14. Porfyriner är en klass organiska föreningar med en aromatisk makrocylik struktur14,15. De är optiskt absorberande, fluorescerande och kan kelateras till en mängd olika metaller för strålbehandling, strålnuklidbaserad avbildning eller spårmetallbaserad kvantifiering14. Ett exempel på porfyrin är pyrofenoforbid (Pyro). Genom att frammana Pyro på lipider, som innehåller Pyro-lipider i mikrobubblor eller droppar, kan de avbildas och spåras genom flera former: akustiskt, fluorescerande och genom absorbans14. Detta multimodala kontrastmedel kan användas för att spåra och kvantifiera ackumulering. Detta kan eliminera behovet av medföljande diagnostiska medel eftersom den kvantifierbara komponenten nu konjugeras på skalet, vilket möjliggör mer exakt leveransk kvantifiering16.
Häri beskrivs ett protokoll för att skapa multimodala fas-change porfyrin droppar. Eftersom ultraljud kontraster agenter kan användas som en plattform för läkemedelsleverans till vävnader av intresse, såsomtumörer 2,4, förlänga deras detekterbarhet utöver ultraljud kan visa sig användbart för leverans effektivitet kvantifiering. Syftet med dessa droppar är att tillhandahålla spårbara ultraljud kontrastmedel som kan passiv ackumulering in vivo, in situ vaporization och akustik, och med potential att kvantifiera biodistribution eller ackumulering från ex vivo organ utan att förlita sig på sekundära sensorer. Karakteriseringsmetoder beskrivs också för att visa upp porfyrindroppars potential som biodistributionssensorer. Effekterna av Pyro-lipidbelastning i skalet (0% till 50% efter molarförhållande) diskuteras också.
Protocol
1. Uttorkade lipidfilmer
- Beräkna massorna för var och en av de skalkomponenter som behövs (se Kompletterande fil "LipidFormelblad").
OBS: För detta protokoll, Skalsammansättningen kommer att vara: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyetylenglykol)-5000] ammoniumsalt (DSPE-PEG5K), x molar % pyrofenoforbi konjugerad 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfokolin (Pyro-SPC) och (90 - x)molar % 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC). Mängden Pyro-SPC kommer att varieras över 7 skalkompositioner (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Kontrollera DSPE-PEG5K:s molekylvikt på lagerflaskan.- Skala protokollet till valfri lipidvolym med en minsta volym på 1 ml. För detta protokoll användes en total lipidvolym på 10 ml med en total lipidkoncentration på 1 mg per ml för alla formuleringar. Hjälplösningen kommer att vara: 10% propylenglykol, 10% glycerol och 80% fosfatbuffert saltlösning (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (se steg 2.3 och "Lipid Formula Sheet").
OBS: Sammanfattande protokoll av Pyro-lipider beskrivs i tilläggsfilen "Andra protokoll och data" steg S1 till S1.19, som ändrades från det arbete som utförts av Zheng et al.15.
- Skala protokollet till valfri lipidvolym med en minsta volym på 1 ml. För detta protokoll användes en total lipidvolym på 10 ml med en total lipidkoncentration på 1 mg per ml för alla formuleringar. Hjälplösningen kommer att vara: 10% propylenglykol, 10% glycerol och 80% fosfatbuffert saltlösning (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (se steg 2.3 och "Lipid Formula Sheet").
- På grundval av de beräknade massorna (se steg 1.1 och "Lipid Formula Sheet") ska var och en av de icke-pyro-lipider som finns och överföras till en glasflaska i tillräckligt stor storlek med ett skruvlock.
- Täck injektionsflaskan, märk locket och injektionsflaskan och täck botten och väggarna på lipidflaskan med aluminiumfolie. Denna flaska kommer att kallas "Lipid Vial" för resten av protokollet. Förvara LipidFlaskan i ett svalt, torrt och mörkt område.
- Om formuleringen innehåller Pyro-SPC, lös upp 10 mg Pyro-SPC torrfilm (se "Övriga protokoll och data") i 1 ml kloroform. Virvel i 5 s, mät absorbansen och beräkna lämplig volym för att lägga till Lipid Vial.
VARNING: Kloroform är en hälsorisk, irriterande och giftig. Använd en skyddande labbrock, ögonskydd, handskar och undvik att andas in ångor.
OBS: Eftersom Pyro-SPC är ljuskänsligt, sänk om möjligt lamporna i arbetsområdet vid hantering av Pyro-SPC. Håll Pyro-SPC förseglad och täckt när den inte används.- På den ultraviolett synliga spektrofotometern, ställ in den för att mäta absorbans från ett våglängdsområde på 800 nm till 300 nm med steg om 0,5 nm och mät en baslinje med 2000 μL ren metanol i en kompatibel 1 cm banlängds cuvette.
VARNING: Metanol är en hälsorisk, irriterande, giftig och brandfarlig. Använd en skyddande labbrock, ögonskydd, handskar och undvik att andas in ångor. Håll dig borta från gnistor och värme. - Tillsätt 2 μL pyrospade i kloroform i 2000 μL metanol och virvel i 30 s. Överför den till en ren, kompatibel 1 cm cuvette och mät absorbansen. Justera denna utspädningsfaktor om absorbansen når en topp på 667 nm utanför den ultraviolett synliga spektrofotometerns absorbansområde.
OBS: Vid överföring av kloroform eller metanol, använd en ren glasspruta eller en pipett med positiv deplacement i stället för en mekanisk pipett för bättre noggrannhet. - Upprepa steg 1.4.2 två gånger till för att få tre exemplariska absorbansvärden.
- Medelvärdet av absorbanstoppen vid 667 nm och använd följande ekvation för att beräkna volymen pyrospadep omformning som behövs för Lipidflaskan14,15:
Där V är volymen pyrospion i kloroform som behövs. m är den erforderliga massan av Pyro-SPC (se steg 1.1 och "Lipid Formula Sheet"), M är den molekylvikt som Pyro-SPC har vid 1040.317 g·mol-1, A är den genomsnittliga absorbansen vid 667 nm, d är utspädningsfaktorn baserad på metanol och Pyro-SPC i kloroformvolymer (steg 1.4.2), L är cuvettebanans längd på 1 cm och ε är 667 nm molardämpningskoefficienten för Pyro-SPC vid 45000 L·mol-1·cm-1.
OBS: Ekvationens nämnare är Beer-Lambert-lagen, som relaterar koncentrationen av en analyt i lösning till den uppmätta optiska absorbansen över ett avstånd. - Tillsätt den beräknade volymen Pyro-SPC i kloroform från föregående steg till Lipidflaskan med en ren glasspruta (figur 1A) och täck sedan över injektionsflaskan.
OBS: Figur 1 visar endast 30 % pyrolipidformulering. - Om det finns pyro-SPC i kloroform kvar: I en rökhuv, ta bort pyro-SPC + kloroformflaskan från steg 1.4, luta delvis injektionsflaskan åt sidan och flöda kontinuerligt kvävegas så försiktigt som möjligt in i pyrospc/kloroformflaskan. Rotera injektionsflaskan för att torka ut kloroformen med hjälp av kvävegasflödet och för att jämnt täcka Pyro-SPC på injektionsflaskans innervägg när den torkar. Se till att inga stänk görs och ingen av lösningen faller ut.
- När Pyro-SPC lipidfilmen verkar torr och belagd på flaskans vägg, stäng av kvävegasflödet. Kapsla injektionsflaskan, försegla injektionsflaskan med vaxfilm och förvara injektionsflaskan vid -20 °C och i mörker.
- På den ultraviolett synliga spektrofotometern, ställ in den för att mäta absorbans från ett våglängdsområde på 800 nm till 300 nm med steg om 0,5 nm och mät en baslinje med 2000 μL ren metanol i en kompatibel 1 cm banlängds cuvette.
- Förbered en lösning på 90% kloroform och 10% metanol (% v/v) och tillsätt 5 ml av den till Lipidflaskan. Kapsla Lipidflaskan och snurra försiktigt för att homogenisera innehållet (Bild 1B).
OBS: Om formuleringen innehåller fosfatidsyralipider (t.ex. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatnatriumsalt (DSPA)), tillsätt: 60% kloroform, 32% metanol och 8% dubbeldeioniserat vatten (% v/v/v) till Lipid Vial istället. Mer intensiv virvlande kan vara nödvändigt för att helt lösa upp lipidinnehållet. - I en rökhuv, ta bort Lipidflaskan, luta lipidflaskan delvis åt sidan och flöda kontinuerligt kvävegas så försiktigt som möjligt in i Lipid-injektionsflaskan. Rotera LipidFlaskan för att torka ut lösningen med hjälp av kvävegasflödet och jämnt täcka lipidfilmen på lipidflaskans innervägg när den torkar. Se till att inga stänk görs och ingen av lösningen faller ut.
- När lipiderna verkar torra och belagda på lipidflaskans innerväggar (Figur 1C), stäng av kvävegasflödet, täck botten och väggen på Lipid Vial med aluminiumfolie och täck toppöppningen med aluminiumfolie petad med några hål med en nål för ventilering (Figur 1D).
- Märk och placera den täckta Lipidflaskan i en vakuumdickator och låt lipiderna torka ytterligare i minst 24 timmar men högst 72 timmar.
OBS: Protokollet kan återupptas senare, efter 24 till 72 h.
2. Lipid hydrering
- Fyll en badljudsdon med vatten och värm upp den till 70 °C. Sätt på ultraljudsbehandlingen för att blanda vattnet.
VARNING: Vattnet och ljuddatorn är vid höga temperaturer. Undvik att vidröra vattnet och ljuddatorn. Använd ögonskydd, skyddande labbrock och skyddshandskar. - När badljudsdonet har nått 70 °C, ta bort Lipidflaskan från vakuumdickatorn. Sänk om möjligt lamporna i arbetsområdet.
- Förbered en hjälplösning på 10% propylenglykol, 10% glycerol, 80% PBS (% v/v/v) och tillsätt 10 ml av den till Lipidflaskan (se steg 1.1.1 och "Lipid Formula Sheet").
OBS: Om du använder en vanlig luftförskjutningspipett, var försiktig vid hantering av viskösa lösningsmedel som propylenglykol och glycerol. Aspirera och doppa volymen långsamt och vänta tills restvolymen når botten av pipettspetsen. Se till att vätskan inte klamrar sig fast på pipettspetsens utsida när volymerna överförs genom att långsamt röra sig. - Täck Lipidflaskan, ta bort aluminiumkåpan och snurra försiktigt flaskan i badljudsdonet i 15 minuter medan ultraljudsbehandlingen är på för att lösa upp lipiderna. Se till att Lipid Vials nacke är ovanför vattnet. Kontrollera ibland om injektionsflaskan är ordentligt stängd.
- Ta ibland bort LipidFlaskan från vattenbadet. Håll den kort mot ljuset för att kontrollera om innehållet är helt upplöst (bild 1E).
- Om Lipid Vial-innehållet inte homogeniserar, ta bort LipidFlaskan från badljudsdonet. Säkra locket, snurra mer aggressivt och sätt tillbaka det till badljudsdonet.
- Ta bort Lipidflaskan från badljudsdonet och stäng av badljudsdonet. Torka Lipid Vial-utsidan med pappershanddukar och sätt tillbaka Lipid-flaskan.
- Täck LipidFlaskan med aluminiumfolie och kyl LipidFlaskan vid rumstemperatur i ett svalt, mörkt, torrt område i 10 minuter.
- Alikvot lipidflaskans innehåll: ca 2 ml lipidlösning i 3 ml borosilikatglas klara serumflaskor (7 mm inre mundiameter, 13 mm yttermundiameter).
OBS: Vissa protokoll kan använda 1,5 ml lipidlösning i injektionsflaskan7. - Kapa serumflaskan med lyofililiknande grå klorbutylgummiproppar (7 mm innermundiameter, 13 mm yttermundiameter) och säkra gummiproppen med avskalade aluminiumtätningar (13 mm yttermundiameter) och en crimper (Figur 1F).
- Dammsuga, avgasa och tryck på lipidlösningen i var och en av serumflaskan4,5,7 ( figur2).
OBS: Se "Andra protokoll och data" för instruktioner om hur du monterar gasväxlaren och mer information.- Stäng varje ventil mellan och inklusive tryckventil A och gascylinderventil (figur 2). Anslut serumflaskan till grenrörsnålarna, öppna sedan motsvarande grenrörsventiler, öppna sedan vakuumventil A och vakuumventil B och dammsuga vid -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) i 5 minuter för att avlägsna atmosfärisk luft. Dammsug INTE ut någon av vätskan (se "Andra protokoll och data" steg S3 till S3.1.5).
VARNING: Vakuumpumpen kan brista om den hanteras felaktigt. Använd inte vakuumpumpen med organiska, sura eller grundläggande kemikalier. - När vakuumet fortfarande är på, håll en serumflaska (för att förhindra att den svänger) och knacka den snabbt med en penna eller markör för att avgasa. Fortsätt knacka tills inga bubblor bildas och det finns inga bubblor i injektionsflaskan. Låt INTE någon vätska dammsugas ut. Pausa tryckningen om det behövs. Upprepa för alla anslutna serum injektionsflaska. Efter avgasning av alla serumflaskan, STÄNG vakuumventil A och vakuumventil B och stäng av vakuumpumpen (se "Andra protokoll och data" steg S3.2 till S3.2.3).
- När serumflaskan fortfarande är ansluten till nålen och vakuumpumpen avstängd, vrid långsamt gascylinderventilen 1/16 till 1/8 (ca 22,5 till 45 ° av full varv) moturs för att delvis öppna, öppna sedan T-Handle Valve och VRID LÅNGSAMT luftregulatorventilen medurs till 3 psi (20,7 kPa) mätare. Öppna sedan tryckventil A och tryckventil B (se stegen "Andra protokoll och data" S3.3 till S3.3.21).
VARNING: Gasflaskan decafluorobutane är under tryck och kan explodera vid uppvärmning. Håll dig långt från värme och slagkraft. Dekafluorbutangas kan orsaka syreförskjutning och kvävning. Använd rätt ögonskydd och handtag i en rökhuva. Om den hanteras felaktigt är det möjligt att dammsuga gascylindern, vilket kan orsaka snabb avtryck och implosion. Om gascylinderventilen öppnas mer än 1/8 varv kan luftregulatorn skadas. - Efter 30 s tryck (mätaren ska fortfarande läsa 3 psi (20,7 kPa)), stäng alla grenrörsventiler med serumflaskor, koppla bort serumflaskorna, mantla nålarna och STÄNG gascylinderventilen.
- Avlasta det inbyggda trycket genom att delvis öppna en enda grenrörsventil tills luftregulatorns mätnål går till sitt viloläge. Stäng sedan allt mellan och inklusive grenrörsventilerna och T-handtaget.
- Stäng varje ventil mellan och inklusive tryckventil A och gascylinderventil (figur 2). Anslut serumflaskan till grenrörsnålarna, öppna sedan motsvarande grenrörsventiler, öppna sedan vakuumventil A och vakuumventil B och dammsuga vid -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) i 5 minuter för att avlägsna atmosfärisk luft. Dammsug INTE ut någon av vätskan (se "Andra protokoll och data" steg S3 till S3.1.5).
- Märk serumflaskan och förvara dem vid 4 °C och i mörker. Se till att alla gasväxlarventiler är stängda och att vakuumpumpen stängs av efteråt.
OBS: Serumet ska vara stabilt i upp till 4 månader i detta tillstånd. I det här steget kan protokollet återupptas senare, högst efter 4 månader.
3. Dekafluorbutan injektionsflaska
- Med rena, tomma 3 ml borosilikatglas klara serumflaskor (7 mm innermundiameter, 13 mm yttermundiameter), kapa dem med lyofiliseringsliknande grå klorbutylgummiproppar (7 mm innermundiameter, 13 mm yttre mundiameter) och säkra gummiproppen med rivning av aluminiumtätningar (13 mm yttre mundiameter) och en crimper4, 7,8.
- Följ steg 2.9.1 för att dammsuga den atmosfäriska luften (se "Andra protokoll och data" steg S3.1 till S3.1.5).
- Hoppa över avgasningen och följ steg 2.9.3 till 2.9.5 för att trycksatt vialen igen (se "Andra protokoll och data" steg S3.3 till S3.3.21).
- Märk dekafluorbutan injektionsflaskan och förvara dem vid 4 °C och i mörker. Se till att alla gasväxlarventiler är stängda och att vakuumpumpen stängs av efteråt.
OBS: Serumflaskor fyllda med dekafluorbutangas behövs för droppkondensationen. De bör vara stabila i upp till 4 månader i detta tillstånd. I det här steget kan protokollet återupptas senare, högst efter 4 månader.
4. Droppformation
- Ta ut en hydratiserad lipidlösning i serumflaskan (från steg 2.10) från kylskåpet.
- Använd en decapper, ta bort aluminiumtätningen på serumflaskan och överför 1 ml lipidlösning till en 1,85 mL borosilikat glasprovflaska (med ett fenoliskt skruvlock) genom att låta lipidlösningen flöda ner i innerväggen. Skapa inte bubblor.
- Om det finns någon återstående lipidlösning i serumflaskan, följ steg 2.9–2.10 för att avgasa och återpressa serumflaskan för lagring (se "Övriga protokoll och data" steg S3 till S3.3.21).
- Med provflaskan på 1,85 ml flödar försiktigt in dekafluorbutangas i provflaskans huvudutrymme med gasväxlaren (se figur 2 för de specifika ventilnamnen).
- Se till att alla ventiler på gasväxlaren är ordentligt stängda och att pumpen är avstängd.
VARNING: Om det görs felaktigt är det möjligt att dammsuga ut gasflaskan och orsaka snabb dekompression och implosion. - Öppna en grenrörsventil och lossa försiktigt motsvarande nål från grenröret.
VARNING: Vasst föremål, undvik kontakt/piercing. - Öppna tryckventil A och tryckventil B och vrid gascylinderventilen 1/16 till 1/8 (ca 22,5 till 45 ° av full varv) moturs för att delvis öppna och sedan öppna T-Handle Valve.
VARNING: Öppna inte gascylinderventilen mer än så eftersom den kan orsaka skador på luftregulatorn. - Ta bort provflaskan med lipidlösningen och flytta den så att grenrörsnålen är ovanför vätskeluftsgränssnittet inuti injektionsflaskan. Håll flaskan där.
-
Vrid långsamt luftregulatorventilen medurs tills luftregulatorns mätnål rör sig något från sitt viloläge och perfluorkarbongasen försiktigt strömmar ut ur grenrörsnålen. Låt perfluorkarbongasen försiktigt flöda in i injektionsflaskans huvudutrymme i 30 s. Skapa inte bubblor. Justera luftregulatorventilen vid behov.
OBS: Vätske-luft-gränssnittet bör vara något stört av gasflödet av dekafluorobutan. Eftersom systemet nu är öppet kan luftregulatorns mätare inte avläsa trycket ordentligt. - Efter 30 s, försiktigt och snabbt locket provflaskan utan att flytta injektionsflaskan för mycket.
- Stäng gascylinderventilen (medurs), T-handle Valve, Air Regulator Valve (moturs), Tryckventil A, tryckventil B och grenrörsventil.
- Mantla försiktigt nålen.
- Märk provflaskan och försegla nacken med vaxfilm som går medurs(figur 3A och 3B).
OBS: Figurerna 3B till 3F visar endast 30% Pyro-lipidformulering.
- Se till att alla ventiler på gasväxlaren är ordentligt stängda och att pumpen är avstängd.
- Förvara provflaskan i mörker och vid 4 °C i minst 10 minuter eller upp till 24 timmar.
OBS: I detta steg kan protokollet återupptas senare, högst 24 timmar. - Placera ca 100 g torris (koldioxid) i en isolerad behållare och placera vanlig is i en annan isolerad behållare. Hämta beredda dekafluorbutan serumflaskor som nämns i steg 3, två 3,81 cm (1,5 tum) 20-gauge nålar, en 1 ml plastspruta (lossa kolven före användning), en 200 mL behållare, metalltänger och en termometer (-20 till 100 °C).
OBS: Om du bara gör mikrobubblor, då finns det inget behov av isopropanol, torr is och is. - Placera provflaskan med lipidlösningen i den mekaniska omröraren och omrör i 45 s (figur 3C).
- Efter den mekaniska omrörningen, stå provflaskan höger sida upp, avskärmad från ljus och starta en 15 minuters nedräkning för att kyla ner injektionsflaskan och storleksvalmikrobubblorna 8,17.
- När nedräkningen på 15 minuter har nått 10 minuter (5 minuter kvar på nedräkningen), fyll en behållare med ca 200 ml isopropanol och kyl den till -20 °C med torr is med metalltänger.
OBS: Måltemperaturen är -15 till -17 °C men isopropanolet värms upp under hanteringen av mikrobubblorna.
VARNING: Isopropanol är brandfarligt. Håll dig borta från värme och gnistor. Torris kan orsaka hudskador. Hantera med tång. Använd handskar, ögonskydd och en skyddande labbrock.
- När nedräkningen på 15 minuter har nått 10 minuter (5 minuter kvar på nedräkningen), fyll en behållare med ca 200 ml isopropanol och kyl den till -20 °C med torr is med metalltänger.
- När mikrobubblorna har storleksvalts i 15 minuter letar du efter den storleksvalda partitionen inuti provflaskan (figur 3D).
- Håll provflaskan rätt åt sidan, ta försiktigt bort provflaskan och dra ut ca 0,7 ml av den nedre skiljeväggen med en 1,5 tums 20-gauge nål fäst vid en 1 ml plastspruta. Se till att ingen av den övre partitionen dras tillbaka. Snärta inte sprutan för att ta bort luftfickorna.
- För in en annan 20-gauge nål i en decafluorobutane serumflaska (hålla nålen nära toppen av serumflaskan) för att ventilera och sätt sedan in nålen / sprutan med de storleksvalda mikrobubblorna.
- Överför långsamt de storleksvalda mikrobubblorna. Luta injektionsflaskan och vinkla sprutan för att låta vätskan glida ner i innerväggen på dekafluorbutan serumflaskan.
- När all storleksvald mikrobubblelösning har överförts, ta bort nålen med sprutan men håll in ventilationsnålen för att lindra undertrycket (figur 3E).
- Om du bara gör storleksvalda mikrobubblor, stanna här. Håll ventilationsnålen i och nära toppen. Håll injektionsflaskan i mörker och vid rumstemperatur.
- Tillsätt små mängder torris eller rumstemperatur isopropanol till isopropanolbadet för att säkerställa att badtemperaturen är mellan -15 till -17 °C.
- Med den 20-gauge ventilationsnålen insatt nära toppen av serumflaskan, placera serumflaskan i isopropanolbadet, håll mikrobubblenivån under nivån på isopropanol men injektionsflaskans hals ovanför den och virvla intermittent serumflaskan i 2 minuter för att kondensera mikrobubblorna.
OBS: Detta steg ändrades från det arbete som utförts av Sheeran et al.6- Snurra inte serumflaskan kontinuerligt i isopropanolen och låt inte lösningen frysa. Snurra i ca 5 s och lyft serumflaskan ur isopropanolen. Kontrollera om det finns iskärnor och fortsätt virvla i isopropanol. Om det finns isbildning, snurra serumflaskan i luften tills den försvinner.
- Efter 2 minuters kondens, ta bort serumflaskan från isopropanolbadet och ta bort ventilationsnålen.
OBS: Mikrobubblorna ska ha kondenserats till droppar, vilket framgår av förändringen i genomskinlighet (figur 3E jämfört med figur 3F för 30% Pyro-lipidformulering). - Torka serumflaskan, märk den och placera den på vanlig is i en mörk, isolerad behållare tills den är klar att användas. Oöppnade (intakt aluminiumtätning) droppar bör vara stabila i detta tillstånd i upp till 6 h så länge den smälta isen byts ut efter behov.
- När du är klar att använda, ta bort aluminiumtätningen med decapper. Förvara droppar (även öppna injektionsflaska) på is och i mörker när de inte används. Håll mikrobubblor i mörker och rumstemperatur.
5. Morfologisk och optisk karakterisering
- Förbered 1% Triton genom att: tillsätt 5 ml Triton X-100 i 500 ml PBS (1x, pH 7.4) och rör om med en magnetisk omrörningsstång tills den är homogen14.
OBS: Triton X-100 mycket trögflytande. Om du använder en vanlig luftförskjutningspipett, var försiktig vid hantering. Aspirera och doppa volymen långsamt och vänta tills restvolymen når botten av pipetten. Se till att vätskan inte klamrar sig fast på pipettspetsens utsida när volymerna överförs genom att långsamt röra sig. - Förbered droppar (steg 4). Om mikrobubblor också karakteriseras, samla en liten volym av de storleksvalda mikrobubblorna före kondens (steg 4.9).
- Storlek på mikrobubblor eller droppar på en Coulter-räknare (CC) från 0,2 till 6 μm för att erhålla storleksfördelningar och koncentrationer (figur 4).
- Fyll en ren 20 ml cuvette med 10 ml CC elektrolyt som filtrerades genom 0,2 μm porpolyeterulfonmembranfilter. Mät den på CC med tre körningar för att få en baslinje.
- Tillsätt 5 μL mikrobubble- eller droppprov i samma CC-elektrolyt och blanda försiktigt.
OBS: 2 till 20 μL prov kan tillsättas beroende på hur koncentrerat provet är. - Kör provet på CC (3 körningar), subtrahera den genomsnittliga baslinjen och beräkna storleksfördelningen och koncentrationen (tal per ml).
- Mät droppabsorbansen med UV-Vis spektroskopi (bild 5).
OBS: Figur 5 visar endast 30 % pyrolipidformulering.- På UV-Vis spektrofotometer ställer du in absorbansmätningen som 800 nm till 300 nm våglängder med 0,5 nm steg och möjliggör baslinjekorrigering.
- Använd en ren 1 cm banlängd cuvette fylld med PBS, utför en baslinjemätning. Se till att volymen är tillräckligt hög för att korsa spektroscopestrålens bana.
- Späd pyroläppsdroppar i PBS (rekommendera 2 μL till 500 μL droppar till 2000 μL spädning) och blanda genom pipetting.
OBS: Virvel inte, annars kommer församlingarna att förstöras. - Överför de utspädda dropparna till en rengjord cuvette och mät absorbansen. Ändra utspädningarna vid behov.
- Upprepa steg 5.4.1 till 5.4.4 men använd 1% Triton i stället för PBS. Efter utspädning, överför provet till en förseglingsbar/kapsejsad injektionsflaska och virvel i 30 s innan du mäter.
- Mät fluorescensen hos mikrobubblor eller droppar (figur 6).
OBS: Figur 6 visar endast 30 % pyrolipidformulering.- På fluorescensspektrofotometern ställer du utstötningsvåglängden som 410 nm och utsläppsvåglängden varierar från 600 till 750 nm med 1 nm steg.
- Mät pbs-spädningsflödets fluorescens för att få en baslinje med en cuvette som är kompatibel med fluorescensspektrofotometern.
- Späd ut pyroläppsmikrobubblorna eller dropparna i PBS (rekommendera 0,5 μL till 10 μL droppar till 2000 μL spädning) och blanda genom pipettering.
OBS: Virvel inte, annars kommer församlingarna att förstöras. - Överför det utspädda provet till den rengjorda, utgångsvärdet cuvette och mät fluorescensen. Ändra utspädningarna vid behov och undvik signalmättnad.
- Upprepa steg 5.5.1 till 5.5.4 men använd 1% Triton i stället för PBS. Efter utspädning i 1% Triton, överför det utspädda provet till en förseglingsbar/täckt injektionsflaska och virvel i 30 s innan du mäter. Lägg till tillräckligt med volym för att säkerställa att bubblor som genereras från virvel är ovanför laserbanan.
OBS: Provet i Tritons fluorescenssignal kommer att vara mycket högre än i PBS på grund av fluorescens som inte släcker (figur 6).
6. Förångningsavbildning
- Fyll en vattentank i lämplig storlek med avjoniserat vatten och låt den vila i 24 timmar för att balansera gaserna i vattnet med atmosfären.
- Förbered droppar och håll på is och i mörker tills de används.
- Gör ett flöde fantomrör från 2% agar som beskrivs av Pellow et al.18 Sänk ner fantomen i en vattentank uppvärmd till 37 °C.
- Värm upp PBS till 37 °C och flöda genom fantomen.
- Med ett preklinisk ultraljudssystem och 21 MHz linjär matrisgivare (se Materialförteckning),justera vyn till flödesfantomen, ställ in den på B-lägesavbildning, ställ in utgångstrycket och ta videor eller bilder för att få baslinjer vid varje tryck.
- Späd 20 μL av droppen till 50 ml 37 °C PBS och blanda försiktigt. Överför lösningen till en 30 ml plastspruta och tryck lösningen genom agarfantomen.
- Håll samma inriktning som steg 6.5, öka utgångstrycket tills förångning observeras (ljusa fläckar i fantomen, se figur 7).
OBS: Figur 7 visar 30% Pyro-lipid droppprov. Denna kommersiellt tillgängliga 21 MHz linjära matrisgivare kan både avbildning och förångande droppar.
Representative Results
Förkondenserade, storleksvalda mikrobubbleprover (n = 3) och postkondenserade droppprover (n = 3) var dimensionerade på en Coulter Counter (CC) med en bländare på 10 μm. En begränsning av bländaren på 10 μm är att den inte kan mäta partiklar som är mindre än 200 nm, vilket kan förvrida medelstorleken och koncentrationen. Figur 4 visar storleksdata för var och en av formuleringarna av pyrolipidinnehåll. Tabell 1 visar statistik baserad på storleksdata. Med hjälp av ett förhållande av pre- och postkondenserade medeldiametrar visade resultaten att 0% Pyro-lipid formuleringen hade den minsta genomsnittliga diametern skift på 1,72 ± 0,02. Den 50% Pyro-lipid formuleringen hade den största medeldiametern på 2,38 ± 0,08. 1% Pyro-lipid droppe prov hade den högsta observerade koncentrationen vid (2,71 ± 0,13) × 1010 /mL medan 40% Pyro-lipid droppe prov hade den lägsta observerade koncentrationen vid (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Storleksdata visade att 10% Pyro-lipid droppe prov hade den minsta topp dimetern vid 261 ± 13 nm medan 50% Pyro-lipid droppe prov hade den största på 390 ± 55 nm. I allmänhet minskade koncentrationen och medeldiametern ökade i och med pyroläppidhalten. Eftersom de postkondenserade proverna är baserade på prekursormikrobubbleprovet inträffade trenden för båda typerna av ultraljudskontrastmedel. När pyroläppidhalten ökade började en mikrobubble subpopulation (med en toppstorlek på cirka 2000 μm) bildas. Denna sekundära topp var inte närvarande i 0% Pyro-lipid mikrobubble prov och mest uppenbart i 40% och 50% Pyro-lipid populationer.
Figur 5 visar representativa absorbansmätningar av 30 % pyroläppsdroppprov. Toppen av det intakta provet i PBS var 700 nm medan det störda provet i Triton flyttade toppen till 671 nm. Detta visade att de intakta sammansättningarna har olika optiska egenskaper jämfört med de enskilda, omonterade lipidkomponenterna.
Figur 6A visar representativa fluorescensmätningar av det förkondenserade mikrobubbleprovet medan figur 6B visar prov efter kondenserad droppe med 30 % pyrolipid. Det intakta provet i PBS hade en fluorescenstopp på 704 nm medan den störda formen hade en topp på 674 nm. Om du subtraherar det störda området under kurvan med det intakta området under kurvan, och om du delar skillnaden med det störda området under kurvan, blir det släckningseffektivitet som beräknas vara 98,61 % respektive 98,07 % för mikrobubbleprovet pyrolipid och droppprovet.
För att demonstrera droppar som omvandlas till mikrobubblor, utspädd droppar avbildades och förångades i en 37 °C flöde fantom med ett ultraljudssystem. Figur 7 visar representativa ultraljudsbilder av 30% Pyro-lipid droppe prov avbildas vid olika tryck. Vid låga tryck (figur 7A )fanns det mycket lite signal, bara bakgrundssignal från luftbubblor fastnade från agarsyntesen. Detta beror på att droppar är icke-ekogena och inte sprider ultraljud. Vid en något hög effekt genererades några mikrobubblor (figur 7B) vilket framgår av utseendet på ljusa fläckar. I och med att trycket ökade genererades fler mikrobubblor (figur 7C och 7D). Detta visade också att dropparna inte spontant kommer att förångas vid 37 °C.
Bild 1: Bilder av stegen för att bilda 30% Pyro-lipidlösning. A) Lipidpulver plus Pyro-SPC i kloroform. B) Lösning för upplösning tillagd. C) Lipidfilm torkad och belagd på innerväggen av flaska. D) Lipidflaska insvept i aluminiumfolie (exteriör folie tejpad för återanvändning). E) Hydratiserad lipidlösning. F) Lipidlösning i serumflaska. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Den tiogrensrörliga gasväxlaren. Ventilerna som refereras i protokollet är märkta. Se kompletterande fil "Andra protokoll och data" för instruktioner om hur du monterar gasväxlaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: A) Lipidlösningarna hos de 7 formuleringarna (0– 50 % Pyro-SPC) i prov injektionsflaska. Figurerna B till D visar bilder av de åtgärder som vidtagits för att göra 30% Pyro-lipiddroppar. B) 30 % Pyrolipidlösning i en provflaska. C) Efter agitation. D) 15 min storleksvalt. E) Nedre partitionen överförs till decafluorobutane injektionsflaska. D) Efter kondensation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Coulter Counter (CC) storleksdata för de storleksvalda mikrobubblorna och droppproverna med olika pyroläppade skalhalter (n = 3). De helgröna linjerna representerar mikrobubblor och de prickade cyanlinjerna representerar droppar. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30 % Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) De totala observerade koncentrationerna av mikrobubblor och droppprover från CC baserat på Pyro-SPC-halten i skalet. Alla felstaplar anger standardavvikelse. Alla mätningar utfördes med en bländare på 10 μm som har ett storleksintervall på 200 nm till 6000 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa ultraviolett synliga (UV-Vis) spektroskopiabsorbansmätningar från 300 till 800 nm av det postkondenserade 30% Pyro-lipiddroppar som späds i PBS och i 1% Triton. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativa fluorescensutsläpp från 600 till 750 nm upphetsad vid 410 nm. A) Storleksvalt, förkondenserat 30% Pyro-lipid mikrobubble prov i PBS och i 1% Triton. B) Efterkondenserat 30% Pyro-lipiddroppar i PBS och i 1% Triton. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Representativa ultraljudsbilder av en 37 °C agarflödesfantom tagen med en preklinisk 21 MHz linjär matrisgivare i B-läge (se Materialförteckning). Den vänstra kolumnen (figurerna A, C, E,& G) visar PBS-kontroller. Den högra kolumnen (figurerna B, D, F,& H) visar 20 μL postkondenserat 30% Pyro-lipiddroppeprov utspädd till 50 ml 37 °C PBS. Varje rad representerar lågtryck på frifält, vilket uppskattades utifrån det arbete som Sheeran et al.8 utfört De gula trianglar indikerar fokusdjup. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Metod | Agent | Pyroskal % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| KUBIKCENTIMETER | Bubblor | Conc. [/ml] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1,47 ± 0,05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| KUBIKCENTIMETER | Bubblor | Topp [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| KUBIKCENTIMETER | Bubblor | Medelvärde [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| KUBIKCENTIMETER | Bubblor | Median [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| KUBIKCENTIMETER | Droppar | Conc. [/ml] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1,75 ± 0,18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| KUBIKCENTIMETER | Droppar | Topp [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| KUBIKCENTIMETER | Droppar | Medelvärde [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| KUBIKCENTIMETER | Droppar | Median [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tabell 1: Storleksdatastatistik för mikrobubblor och droppprover med olika Pyro-SPC-innehåll från Coulter Counter (CC) (n = 3). Alla fel indikerar standardavvikelse.
Kompletterande information - Lipid Formelblad: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande information - Andra protokoll och data: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Efter att ha tillsatt alla lipidkomponenter (steg 1.2 och 1.4.5, figur 1A),tillsattes en lösning av kloroform och metanol (och vatten om fosfatidsyralipider som DSPA förekommer) för att säkerställa att pyroläppid- och icke-pyrolipidkomponenterna var helt homogeniserade (steg 1.5, figur 1B). För att förhindra bildandet av lipidalskel med heterogen lipidkomposition torkades de upplösta lipiderna och belades på injektionsflaskans vägg som en tunn film (Figur 1C). Beläggningen (steg 1.6) gör också hydreringen (steg 2.1 till 2.4) enklare eftersom den ökar ytan på den torkade filmen. Torkningen (steg 1.6, figur 1C)och dammsugning (steg 1.8, figur 1D)gjordes för att säkerställa att kloroformen och metanolen helt avdunstades eftersom dessa kemikalier kan störa bildandet av mikrobubblor. Även om protokollet kan skalas ned för att göra lipidlösningsvolymer så låga som 1 ml, kan större volymer minska variationen mellan injektionsflaskan. Även om detta kan riskera att försämra Pyro-SPC när den inte används, var förvaringsförhållandet för lipidlösningen (steg 2.9 till 2.10) avsett att minska den risken. Avgasningssteget med gasväxlaren (steg 2.9.2, figur 1F och figur 2) tjänar till att eliminera så mycket syre som möjligt för att förhindra oxidering. Det rekommenderas inte att lipidlösningar som innehåller porfyrinläppider lagras medan atmosfäriska gaser fortfarande löses upp i lösningen (figur 1E).
I steg 2.10 ligger lipidlösningen i en serumflaska med trycksatt huvudutrymme, liknande hur det kliniskt godkända ultraljudskontrastmedlet perflutren lipidmikrosfärer säljs (liknande figur 1F). Internt arbete har visat att stabila mikrobubblor inte kunde genereras via mekanisk agitation med närvaro av Pyro-lipider om locket var ett mjukt material som gummiproppen. Lipidlösningen överfördes därför till en provflaska med ett fenollock som inte är gummi (steg 4.1–4.4, figur 3A och 3B). När dekafluorbutangasen flödade in i provflaskan (steg 4.1–4.4) skulle den tätare dekafluorebutan tränga undan den atmosfäriska luften i provflaskans huvudutrymme. För närvarande är det okänt varför Pyro-lipider inte kan bilda mikrobubblor med gummiproppar. Utan Pyro-lipider kan stabila mikrobubblor tillverkas direkt i serumflaskan med gummiproppar4,7. Således rekommenderas att använda gasväxlaren för att avgasa och återpressa serumflaskan och sedan omröra själva serumflaskan för icke-Pyro-lipidformuleringar4,5,6,7 (se "Andra protokoll och data"). Fördelen med att mekaniskt kunna agitera i serumflaska är att huvudutrymmet kan trycksatts och storleksval kan göras genom att vända serumflaskan upp och ner8. I detta protokoll överfördes 0% Pyro-lipid formuleringen till en provflaska (steg 4.1 till 4.4) för att överensstämma med formuleringarna som innehöll Pyro-lipider. Dessutom resulterar längre acyl lipidkedjelängder i stabilare droppar på grund av bättre van der Waals interaktioner19. Lipidskalets sammansättning valdes baserat på vad som var kommersiellt tillgängligt, 18-asylkedjelängd för alla lipidtyper. DSPE-PEG5K införlivades i hela formuleringen (steg 1.1) eftersom närvaron av polyetylenglykolkedjor förhindrar sammanförande av strukturer via motbjudande steriska krafter19. Under lipidhydrering sattes badets ljuddatorbad till 70 °C (steg 2.1) så högt nog att fullt ut skingra lipidfilmen med 18 akrylkedjelängd18. För längre acylkedjelängder kommer högre temperaturer att krävas.
Högre pyrolipidbelastning skulle öka koncentrationen av optiskt absorberande och fluorescerande komponenter, vilket kan önskas för vissa tillämpningar som drar nytta av maximerad porfyrinbelastning. I och med att pyroläppidhalten ökade minskade dock den observerbara droppkoncentrationen och diametern ökade (figur 4 och tabell 1). Detta illustrerar en kompromiss mellan optisk fluorescens och absorbansegenskaper kontra droppkoncentration och diameter. För forskare som måste prioritera små diametrar för in vivo-ackumulering genom små läckande kärl eller om en hög koncentration av droppar behöver injiceras, kan det hända att ökad pyrolipidbelastning inte är värt ökningen av droppdikmetern eller minskningen av droppkoncentrationen. Om höga droppkoncentrationer och/eller små droppdiametrar är av största vikt bör liknande storleksanpassade medföljande diagnostiska medel övervägas i stället för Pyro-lipider. Medan 1% Pyro-lipid droppar inte resulterade i en minskning av koncentrationen eller ökningen av storlek, 1% Pyro-lipid lastning kan vara för låg för att rimligen kunna upptäckas från vävnad bakgrund fluorescerande. Flexibiliteten hos porfyrin moiety ger dock flera alternativ för funktionalisering som kommer att ge alternativa kvantifieringsmedel som är mer lämpliga för lågkoncentrationstillämpningar. Pyro-lipider kan till exempel kelateras med koppar-64 för positonsutsläppstomografi och gammaräkning20, eller med palladium för spårmetallk kvantifiering med hjälp av masspektrometri, eller med mangan för magnetisk resonanstomografi14.
Medan vissa experiment kanske bara kräver en liten volym av dropplösningen, behövs 1 ml lipidlösning för att fylla provflaskan på 1,85 ml. Goertz et al. visade att förändringar i hantering, huvudutrymmestryck, vätske-gasförhållande och till och med injektionsflaskan kan alla påverka mikrobubblor17. Injektionsflaskans temperatur under agitation och storleksval kan också påverka storleksfördelningen. För de metoder som optimeras av slutanvändaren är det därför viktigt att vara så konsekvent som möjligt när man gör droppar. Oöppnade droppar kan frysas (-20 °C) och tinas senare för framtida användning, men detta kommer att påverka storlekspopulationerna.
Agitationsproceduren som aktiverar en lipidlösning till mikrobubblor ger inte en morfologiskt homogen population (steg 4.6). snarare är provet fyllt med mikrobubblor, multilamellar vesiklar, liposomer och micelles18,21,22. Medan mikrobubblor varierar över mikron- och nanometerområdet, är de andra strukturerna till stor del under 800 nm 23. De storlekstekniker som används skiljer inte mellan dessa olika konstruktioner, och därför måste de poströrda mikrobubbleproverna (steg 4.6, figur 3C)och de postkondenserade droppproverna (steg 4.14, figur 3F) antas som blandningar. Ultraljud-okänsliga enheter (multilamellar vesiicles, liposomer och micelles) är sannolikt bevarade efter kondensation och kommer inte att ändra storlek eftersom de inte har fas-ombytbara kärnor. Eftersom Coulter Counter inte kan skilja mellan dessa olika supramolecular församlingar, bör förändringen i befolkningsstorlek efter kondensation tolkas med antagandet att en viss andel av nanoskala strukturerna är okonverterbara och bidrar till den observerade befolkningen i denna storleksregion. Dessutom bidrar dessa strukturer till de spektroskopiska och fluorescerande signaturerna för dessa prover14. Musestillernas fluorescens- och absorbanssignaturer, liposom/vesiklar och droppar är alla likartade, inklusive deras grad av fluorescenssläckande14. Det är därför viktigt att tänka på att det finns en blandning av sammansättningar i figurerna 3C–3F, figur 4,pbs-utspädd prov i figur 5och pbs-utspädd prov i figur 6.
Efter storleksval och före kondens (steg 4.9) är det möjligt att eliminera icke-bubbelenheterna genom att centrifugera mikrobubbleprovet för att separera de flytande bubblorna från de icke-flytande aggregaten enligt beskrivningen i Feshitan et al.21 Graden av separation kan kontrolleras genom att justera spinnkraften och varaktigheten. Experiment av mikrobubblekondensering av sådana storleksisolerade prover visade dock att användning av de större prekursormikrobubblepopulationerna som väljs med hjälp av storleksisoleringsförfaranden gav större droppar (se "Andra protokoll och data" Steg S5 för posts spunnen bubbla och droppstorlek). Eftersom en avsedd tillämpning av droppar som produceras med detta protokoll är en plattform för passiv extravasation och ackumulering på grund av deras lilla storlek jämfört med mikrobubblor4,8, önskades dropppopulationer som är så små som möjligt. Således använde detta protokoll post-agitated microbubble prover som inte var storlek-isolerade via centrifugation, även om det innebar ultraljud-okänsliga micelles, liposomer och vesiklar var närvarande i den slutliga lösningen. Detta innebär att kvantifieringsförfaranden för biodistribution kommer att härleda signal för alla injicerade strukturer och inte begränsas till bara dropparna. Men eftersom dessa strukturer av liknande storlek sannolikt ackumuleras via en passiv mekanism som främst dikteras av storlek, är det inte misstänkt att detta bör ändra de viktigaste slutsatser som kan göras om denna plattform ska användas in vivo, även om alla dessa aspekter bör beaktas individuellt beroende på det sammanhang där plattformen kan användas. Tester med hjälp av experimentella armar med och utan ultraljud kan utföras för att säkerställa att det är ultraljudskänsliga droppar som är ansvariga för eventuella förändringar i biodistributionen, eftersom endast perfluorkarbonkärnan i lösningen kommer att svara på ultraljud.
Efter agitation vilade injektionsflaskan i 15 minuter och en partition observerades i injektionsflaskan (figur 3C jämfört med 3D). Storleksval via flytkraft är en enkel metod för att eliminera de större strukturerna / bubblorna från en aktiverad mikrobubblelösning8,17. I detta fall avlägsnades partiklar med diametrar över 5 μm mestadels efter storleksval (figur 4). Storleksvalets omfattning kan justeras genom att styra längden på storleksvalet17. Sheeran et al. har visat att inte storleksval kan resultera i genererade mikrobubblor som ocklusiv vaskulatur8.
Perfluorkarboner har fördelen att vara biologiskt inerta7. Medan dekafluorbutans kokpunkt är -1,7 °C, över kroppstemperaturen, förångas dropparna inte omedelbart när de utsätts för 37 °C (figur 7B). Eftersom dropparna är metastabila vid 37 °C behövs ytterligare akustisk energi för att förånga dropparna till mikrobubblor7,9. Poprosky et al. har visat porfyrin droppar kondenseras via trycksatt22. Detta är en livskraftig och till och med viktig metod när man använder mindre täta perfluorkarboner, men höga tryck kan förstöra vissa bubblor i processen. Octafluoropropan (C3F8) har en kokpunkt på -36,7 °C, så både kylning och trycksättning behövs för droppkondens. Det lättare perfluorkarbonet leder dock till mindre stabila droppar. Dodecafluoropentan (C5F12)kan leda till stabilare droppar med en kokpunkt på 28 °C. Det är dock en vätska vid rumstemperatur och behöver starkare akustiska energier för att förångas. Valet av den innehållande gasen i ultraljudskontrastmedlet bör därför överväga villkoren för dess avsedda biologiska tillämpning utöver parametrarna för dess tillverkning. I detta protokoll var isopropanolbadet för kondens inställt på -15 till -17 °C (steg 4.7.1 och steg 4.13) medan andra protokoll användes -10 °C 5,6. Även med en gemensam dekafluorbutankärna kan kondensationstemperaturen variera beroende på hjälpsammansättning, total lipidkoncentration och lipidskalkomposition. Om du använder andra formuleringar kan optimering krävas för att säkerställa korrekt droppkondens utan att lösningen fryser.
Eftersom dropparna är mindre och stabilare än deras mikrobubbleprekursor7, kan de dra bättre nytta av passiva ackumuleringsmekanismer för att extravasera i vissa vävnader av intresse, såsom den förbättrade permeabiliteten och retentionseffekten av vissatumörtyper 4,24. Med fluorescerande, optiskt absorberande och akustiska metoder för detektion14är det möjligt att använda en enda formulering för att kvantifiera upptaget. Dessutom kan denna plattform användas för att undersöka om akustisk förångning av droppar kan förbättra levererad agentfraktion utöver passiva nivåer16. För att kvantifiera biodistribution av medlet i vävnader och organ av intresse efter injektionen bör en känd mängd pyroläppiddroppar injiceras i djuret, ultraljud kan eller får inte appliceras beroende på kontrolluppsättningen, djuret bör offras en förspecificerad tidpunkt och organen bör avlägsnas och vägas. Organen bör homogeniseras, filtreras, spädas ut i tensid (tvättmedel) för att avcellularisera vävnaden och kvantifieras med fluorescens- eller UV-Vis-spektroskopi för att erhålla injicerade dosprocent per organmassa baserat på Pyrosignalerna. För steg 5.4.5 (figur 5) och steg 5.5.5 (figur 6),triton X-100 tensid (tvättmedel) användes för att störa proverna eftersom det inte är fluorescerande vid 410 nm och dess absorbansvåglängder inte överlappar Pyros.
Mikrobubblor kännetecknades inte av UV-Vis absorbans. Eftersom UV-Vis-spektroscopets laserkälla är parallell med detektorn kan alla stora bubblor sprida ljus bort från detektorn, vilket gör att de verkar mer optiskt absorberande14. Till skillnad från UV-Vis-spektrofotometern är/bör fluorescenspektrofotometerns detektor vara vinkelrät mot laserkällan för att förhindra att källan stör detektorn. UV-Vis användes för att kvantifiera absorbansen av de intakta och störda droppproverna (steg 5.4, figur 5). 300 till 800 nm valdes som absorbansvåglängder som de två huvudsakliga absorbansbanden av pyrolipid, Soretbandet (340 till 500 nm) och Q-bandet (640 till 730 nm), faller inom detta intervall14. När den monteras i en droppe (eller andra supramolecular strukturer) förskjuts pyroläppens Q-bandtopp från 671 nm till 700 nm (figur 5). När denna supramolecular struktur störs av en tensid som Triton, skiftar toppen tillbaka till 671 nm14,15. Baserat på detta skifte är det möjligt att avgöra om Pyro-lipiderna är i ett monterat tillstånd eller i ett stört tillstånd. Förhållandet mellan de två topparna kan användas för att uppskatta förfallet av aggregaten över tiden.
För fluorescensmätningarna (steg 5.5, figur 6)valdes en excitationsvåglängd på 410 nm eftersom den motsvarar Soretbandstoppen för omonterad Pyro-lipid14. Ett utsläppsvåglängdsområde från 600 till 800 nm valdes ut eftersom topparna för de intakta aggregaten i PBS och störda Pyro-lipider i Triton finns inom detta intervall. Förskjutningen och ökningen av fluorescensprover(figur 6)mellan de intakta (704 nm i PBS) och störda (674 nm i Triton) prover inträffade på grund av strukturinducerad släckning. I den monterade formen packades Pyro-lipidmolekylerna tätt ihop så genererade fotoner absorberades av närliggande Pyro-lipidmolekyler. Detta är uppenbart i den intakta kontra störda släckningseffektiviteten. Således är det nödvändigt att späda prover i tensid (tvättmedel) som 1% Triton X-100 för att lindra släckning och maximera signalen för biodistributionssläckning14.
För enkelhetens skull användes samma linjära ultraljudsgivare för att både förångas och avbildas (steg 6.5 och 6.7, figur 7). Denna ultraljudsgivare (Table of Materials) kunde nå de nödvändiga högsta undertryck som behövs för att förånga droppar8. Att fylla en tank med avjoniserat vatten från en kran genererar gaser som löses upp i vattnet (steg 6.1). För att minimera störningar från de upplösta gaserna i vattnet med förångning och avbildning vilade vattnet i 24 timmar i tanken så att gaserna i vattnet kunde balansera med atmosfären (steg 6.1). Alternativt kan det avjoniserade vattnet avgasas med en tillräckligt stor, förseglingsbar behållare ansluten till ett tillräckligt kraftfullt vakuum. Ultraljudsbilderna visade att mikrobubblorna framgångsrikt kondenserades eftersom dropparna var ouppmärksamma/icke-ekogena vid låga tryck (Figur 7B). Det var först vid högre utgångstryck som dropparna förångades till observerbara, ekogena mikrobubblor (Figur 7D, 7F, 7H). Medan det postkondenserade droppprovet innehåller micelles och liposomer/blåsor, är dessa sammansättningar icke-ekogena och endast droppar kan förångas till echogenic mikrobubblor. En PBS-kontroll flödade genom fantomen för att fastställa baslinjebilder (figurerna 7A, 7C, 7E, 7G). När trycket ökade i PBS genererades ingen kontrast. Detta indikerade att högtrycket från givaren inte kunde producera spontan kavitation enbart i ett vattenbaserat medium, och därför kunde alla andra genererade kontraster hänföras till ultraljud kontrast agent används. Om utgångstrycket är för högt kan genererade mikrobubblor förstöras. Genom att stegvis öka trycket och observera den genererade kontrasten kan det optimala trycket hittas8. Droppdroppars halveringstid i cirkulationen kan bestämmas på liknande sätt genom att förånga dropparna är vissa tidsintervall och observera kontrasten som genereras övertid 7.
Sammanfattningsvis skapades multimodala fas-change droppar med varierande Pyro-lipid innehåll med kondenseringsmetoden. Storleksändring visade att det fanns en kompromiss mellan Pyro-lipidbelastning och mikrobubble / droppkoncentration. Karakteriseringar visade att det fanns skillnader i intakta och störda former i både absorbans och fluorescens. Ultraljud imaging visade droppar var icke-echogenic vid 37 °C och var vaporizable i echogenic microbubbles vid tillräckliga tryck. Karakteriseringar visade också potentialen för Pyro-lipid droppar att ersätta följeslagare diagnostiska medel för droppe bio-distribution eller ackumulering tester. Framtida arbete kommer att undersöka tröskelvärden för förångning i lösningen, stabilitet i lösningen och cirkulationstiden in vivo hos nakna möss.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Brandon Helfield för att hjälpa till att bygga gasväxlaren och Dr. Miffy Hok Yan Cheng för tekniska diskussioner. Författarna vill tacka följande finansieringskällor: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute och Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
