Summary
Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.
Abstract
La risoluzione dell'eterogeneità conformazionale di più stati proteici che coesistono in soluzione rimane uno dei principali ostacoli nella caratterizzazione delle terapie proteiche e nella determinazione delle vie di transizione conformazionali critiche per le funzioni biologiche, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica. La reazione di scambio idrogeno/deuterio (HDX) accoppiata con l'analisi spettrometrica di massa top-down (MS) fornisce un mezzo per caratterizzare le strutture e le dinamiche di ordine superiore delle proteine in modo conforme-specifico. Il potere risolutivo conformazionale di questa tecnica dipende fortemente dall'efficienza di separare gli stati proteici a livello proteico intatto e ridurre al minimo il contenuto protico residuo non deuterato durante le reazioni HDX.
Qui descriviamo una variante basata sull'elettroforesi capillare (CE) dell'approccio HDX MS che mira a migliorare la risoluzione conformazionale. In questo approccio, le proteine subiscono reazioni HDX mentre migrano attraverso una soluzione elettrolitica di fondo deuterata (BGE) durante la separazione elettroforetica capillare. Diversi stati proteici o proteoforme che coesistono in soluzione possono essere separati in modo efficiente in base ai loro diversi rapporti carica-dimensione. La differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e molecole di solvente protico riduce al minimo il solvente residuo non deuterato, risultando in un ambiente di deuterazione quasi completo durante il processo HDX. L'interfaccia CE-MS microviale flow-through consente un'efficiente ionizzazione elettrospray delle specie proteiche eluite a seguito di una rapida miscelazione con la soluzione modificante estinguente e denaturante all'uscita dello spruzzatore. L'analisi online top-down della SM misura il livello di deuterazione globale delle specie proteiche intatte eluite e, successivamente, la deuterazione dei loro frammenti in fase gassosa. Questo documento dimostra questo approccio nell'HDX differenziale per i sistemi, comprese le varianti proteiche naturali che coesistono nel latte.
Introduction
Distinguere le specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi e caratterizzare le loro differenze strutturali è importante per monitorare i percorsi di transizione tra queste specie coinvolte in eventi biologici, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica, e comprendere i meccanismi alla base di questi eventi. Le tecniche biofisiche convenzionali non forniscono una soluzione completa a causa delle limitazioni come la risoluzione insufficiente e la perdita di informazioni dinamiche in soluzione. Lo scambio idrogeno/deuterio accoppiato con la spettrometria di massa (HDX MS) è una tecnica che etichetta le caratteristiche strutturali e conformazionali delle proteine con deuterio (2H) attraverso lo scambio tra atomi di idrogeno labile di proteine e 2H dalla soluzione di 2H2O deliberatamente introdotta. I protoni coinvolti nel legame idrogeno o che sono sequestrati dal solvente all'interno della proteina non si scambiano facilmente1. Pertanto, poiché il tasso di cambio in un sito scambiabile dipende fortemente dal suo coinvolgimento in strutture di ordine superiore, le strutture proteiche possono essere rivelate ad alta risoluzione spaziale da MS che sonda l'estensione e il tasso di assorbimento di 2H in base alle diverse masse atomiche tra 1H e 2H. Negli ultimi decenni, HDX MS è diventata una tecnica di eccezionale successo per lo studio delle conformazioni proteiche e delladinamica 2.
Nel classico approccio bottom-up di HDX MS, l'insieme di specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi è proteolizzato senza separazione a livello proteico intatto, rendendo impossibile caratterizzare le singole specie analizzando i frammenti proteolitici risultanti con contenuto di deuterio contorto. Al contrario, nell'approccio top-down, diversi stati proteici o proteoforme che hanno incorporato diversi contenuti di deuterio danno origine a molteplici distribuzioni di masse proteiche intatte in una scansione della SM. Ciò consente di separare le singole specie mediante la selezione di massa di ioni corrispondenti a ciascuna distribuzione di massa utilizzando un filtro di massa appropriato (come un quadrupolo) e la caratterizzazione delle loro differenze conformazionali nella successiva analisi TANDEM MS 3,4,5,6. Tuttavia, l'efficienza della separazione degli stati proteici o dei proteoformi in questa strategia è limitata dall'entità della differenza nelle loro corrispondenti distribuzioni di massa.
L'elettroforesi capillare (CE) fornisce un mezzo per separare le specie proteiche in base alle loro diverse cariche e dimensioni idrodinamiche nella fase di soluzione con alta efficienza7. La combinazione di CE con HDX offre un'ulteriore separazione degli stati proteici o delle proteoforme nella fase di soluzione. Inoltre, il piccolo volume del capillare CE consente l'utilizzo di una soluzione completamente deuterata come soluzione elettrolitica di fondo (BGE), cioè il buffer in esecuzione, rendendo il capillare come reattore HDX per campioni proteici. A causa della differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e reagenti protici nel processo di elettroforesi, la conduzione di HDX durante la CE si traduce in un ambiente di deuterazione quasi completo per gli analiti proteici con contenuti residui non deuterati minimi, migliorando così la sensibilità dell'analisi strutturale utilizzando i dati HDX. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio HDX differenziale basato su CE accoppiato con SM top-down per caratterizzare le strutture proteiche di ordine superiore in modo specifico per stato o proteoforme8.
Questo documento descrive i protocolli per questo approccio dettagliando le fasi di preparazione dei materiali, procedura sperimentale e analisi dei dati. I fattori che possono influire sulle prestazioni del metodo o sulla qualità dei dati sono elencati in brevi note. I risultati rappresentativi qui presentati includono i dati HDX differenziali di miscele di diverse proteine e varianti naturali di β-lattoglobulina bovina (β-lg), la principale proteina del siero di latte presente nel latte9. Dimostriamo l'efficienza di separazione, la riproducibilità e le prestazioni di etichettatura 2H delle due abbondanti varianti di β-lg, cioè A e B10,11 durante l'HDX basato su CE e la caratterizzazione specifica della variante delle loro conformazioni.
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Protocol
NOTA: utilizzare reagenti di grado HPLC (Ad alte prestazioni) per cromatografia liquida (HPLC) o di grado MS quando possibile per ridurre al minimo i contaminanti che possono interferire con l'analisi della SM. Non toccare l'interfaccia CE-MS a mani nude durante la misurazione per evitare la possibilità di una scossa elettrica causata dalla tensione elettroforetica o dalla tensione elettrospray.
1. Preparazione del materiale
- Modifica del capillare di silice fusa per CE
- Preparare una soluzione di idrossipropilcellulosa (HPC) al 5% (p/p) sciogliendo la polvere di HPC (peso molecolare [MW]: 100 kDa) in acqua con agitazione continua a temperatura ambiente su un agitatore magnetico per ~12 h o fino alla completa scomparsa delle particelle solide12. Rimuovere eventuali bolle d'aria visibili con un ultrasuoni.
- Montare un capillare di vetro di silice fusa (diametro interno [ID]: 50 μm, diametro esterno [OD]: 360 μm) di circa 85 cm di lunghezza in uno strumento CE. Risciacquare il capillare infondendo continuamente un solvente organico, come l'acetone13, utilizzando l'autocampionatore di CE ad una pressione di infusione di 40 psi per 10-15 min.
- Riempire il capillare pulito con soluzione HPC utilizzando l'autocampionatore a una pressione di infusione di 40 psi (che spesso richiede ~ 40 minuti). Infondere aria nel capillare riempito di HPC a 40 psi per garantire un flusso d'aria libero nel capillare, indicato dalle bolle d'aria espulse dal capillare dopo l'immersione in acqua.
- Cuocere il capillare rivestito in HPC in un forno programmabile a temperatura (idealmente il forno a colonna a temperatura controllata di un gascromatografo a temperatura programmata) con azoto gassoso (25 psi) che scorre attraverso il capillare, seguendo il programma di temperatura mostrato in Figura 1.
- Raffreddare il forno a temperatura ambiente prima di estrarre il capillare. Utilizzare questo capillare modificato HPC per la separazione CE.
Figura 1: Un programma di temperatura consigliato per la cottura capillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Soluzione di elettrolita di fondo (BGE) e soluzione modificatore8
- Preparare 1-10 mL di BGE alla concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mM) sciogliendo la quantità appropriata di acetato di ammonio in 2H2 O. Posizionare 200μL-aliquote di BGE in flaconcini BGE separati e sigillare i flaconcini con parafilm per ridurre al minimo la reazione HDX tra BGE e vapore acqueo nell'aria.
- Preparare 10 mL di una soluzione modificatrice con metanolo al 75% (v/v) e acqua al 25% (v/v), con pH regolato a 2,5 utilizzando acido formico.
NOTA: utilizzare 2H2O e metanolo deuterato per preparare la soluzione modificatore se gli atomi di deuterio nelle catene laterali e le ammidi dorsali non protette devono essere trattenuti per il rilevamento da parte della SM.
- Dissalazione di campioni proteici
- Preparare una soluzione di acetato di ammonio in acqua non deuterata alla concentrazione desiderata.
NOTA: si raccomanda una concentrazione inferiore a 100 mM per evitare un'elevata corrente elettrica durante l'elettroforesi e il conseguente effetto di riscaldamento Joule. - Se necessario, regolare il pH della soluzione di acetato di ammonio al livello desiderato utilizzando acido formico (per pH < 6,8) o idrossido di ammonio (per pH > 6,8).
- Sostituire i tamponi originali della soluzione proteica con una soluzione di acetato di ammonio (preparata in acqua non deuterata alla concentrazione desiderata; pH regolato a 7,5 con idrossido di ammonio) attraverso almeno cinque concentrazioni sequenziali e fasi di diluizione a 4 °C utilizzando un filtro centrifugo con un adeguato cutoff MW.
NOTA: I campioni proteici da dissalizzare possono provenire da precedenti procedure di produzione (ad esempio, purificazione o formulazione) o preparati sciogliendo la polvere liofilizzata di proteine. I "sali" da rimuovere dalle soluzioni campione in questa fase si riferiscono in generale a tutti i piccoli ioni o molecole che non sono volatili. Sebbene queste specie possano essere separate in modo efficiente dalle proteine durante il processo di elettroforesi, questo passaggio è raccomandato per evitare di compromettere la risoluzione elettroforetica e quindi ridurre al minimo la contaminazione dello spettrometro di massa. Quando gli analiti proteici devono essere stabilizzati da sali o additivi specifici, includerli nel BGE. - Determinare la concentrazione proteica utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume.
- Preparare una soluzione di acetato di ammonio in acqua non deuterata alla concentrazione desiderata.
2. Funzionamento dell'analisi HDX MS basata su CE
NOTA: Lo spettrometro di massa utilizzato in questo approccio dovrebbe essere dotato di un analizzatore di massa ad altissima risoluzione, come una risonanza di ciclotrone ionico a trasformata di Fourier (FTICR) o orbitrap, un filtro di massa, come un quadrupolo che consente la selezione di massa di ioni precursori per la frammentazione e funzioni di dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD) o dissociazione a cattura elettronica (ECD) per eseguire analisi top-down con dati MS tandem affidabili (idealmente segnali isotopicamente risolti di ioni frammento).
- Ottimizzazione delle impostazioni CE e MS
- Eseguire una misurazione pilota della SM utilizzando una sorgente standard di ionizzazione elettrospray (ESI) spruzzando il campione precaricato da un capillare di vetro borosilicato rivestito di metallo (lo schema nanoESI "statico") o il campione continuamente infuso da un emettitore di metalli per ottimizzare le impostazioni MS per la misurazione delle proteine intatte (MS1) e dei loro frammenti in fase gassosa (MS2). Frammentare le specie proteiche di interesse mediante selezione di massa dell'insieme dei suoi ioni in un singolo stato di carica, seguito da ETD o ECD degli ioni precursori.
NOTA: le impostazioni essenziali includono i parametri che influenzano la desolvazione, la selezione di massa degli ioni precursori (per evitare interferenze da altre specie) e l'efficienza di frammentazione. Sia il centro che la larghezza della finestra di selezione della massa devono essere aumentati per corrispondere alla distribuzione di massa risultante degli ioni analita dopo HDX. Poiché la finestra di eluizione di una specie proteica in CE varia tipicamente da 0,5 minuti a 2 minuti, valutare l'efficienza di frammentazione in base alle scansioni MS2 accumulate in una finestra temporale comparabile. I valori ottimali di questi parametri sono specifici delle proteine; i lettori sono riferiti a rapporti pubblicati in precedenza per impostazioni esemplari 8,14. - Eseguire una misura CE pilota utilizzando uno strumento CE dotato di un rivelatore ottico, ad esempio un rilevatore di array di fotodiodi (PDA) o un rilevatore UV per ottimizzare le impostazioni CE per la separazione delle specie proteiche e i tempi di migrazione, che è equivalente ai tempi di reazione HDX.
NOTA: Questo passaggio è facoltativo a seconda della disponibilità del rilevatore ottico di CE. In assenza di un rilevatore ottico, le impostazioni CE possono essere ottimizzate utilizzando CE-MS al completamento del punto 2.2, seguendo le istruzioni descritte al punto 2.3. Le impostazioni essenziali includono parametri che influenzano l'efficienza di separazione, forme di picco mostrate negli elettroferogrammi e tempi di eluizione.
- Eseguire una misurazione pilota della SM utilizzando una sorgente standard di ionizzazione elettrospray (ESI) spruzzando il campione precaricato da un capillare di vetro borosilicato rivestito di metallo (lo schema nanoESI "statico") o il campione continuamente infuso da un emettitore di metalli per ottimizzare le impostazioni MS per la misurazione delle proteine intatte (MS1) e dei loro frammenti in fase gassosa (MS2). Frammentare le specie proteiche di interesse mediante selezione di massa dell'insieme dei suoi ioni in un singolo stato di carica, seguito da ETD o ECD degli ioni precursori.
- Pre-condizionamento della configurazione CE-HDX
- Pulire l'interfaccia CE-MS microviale a flusso continuo con una miscela di metanolo al 50%, acqua al 49% e acido formico all'1% (v/v) utilizzando l'ultrasonicazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo il montaggio del capillare modificato HPC su uno strumento CE, sciacquare il capillare con BGE utilizzando l'autocampionatore per 10 minuti e lasciare il capillare pieno di BGE.
- Ottenere una lunghezza adeguata del tubo capillare di silice fusa non modificato (ID: 50 μm, OD: 360 μm) come tubo di infusione per la soluzione modificante. Collegare il tubo modificatore a una siringa di vetro a tenuta di gas con una punta smussata utilizzando un'unione e un manicotto appropriato e risciacquare il tubo con la soluzione modificatrice utilizzando una pompa per infusione per almeno 10 minuti.
- Inserire le uscite del capillare e del modificatore CE rivestito in HPC, che sono state caricate con le soluzioni corrispondenti, nell'interfaccia CE-MS pulita, come illustrato nella Figura 2.
- Far avanzare la siringa per l'infusione del modificatore manualmente o con la pompa di infusione per assicurarsi che la soluzione modificatrice raggiunga la punta dell'interfaccia. Montare l'interfaccia CE-MS assemblata su un alloggiamento sorgente nanoESI di uno spettrometro di massa.
Figura 2: Illustrazione schematica della configurazione HDX MS basata su CE. Questa cifra è stata modificata da8. Abbreviazioni: BGE = soluzione elettrolitica di fondo; CE = elettroforesi capillare; MS = spettrometria di massa; HDX = scambio idrogeno/deuterio; ESI = ionizzazione elettrospray; FTICR = risonanza ciclotrone ionica a trasformata di Fourier; ETD = dissociazione a trasferimento di elettroni; ECD = dissociazione a cattura elettronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Separazione CE simultanea, reazione HDX e analisi MS
NOTA: si consiglia l'uso di BGE deuterato entro 1 giorno dall'apertura del sigillo.- Applicare una tensione di spruzzatura di 3-5 kV all'interfaccia CE-MS.
- Iniziare a infondere la soluzione modificatrice con la pompa di infusione a una portata compresa tra 0,1 e 10 μL/min e garantire un elettrospray stabile sulla punta dell'interfaccia CE-MS.
- Posizionare il flaconcino campione contenente il BGE nell'autocampionatore e utilizzarlo al punto 2.3.4 per acquisire elettroferogrammi vuoti e spettri di massa vuoti.
- Iniettare la soluzione campione utilizzando l'autocampionatore a 2 psi e per una durata adeguata per consentire l'iniezione di una quantità desiderata del campione. Stimare il volume di iniezione utilizzando la relazione tra volume di iniezione e parametri di iniezione15 definiti dall'equazione (1).
(1)
Dove Vinj è il volume di iniezione, Δp è la pressione di iniezione, dc è il diametro interno del capillare, A è la sezione trasversale del capillare, tinj è la durata dell'iniezione, η è la viscosità del liquido nel capillare e L è la lunghezza del capillare. - Avviare la separazione CE applicando una tensione elettroforetica di 30 kV e una pressione di infusione compresa tra 0 e 2 psi, e acquisire l'elettroferogramma. Nel frattempo, avviare l'acquisizione dei dati MS in modalità cromatografica in cui il grafico a corrente ionica viene acquisito in funzione del tempo e le corrispondenti scansioni MS non vengono automaticamente combinate in un singolo spettro.
NOTA: Le proteine subiscono una reazione spontanea HDX nel punto di contatto di 2molecole H2O in BGE durante la loro migrazione elettroforetica in questa fase. Il rilevamento ottico per CE può essere utilizzato in aggiunta al rilevamento MS. Poiché il rilevamento su colonna richiede la rimozione di una certa lunghezza di rivestimento in poliimmide all'estremità di uscita del capillare di silice fusa, è necessario prestare particolare attenzione per evitare danni capillari durante l'assemblaggio dell'interfaccia CE-MS. - Salvate l'elettroferogramma vuoto e gli spettri di massa come riferimenti.
NOTA: i dati vuoti devono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi anziché per la sottrazione di base. - Inserire i flaconcini campione contenenti le concentrazioni desiderate delle soluzioni campione proteiche nell'autocampionatore. Acquisire gli elettroferogrammi e gli spettri di massa per i campioni proteici seguendo i passaggi 2.3.4-2.3.5. Raccogliere un numero adeguato di scansioni di SM per ottenere spettri MS1 delle specie proteiche elettroforeticamente separate e 2H-labeled.
- Eseguire misurazioni di MS in tandem per le specie di interesse dopo aver acquisito gli spettri MS1 all'interno della stessa corsa o in una successiva corsa separata.
- Se necessario, regolare i tempi di migrazione/tempi di reazione HDX modificando la pressione di infusione o la lunghezza del capillare CE. Se il tempo di reazione HDX deve essere inferiore al tempo di migrazione, utilizzare l'approccio descritto in precedenza8, che impiega BGE sia deuterato che non deuterato nel capillare durante il processo CE.
- Lavare il capillare CE con BGE ad una pressione di 20 psi per almeno 10 minuti dopo ogni misurazione.
- Al termine degli esperimenti, pulire l'interfaccia CE-MS e tutti i tubi per lo stoccaggio.
- Acquisire un set di dati del campione "endpoint" HDX (che può essere preparato utilizzando gli approcci descritti in precedenza 6,16) con SM in modalità infusione diretta.
NOTA: questo passaggio è necessario solo quando viene utilizzata una soluzione di modificatore deuterato per HDX basato su CE.
(1)3. Analisi dei dati
- Analisi dei dati CE
- Utilizzare uno dei seguenti grafici come elettroferogramma per determinare le caratteristiche elettroforetiche, incluso il numero di picchi, i tempi di migrazione e l'efficienza di separazione: (a) assorbanza UV vs tempo di migrazione, acquisita dal rilevatore ottico dello strumento CE (quando disponibile); b) il grafico della corrente ionica totale (TIC) acquisito dagli Stati membri; c) il grafico della corrente ionica estratta (EIC/XIC) acquisito dagli Stati membri.
NOTA: EIC/XIC fornisce il rapporto segnale/rumore (S/N) ottimale, in generale, tra i suddetti formati di elettroferogrammi. È interessante notare che anche in assenza di pregiudizi strumentali, mentre l'assorbanza UV è proporzionale alla concentrazione di massa della proteina, il segnale MS è proporzionale alla concentrazione molare. Pertanto, è ragionevole osservare le differenze nei modelli di picco tra elettroferogrammi derivati da CE e MS. - Utilizzare l'area sotto la curva (AUC) dei picchi mostrati negli elettroferogrammi per la semiquantazione. Per i campioni che coinvolgono complessi proteici, utilizzare l'approccio descritto in precedenza17 per dedurre i dati sulla concentrazione di massa dagli elettroferogrammi TIC/EIC.
- Utilizzare uno dei seguenti grafici come elettroferogramma per determinare le caratteristiche elettroforetiche, incluso il numero di picchi, i tempi di migrazione e l'efficienza di separazione: (a) assorbanza UV vs tempo di migrazione, acquisita dal rilevatore ottico dello strumento CE (quando disponibile); b) il grafico della corrente ionica totale (TIC) acquisito dagli Stati membri; c) il grafico della corrente ionica estratta (EIC/XIC) acquisito dagli Stati membri.
- Analisi dei dati MS
- Ottenere gli spettri MS1 e MS2 combinando rispettivamente le scansioni MS1 e MS2 acquisite all'interno delle finestre di eluizione corrispondenti.
- Determinare le masse della proteina intatta (M (proteina intatta)) e dei frammenti con uno dei seguenti due metodi.
- Calcolare le masse medie degli ioni che danno origine agli ammassi di segnali risolti isotopicamente.
- Utilizzare il centro delle curve gaussiane risultanti dal fitting degli inviluppi isotopici corrispondenti6.
- Utilizzare software come Biopharma Finder, ProSight18 o MASH Suite19 per generare l'elenco di massa degli ioni frammento e identificarli.
- Analisi dei dati HDX
- Determinare il livello complessivo di deuterazione di una specie proteica intatta usando l'equazione (2).
(2)
dove M (2H) o M (1H) sono pesi atomici di 2H o 1H. L'asterisco indica i dati del campione con etichetta 2H. - Determinare la protezione cumulativa o la deuterazione cumulativa delle dorsali-ammidi di un segmento specifico.
- Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (3) e (4) per determinare il livello di protezione cumulativo.
(3)
(4)
Dove P(Sk(N)) è la protezione totale del segmento N-terminale che copre i residui da 1 a k, P(Sm(C)) è la protezione totale del segmento C-terminale comprendente m residui, M (2H) o M (1H) sono pesi atomici di 2H o 1H, e M (ci) o M (zi) sono i pesi molecolari degli ioni ci o zi .
NOTA: il doppio asterisco indica i dati dell'esempio "endpoint" HDX. - Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice non deuterata, utilizzare le equazioni (5) e (6) per determinare il livello di deuterazione cumulativo.
(5)
(6)
dove D(Sk(N)) è l'assorbimento cumulativo di deuterio del segmento N-terminale che attraversa i residui da 1 a k; D(Sm(C)) è l'assorbimento cumulativo di deuterio del segmento C-terminale comprendente m residui.
- Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (3) e (4) per determinare il livello di protezione cumulativo.
- Determinare il livello di deuterazione in un gruppo ammidico della spina dorsale locale
- Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (7), (8), (9), (10) e (11) per determinare il livello di protezione locale.
per i dati dedotti dagli ioni C
(7)
per i dati dedotti dagli ioni z
(8)
Dove P(Ri) è la protezione di un'ammide dorsale al residuo i, e il pedice "totale" indica il numero totale di residui della proteina.
Per i siti residui in cui mancavano ioni frammento successivi, assegnare P(Ri) usando le equazioni (9) e (10).
per i dati dedotti dagli ioni C
(9)
per i dati dedotti dagli ioni z
(10)
Quindi, determinare il livello di deuterazione D(Ri) in un gruppo ammidico della spina dorsale locale usando l'equazione (11).
(11) - Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice non deuterata, utilizzare le equazioni (12), (13), (14) e (15) per determinare il livello di protezione locale.
per i dati dedotti dagli ioni C
(12)
per i dati dedotti dagli ioni z
(13)
Dove D(Ri) è la protezione di un'ammide dorsale al residuo i, e il pedice "totale" indica il numero totale di residui della proteina.
Per i siti residui in cui mancavano ioni frammento successivi, assegnare D(Ri) usando le equazioni (14) e (15).
per i dati dedotti dagli ioni C
(14)
per i dati dedotti dagli ioni z
(15)
- Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (7), (8), (9), (10) e (11) per determinare il livello di protezione locale.
- Determinare il livello complessivo di deuterazione di una specie proteica intatta usando l'equazione (2).
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
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Representative Results
La modifica della pressione di infusione di BGE consente di regolare sia l'efficienza di separazione che il tempo di migrazione, che è equivalente al tempo di reazione HDX delle proteine da separare (Figura 3). Una pressione di infusione più bassa si traduce in una migliore separazione dei picchi CE a scapito della durata dell'esperimento (Figura 3A). Un tempo di migrazione/reazione HDX più lungo si traduce in un livello più elevato di deuterazione degli analiti proteici (Figura 3B-D). Alla scala temporale HDX di minuti, la differenza di deuterazione dovrebbe riflettere principalmente le diverse estensioni di scambio nei siti strutturalmente protetti anziché nei siti rapidamente intercambiabili. Secondo l'andamento delle funzioni del tempo di deuterazione mostrate da entrambe le specie proteiche, è improbabile che la differenza di tempo di migrazione sia il principale contributore alla differenza di deuterazione. Infatti, nel differenziale CE-HDX di olo- e apo-mioglobina (Mb)8, il precedente apo-Mb eluito mostra un livello di deuterazione più elevato rispetto all'holo-Mb, suggerendo chiaramente che la differenza conformazionale è il fattore primario che determina la differenza di deuterazione misurata.
La correzione della differenza di deuterazione introdotta dalla differenza di tempo di migrazione può essere effettuata tramite curve-fitting per i dati del livello di deuterazione rispetto al tempo HDX (Figura 3D). Le varianti A e B di β-lg differiscono solo per due residui di amminoacidi nella loro sequenza (D64G e V118A)20. Queste varianti hanno dato origine a due picchi adeguatamente separati nell'elettroferogramma derivato dall'EIC (Figura 4A). Profili di separazione riproducibili sono stati ottenuti da esperimenti condotti da diversi operatori utilizzando strumenti diversi in strutture diverse (Figura 4A). Le distribuzioni di massa distinte risultanti di ioni corrispondenti alla variante differenzialmente marcata con 2H (Figura 4C) consentono la selezione di massa di ciascuna variante utilizzando un filtro di massa a quadrupolo per la successiva analisi MS top-down, senza interferenze dagli ioni catione-addotto dell'altra variante.
Gli spettri MS tandem di ioni frammento rappresentativi sono mostrati nella Figura 5. Il legame unico del disolfuro e la conformazione di β-lg limitano l'efficienza di frammentazione tra Cys82 e Cys176 perché è necessaria un'ulteriore energia di frammentazione per scindere i legami disolfuro che racchiudono questa regione14, risultando in un numero inferiore e in un'abbondanza relativa di ioni z (C-terminale) rispetto agli ioni c (N-terminale) (Figura 5A,B). Questo problema può essere risolto combinando con gli approcci di riduzione del disolfuro 21,22,23,24. Mentre la maggior parte degli ioni frammento prodotti da β-lg A e β-lg B mostrano un'estensione simile di assorbimento del deuterio (Figura 5A,B), i segmenti più grandi che coprono i siti di variazione della sequenza (rappresentati da ioni come c137) da β-lg A sono deuterati in misura significativamente maggiore rispetto agli atomi β-lg B (132 vs. 119 atomi 2H; Figura 5C). Questi risultati sono in accordo con il profilo CE e i risultati della caratterizzazione cristallografica di queste varianti. Il profilo CE indica una maggiore mobilità elettroforetica di β-lg B a causa della minore flessibilità strutturale. I risultati della caratterizzazione cristallografica di queste varianti indicano che piccoli cambiamenti nella conformazione della spina dorsale avvengono nelle vicinanze di D64G su loop CD (residui 61-67)11.
Figura 3: Analisi HDX MS basata su CE di una miscela di mioglobina e ubiquitina con diversi tempi di reazione HDX. (A) Elettroferogrammi (basati su EIC) di 2Mb (rossi) marcati H (rosso) e Ub (blu) da una miscela, acquisiti con diverse pressioni di infusione BGE. (B) Spettri di massa di 2[Mb]16+ (rosso) e [Ub]8+ (blu) marcati H acquisiti con tempi HDX diversi. Sovrapposti sulla parte superiore ci sono spettri di riferimento di ioni [Mb]16+ e [Ub]8+ non etichettati (grigio). (C) Tempo di migrazione di Mb (rosso) e Ub (blu) in funzione della pressione di infusione BGE. (D) Livello di deuterazione di Mb (rosso) e Ub (blu) in funzione del tempo di reazione HDX (equivalente al tempo di migrazione). Dati acquisiti con un sistema di elettroforesi capillare CESI 8000 plus e uno spettrometro di massa Q Exactive UHMR. Abbreviazioni: BGE = soluzione elettrolitica di fondo; CE = elettroforesi capillare; MS = spettrometria di massa; HDX = scambio idrogeno/deuterio; Mb = mioglobina; Ub = ubiquitina; EIC = corrente ionica estratta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi HDX MS basata su CE di una miscela naturale di β-lg A e β-lg B da latte bovino. (A) Elettroferogrammi (basati su EIC) di 2β-lg A (blu) marcati H e β-lg B (rosso) da latte bovino, acquisiti con diverse pressioni di infusione BGE. Dati acquisiti con un sistema CESI 8000 plus CE e uno spettrometro di massa Q Exactive UHMR. Sovrapposto sulla parte superiore è un elettroferogramma da una misurazione eseguita in una struttura diversa (grigio), con un sistema CE di analisi farmaceutica PA 800 Plus e uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos. (B) Spettri di massa di 2[β-lg A]14+ marcati H (blu) e [β-lg B]14+ (rosso) acquisiti con pressione di infusione BGE di 1 psi. Sovrapposti sulla parte superiore ci sono spettri di riferimento di ioni [β-lg A]14+ e [β-lg B]14+ non etichettati (grigio). Abbreviazioni: BGE = soluzione elettrolitica di fondo; CE = elettroforesi capillare; MS = spettrometria di massa; HDX = scambio idrogeno/deuterio; Ig = immunoglobuline. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Spettri MS tandem di ioni frammento rappresentativi prodotti da β-lg A (blu) e β-lg B (rosso). A) gli ioni c10 sono abbondanti e deuterati in misura simile; B) gli ioni z29 sono meno abbondanti e deuterati in misura simile; C) gli ioni c137 coprono i siti di variazione della sequenza e sono deuterati in misura significativamente diversa in β-lg A e B. Le posizioni dei segmenti corrispondenti sono illustrate come porzioni di colore arancione della struttura cristallina di β-lg B (PDB ID: 5IO5). Abbreviazioni: MS = spettrometria di massa; Ig = immunoglobuline. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli obiettivi del rivestimento della parete interna del capillare CE includono la minimizzazione del flusso elettroosmotico e l'assorbimento delle proteine durante il processo CE13. Sebbene il flusso elettroosmotico sia vantaggioso per l'analisi CE convenzionale di piccole molecole grazie alla sua capacità di guidare specie neutre o caricate in modo opposto al rivelatore, compromette l'efficienza di separazione di specie proteiche con dimensioni simili e cariche nette in soluzione. Rivestire il capillare con HPC riduce al minimo il flusso elettroosmotico causato dai gruppi silanolici sulla parete interna del capillare. Inoltre, mascherare questi gruppi silanoli riduce la loro interazione con le proteine, evitando una migrazione rallentata o addirittura la completa ritenzione di proteine nel capillare.
Durante l'elettroforesi, sia gli analiti che i cationi e gli anioni del BGE subiscono una migrazione elettroforetica. Al momento dell'accoppiamento con MS, un serbatoio del BGE sul lato a tensione negativa del capillare CE viene sostituito con un'interfaccia CE-MS con una composizione diversa. L'applicazione di una pressione che infonde continuamente BGE fresco nel capillare dal serbatoio sul lato della tensione positiva a una portata specifica riduce al minimo il gradiente di concentrazione del contenuto di BGE in tutto il capillare, il che è vantaggioso per le prestazioni di separazione.
Il tempo di reazione HDX è un parametro essenziale per determinare il tasso di cambio in un dato sito/segmento e caratterizzare la dinamica delle strutture di ordine superiore delle proteine. In uno schema HDX basato su CE, quando il capillare è riempito con BGE deuterato, il tempo di reazione HDX dipende dal volume interno del capillare e dalla velocità di migrazione degli analiti. Sebbene il volume interno del capillare possa essere regolato modificando la lunghezza o l'ID del capillare, l'entità della regolazione utilizzando questo metodo è limitata da fattori quali la lunghezza minima richiesta per il collegamento degli strumenti CE e MS e la contropressione aggiuntiva e il rischio di intasamento causati dalla diminuzione dell'ID.
Al contrario, la modifica della pressione di infusione BGE è un modo praticamente efficace per regolare il tempo di reazione HDX su un ampio intervallo. Tuttavia, è ancora difficile abbassare il tempo HDX ai valori al di sotto del minuto perché una portata elevata compromette la desolvimento all'interfaccia ESI. Per ottenere un tempo HDX inferiore, la quantità desiderata di BGE non deuterato può essere iniettata nel capillare che è stato riempito con BGE deuterato prima dell'iniezione del campione. Ciò contribuirà a ridurre la lunghezza della sezione BGE deuterata che le proteine analitiche dovrebbero attraversare e interagire con loro durante la loro migrazione. Questo approccio consente di ridurre il tempo effettivo HDX alla seconda scala8.
La simulazione del campo di velocità e della distribuzione della concentrazione quando l'analita viene costantemente infuso nella microviale rivela che il flusso CE è diluito in modo efficiente dalla soluzione modificatore nella microviale passante e che la durata di viaggio dell'analita in questa regione di miscelazione è sulla seconda scala in assenza di flusso elettroosmotico25 . Sebbene l'HDX dei siti ammidici della spina dorsale strutturalmente protetti sia "estinto" dopo la miscelazione con il modificatore acidificato, tale schema di miscelazione comporta la perdita di etichette di deuterio agli atomi di idrogeno a scambio rapido (compresi quelli alle catene laterali) quando viene utilizzato un modificatore non deuterato. Di conseguenza, 2H2O e metanolo deuterato dovrebbero essere utilizzati per preparare il modificatore nelle misurazioni che richiedono che le etichette di deuterio nei siti a scambio rapido siano conservate per l'analisi degli Stati membri.
I limiti dell'attuale schema di questo approccio HDX MS basato su CE sono associati a (1) la regolazione del tempo HDX e (2) un ulteriore scambio di idrogeno tra gli analiti proteici e la soluzione modificatrice all'interfaccia flow-through. La determinazione della portata effettiva si basa sulla stima utilizzando la sua correlazione empirica con parametri come la pressione di infusione, i parametri capillari e i parametri della soluzione (vedi passo 2.3.4), Per questo motivo e poiché non è possibile misurare con precisione il volume interno del capillare (modificato o non modificato, fatto in casa o commerciale), il tempo HDX non può essere deliberatamente impostato con elevata precisione regolando i parametri di funzionamento. Tuttavia, il tempo HDX risultante sperimentalmente può essere misurato con precisione.
La soluzione modificatrice utilizzata in questo approccio include un solvente organico, che facilita la SM tandem dispiegando le proteine, e acido per ridurre al minimo ulteriori reazioni di scambio abbassando il pH a 2,5. Poiché non è possibile evitare l'uso di solventi protici, lo scambio tra le proteine e la soluzione modificatrice avviene al momento della loro miscelazione all'interfaccia CE-MS. Quando viene utilizzata una soluzione modificatrice non deuterata, i siti a scambio rapido perdono le loro etichette di deuterio in questa fase e solo i siti ben protetti rimangono etichettati, limitando la sensibilità nel confronto delle proteine con differenze conformazionali minori. Tali effetti possono essere parzialmente calibrati misurando la proteina completamente deuterata in un campione di riferimento.
L'esecuzione di HDX in CE fornisce un mezzo per separare le specie proteiche in soluzione durante l'HDX per evitare interferenze da ioni di specie vicine nella caratterizzazione TOP-DOWN MS di singole specie e un approccio di inizializzazione della reazione HDX. In questa reazione HDX, le proteine da deuterare lasciano completamente l'ambiente originale non deuterato a causa della loro diversa mobilità. Ciò contrasta con l'operazione di diluizione convenzionale, in cui viene mantenuta una frazione di contenuti non deuterati (in genere compresi tra l'1% e il 10%). Considerando i vantaggi dei recenti sviluppi della tecnica MS top-down, ci aspettiamo di migliorare ulteriormente questo approccio in modo che possa essere incluso nella cassetta degli attrezzi affidabile per la caratterizzazione differenziale delle strutture proteiche di ordine superiore.
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Disclosures
D. D. Y. Chen è uno dei fondatori del Knowledge for Health Institute for Biomolecules, che sta commercializzando l'interfaccia CE-MS microviale a flusso continuo. Altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Gli autori hanno anche ricevuto il supporto dell'Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Cina; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials presso la Nanjing Normal University, Cina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |
References
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