Summary

Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Published: June 08, 2021
doi:

Summary

Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.

Abstract

Å løse konformasjonell heterogenitet av flere proteintilstander som sameksisterer i løsning, er fortsatt en av de viktigste hindringene i karakteriseringen av proteinterapeutikk og bestemmelse av konformasjonsovergangsveiene som er kritiske for biologiske funksjoner, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium utveksling (HDX) reaksjon kombinert med ovenfra og ned massespektrometrisk (MS) analyse gir et middel til å karakterisere protein høyere orden strukturer og dynamikk på en konform-spesifikk måte. Konformasjonsløsningskraften til denne teknikken er svært avhengig av effektiviteten ved å skille proteintilstander på intakt proteinnivå og minimere det gjenværende ikke-deutererte protiske innholdet under HDX-reaksjonene.

Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-basert variant av HDX MS-tilnærmingen som tar sikte på å forbedre konformasjonsoppløsningen. I denne tilnærmingen gjennomgår proteiner HDX-reaksjoner mens de migrerer gjennom en deutert bakgrunnselektrolyttløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk separasjon. Ulike proteintilstander eller proteoformer som sameksisterer i oppløsning, kan effektivt separeres basert på deres forskjellige forhold mellom ladning og størrelse. Forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske løsningsmiddelmolekyler minimerer det gjenværende ikke-deutererte løsningsmidlet, noe som resulterer i et nesten komplett deuteringsmiljø under HDX-prosessen. Det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet muliggjør effektiv elektrosprayionisering av de eluterte proteinartene etter en rask blanding med slukke- og denatureringsmodifikatorløsningen ved utløpet av sprøyten. Den elektroniske ovenfra-og-ned MS-analysen måler det globale deuteringsnivået til de rømte intakte proteinartene, og deretter deutering av gassfasefragmentene. Dette dokumentet demonstrerer denne tilnærmingen i differensial HDX for systemer, inkludert de naturlige proteinvariantene som sameksisterer i melk.

Introduction

Å skille proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander og karakterisere deres strukturelle forskjeller er viktig for å overvåke overgangsveiene mellom disse artene som er involvert i biologiske hendelser, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse, og forstå mekanismene som ligger til grunn for disse hendelsene. Konvensjonelle biofysiske teknikker gir ikke en komplett løsning på grunn av begrensningene som utilstrekkelig oppløsning og tap av dynamisk informasjon i løsningen. Hydrogen/deuteriumutveksling kombinert med massespektrometri (HDX MS) er en teknikk som merker de strukturelle og konformasjonsmessige egenskapene til proteiner med deuterium (2H) via utvekslingen mellom labile hydrogenatomer av proteiner og 2H fra den bevisst introduserte 2H2O-løsningen. Protoner involvert i hydrogenbinding eller som er beslaglagt fra løsningsmidlet i proteininteriøret, utveksles ikke lett1. Dermed, ettersom valutakursen på et utvekslingssted er svært avhengig av sitt engasjement i høyere ordens strukturer, kan proteinstrukturene avsløres ved høy romlig oppløsning av MS som undersøker omfanget og hastigheten på 2H-opptak basert på de forskjellige atommassene mellom 1H og 2H. I løpet av de siste tiårene har HDX MS blitt en fremragende vellykket teknikk for å studere proteinkonformasjoner og dynamikk2.

I den klassiske nedenfra-og-opp-tilnærmingen til HDX MS er ensemblet av proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander proteolysert uten separasjon på intakt proteinnivå, noe som gjør det umulig å karakterisere individuelle arter ved å analysere de resulterende proteolytiske fragmentene med innviklet deuteriuminnhold. I motsetning, i ovenfra og ned-tilnærmingen, gir forskjellige proteintilstander eller proteoformer som har innlemmet forskjellig deuteriuminnhold, opphav til flere distribusjoner av intakte proteinmasser i en MS-skanning. Dette gjør at individuelle arter kan skilles ved massevalg av ioner som tilsvarer hver massefordeling ved hjelp av et riktig massefilter (for eksempel en quadrupole) og karakteriseringen av deres konformasjonsforskjeller i den påfølgende tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av å skille proteintilstander eller proteoformer i denne strategien er imidlertid begrenset av omfanget av forskjell i deres tilsvarende massefordelinger.

Kapillær elektroforese (CE) gir et middel til å skille proteinarter basert på deres forskjellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i løsningsfasen med høy effektivitet7. Kombinere CE med HDX tilbyr ytterligere separasjon av proteintilstander eller proteoformer i løsningsfasen. I tillegg tillater det lille volumet av CE-kapillæren utnyttelse av en fullt deutert løsning som bakgrunnselektrolyttløsning (BGE), det vil si løpebufferen, som gjengir kapillæren som en HDX-reaktor for proteinprøver. På grunn av forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprosessen, resulterer det i et nesten komplett deuteringsmiljø for proteinanalyttene med minimalt gjenværende ikke-deutert innhold, og dermed forbedrer følsomheten til strukturanalysen ved hjelp av HDX-data. Som sådan utviklet vi en CE-basert differensial HDX-tilnærming kombinert med ovenfra og ned MS for å karakterisere protein høyere orden strukturer på en tilstands- eller proteoform-spesifikk måte8.

Dette dokumentet beskriver protokoller for denne tilnærmingen ved å detaljere trinnene for materialforberedelse, eksperimentell prosedyre og dataanalyse. Faktorer som kan påvirke metodeytelsen eller datakvaliteten, vises i korte merknader. De representative resultatene som presenteres her inkluderer differensial HDX-data av blandinger av forskjellige proteiner og naturlige varianter av storfe β-lactoglobulin (β-lg), det store myseproteinet som finnes i melk9. Vi demonstrerer separasjonseffektivitet, reproduserbarhet og 2H-merkingsytelse av de to rikelige variantene av β-lg, det vil si A og B10,11 under CE-basert HDX og variantspesifikk karakterisering av deres konformasjoner.

Protocol

MERK: Bruk hplc-grade (high-performance liquid chromatography) eller MS-reagenser når det er mulig for å minimere forurensningene som kan forstyrre MS-analysen. Ikke berør CE-MS-grensesnittet med bare hender under målingen for å unngå muligheten for elektrisk støt forårsaket av enten elektroforetisk spenning eller elektrosprayspenning. 1. Materialforberedelse Modifikasjon av smeltet silika kapillær for CE Forbered en 5% (w / w) hydroksypropylcellulose (HPC) løsning …

Representative Results

Endring av infusjonstrykket til BGE gjør det mulig å justere både separasjonseffektivitet og migrasjonstid, noe som tilsvarer HDX-reaksjonstiden til proteinene som skal separeres (figur 3). Et lavere infusjonstrykk resulterer i bedre separasjon av CE-topper på bekostning av eksperimentets varighet (figur 3A). En lengre migrerings-/HDX-reaksjonstid resulterer i et høyere nivå av deutering av proteinanalyttene (figur 3B-D<strong…

Discussion

Målene med å belegge den indre veggen til CE-kapillæren inkluderer minimering av elektroosmotisk strømning og proteinabsorpsjon under CE-prosessen13. Selv om elektroosmotisk strømning er gunstig for konvensjonell CE-analyse av små molekyler på grunn av dens evne til å drive nøytrale eller motsatt ladede arter til detektoren, kompromitterer den separasjonseffektiviteten til proteinarter med lignende størrelser og netto kostnader i løsningen. Belegg kapillæren med HPC minimerer den elekt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne fikk også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu samarbeidsinnovasjonssenter for biomedisinske funksjonelle materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.

Materials

ammonium acetate Fisher Chemical A/3446/50 ≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system Sciex, USA
centrifuge Eppendorf 5406000097
centrifugal filter Merck UFC201024 10 kDa cutoff
deuterium oxide Energy Chemical E090001 99.9 % D
formic acid Acros Organics  270480250
fused silica glass capillary Polymicro Technologies 1068150017 ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography Agilent GC6890N
hydrochloric acid Sigma Aldrich 258148
hydroxypropyl cellulose Aladdin H113415 MW 100000
magnetic stirrers DLAB 8030101212
methanol Fisher Chemical A456-4 MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer DeNovix 84677JK7731
myoglobin Sigma Aldrich M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide Sigma Aldrich S5881
ubiquitin Sigma Aldrich U6253
ultrasonicator SCIENTZ SB-5200
β-lactoglobulin Sigma Aldrich L0130

References

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu, Z., Chen, D. D. Y., Wang, G. Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62672, doi:10.3791/62672 (2021).

View Video