Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.
Å løse konformasjonell heterogenitet av flere proteintilstander som sameksisterer i løsning, er fortsatt en av de viktigste hindringene i karakteriseringen av proteinterapeutikk og bestemmelse av konformasjonsovergangsveiene som er kritiske for biologiske funksjoner, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium utveksling (HDX) reaksjon kombinert med ovenfra og ned massespektrometrisk (MS) analyse gir et middel til å karakterisere protein høyere orden strukturer og dynamikk på en konform-spesifikk måte. Konformasjonsløsningskraften til denne teknikken er svært avhengig av effektiviteten ved å skille proteintilstander på intakt proteinnivå og minimere det gjenværende ikke-deutererte protiske innholdet under HDX-reaksjonene.
Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-basert variant av HDX MS-tilnærmingen som tar sikte på å forbedre konformasjonsoppløsningen. I denne tilnærmingen gjennomgår proteiner HDX-reaksjoner mens de migrerer gjennom en deutert bakgrunnselektrolyttløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk separasjon. Ulike proteintilstander eller proteoformer som sameksisterer i oppløsning, kan effektivt separeres basert på deres forskjellige forhold mellom ladning og størrelse. Forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske løsningsmiddelmolekyler minimerer det gjenværende ikke-deutererte løsningsmidlet, noe som resulterer i et nesten komplett deuteringsmiljø under HDX-prosessen. Det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet muliggjør effektiv elektrosprayionisering av de eluterte proteinartene etter en rask blanding med slukke- og denatureringsmodifikatorløsningen ved utløpet av sprøyten. Den elektroniske ovenfra-og-ned MS-analysen måler det globale deuteringsnivået til de rømte intakte proteinartene, og deretter deutering av gassfasefragmentene. Dette dokumentet demonstrerer denne tilnærmingen i differensial HDX for systemer, inkludert de naturlige proteinvariantene som sameksisterer i melk.
Å skille proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander og karakterisere deres strukturelle forskjeller er viktig for å overvåke overgangsveiene mellom disse artene som er involvert i biologiske hendelser, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse, og forstå mekanismene som ligger til grunn for disse hendelsene. Konvensjonelle biofysiske teknikker gir ikke en komplett løsning på grunn av begrensningene som utilstrekkelig oppløsning og tap av dynamisk informasjon i løsningen. Hydrogen/deuteriumutveksling kombinert med massespektrometri (HDX MS) er en teknikk som merker de strukturelle og konformasjonsmessige egenskapene til proteiner med deuterium (2H) via utvekslingen mellom labile hydrogenatomer av proteiner og 2H fra den bevisst introduserte 2H2O-løsningen. Protoner involvert i hydrogenbinding eller som er beslaglagt fra løsningsmidlet i proteininteriøret, utveksles ikke lett1. Dermed, ettersom valutakursen på et utvekslingssted er svært avhengig av sitt engasjement i høyere ordens strukturer, kan proteinstrukturene avsløres ved høy romlig oppløsning av MS som undersøker omfanget og hastigheten på 2H-opptak basert på de forskjellige atommassene mellom 1H og 2H. I løpet av de siste tiårene har HDX MS blitt en fremragende vellykket teknikk for å studere proteinkonformasjoner og dynamikk2.
I den klassiske nedenfra-og-opp-tilnærmingen til HDX MS er ensemblet av proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander proteolysert uten separasjon på intakt proteinnivå, noe som gjør det umulig å karakterisere individuelle arter ved å analysere de resulterende proteolytiske fragmentene med innviklet deuteriuminnhold. I motsetning, i ovenfra og ned-tilnærmingen, gir forskjellige proteintilstander eller proteoformer som har innlemmet forskjellig deuteriuminnhold, opphav til flere distribusjoner av intakte proteinmasser i en MS-skanning. Dette gjør at individuelle arter kan skilles ved massevalg av ioner som tilsvarer hver massefordeling ved hjelp av et riktig massefilter (for eksempel en quadrupole) og karakteriseringen av deres konformasjonsforskjeller i den påfølgende tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av å skille proteintilstander eller proteoformer i denne strategien er imidlertid begrenset av omfanget av forskjell i deres tilsvarende massefordelinger.
Kapillær elektroforese (CE) gir et middel til å skille proteinarter basert på deres forskjellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i løsningsfasen med høy effektivitet7. Kombinere CE med HDX tilbyr ytterligere separasjon av proteintilstander eller proteoformer i løsningsfasen. I tillegg tillater det lille volumet av CE-kapillæren utnyttelse av en fullt deutert løsning som bakgrunnselektrolyttløsning (BGE), det vil si løpebufferen, som gjengir kapillæren som en HDX-reaktor for proteinprøver. På grunn av forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprosessen, resulterer det i et nesten komplett deuteringsmiljø for proteinanalyttene med minimalt gjenværende ikke-deutert innhold, og dermed forbedrer følsomheten til strukturanalysen ved hjelp av HDX-data. Som sådan utviklet vi en CE-basert differensial HDX-tilnærming kombinert med ovenfra og ned MS for å karakterisere protein høyere orden strukturer på en tilstands- eller proteoform-spesifikk måte8.
Dette dokumentet beskriver protokoller for denne tilnærmingen ved å detaljere trinnene for materialforberedelse, eksperimentell prosedyre og dataanalyse. Faktorer som kan påvirke metodeytelsen eller datakvaliteten, vises i korte merknader. De representative resultatene som presenteres her inkluderer differensial HDX-data av blandinger av forskjellige proteiner og naturlige varianter av storfe β-lactoglobulin (β-lg), det store myseproteinet som finnes i melk9. Vi demonstrerer separasjonseffektivitet, reproduserbarhet og 2H-merkingsytelse av de to rikelige variantene av β-lg, det vil si A og B10,11 under CE-basert HDX og variantspesifikk karakterisering av deres konformasjoner.
Målene med å belegge den indre veggen til CE-kapillæren inkluderer minimering av elektroosmotisk strømning og proteinabsorpsjon under CE-prosessen13. Selv om elektroosmotisk strømning er gunstig for konvensjonell CE-analyse av små molekyler på grunn av dens evne til å drive nøytrale eller motsatt ladede arter til detektoren, kompromitterer den separasjonseffektiviteten til proteinarter med lignende størrelser og netto kostnader i løsningen. Belegg kapillæren med HPC minimerer den elekt…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne fikk også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu samarbeidsinnovasjonssenter for biomedisinske funksjonelle materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.
ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |