Summary
Bu yazıda, klinik öncesi kullanım için onkolitik herpes simpleks virüsünün basit bir büyüme, arınma ve titrasyon yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Onkolitik herpes simpleks virüsü (oHSV) gibi onkolitik virüsler (OV'ler), kanser immünoterapisi alanında hızla büyüyen bir tedavi stratejisidir. OHSV de dahil olmak üzere OV'ler, anti-tümör bağışıklığını teşvik ederken kanser hücrelerini (sağlıklı / normal hücreleri koruma) seçici olarak çoğaltır ve öldürür. Bu benzersiz özellikler nedeniyle, oHSV tabanlı tedavi stratejileri, FDA onaylı talimogene laherparevec (T-Vec) dahil olmak üzere, preklinik ve klinik olarak kanserin tedavisi için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Büyüme, arınma ve titrasyon, deneysel çalışmalar için kullanılmadan önce oHSV'ler de dahil olmak üzere herhangi bir TV için üç temel laboratuvar tekniğidir. Bu makalede, Vero hücrelerinde oHSV'yi yükseltmek için basit bir adım adım yöntem açıklanmaktadır. İhSV'ler çoğaldıkça Vero hücrelerinde sitopatik etki (CPE) üretirler. Enfekte hücrelerin% 90-100'ü cpe gösterdiğinde, hafifçe hasat edilir, benzonaz ve magnezyum klorür (MgCl2)ile muamele edilir ve sakkaroz-gradyan yöntemi kullanılarak saflaştırmaya tabi tutulur. Saflaştırmadan sonra, enfeksiyöz oHSV sayısı (plak oluşturan birimler veya PTU'lar olarak belirlenir) Vero hücrelerinde bir "plak tahlil" ile belirlenir. Burada açıklanan protokol, hücre kültüründe ve in vivo hayvan deneylerinde in vitro çalışmalar için yüksek titer oHSV stoğu hazırlamak için kullanılabilir.
Introduction
Onkolitik virüsler (OV'ler) kanser immünoterapisinin ortaya çıkan ve benzersiz bir şeklidir. OV'ler seçici olarak tümör hücrelerinin içinde çoğalır ve lyse (normal / sağlıklı hücrelerin idaresi)1 anti-tümör bağışıklığını teşvik ederken2. Onkolitik herpes simpleks virüsü (oHSV), tüm OV'ler arasında en kapsamlı çalışılan virüslerden biridir. Klinikte en uzaktır, Talimogene laherparepvec (T-VEC) ileri melanom tedavisi için ABD'de FDA onayı alan ilk ve tekOV 3. T-VEC'ye ek olarak, genetik olarak tasarlanmış diğer birçok oHSV, farklı kanser türleri 3 , 4 , 5,6,7,8'depreklinik ve klinik olarak test edilmektedir. Mevcut gelişmiş rekombinant DNA biyoteknolojisi, terapötik transgene(ler)3,5için mühendislik yeni oHSV kodlamasının fizibilitesini daha da artırmıştır. Herhangi bir (yeni geliştirilen) oHSV in vitro ve in vivo çalışmalar için test edilemeden önce verimli bir oHSV yayılım, saflaştırma ve titer belirleme sistemi kritik öneme sahiptir. Bu makalede, oHSV büyümesinin (Vero hücrelerinde), saflaştırmanın (sakkaroz-gradyan yöntemiyle) ve titrasyonun (Vero hücrelerinde oHSV plak tahlili ile) basit bir adım adım yöntemi açıklanmaktadır (Şekil 1). Preklinik çalışmalar için yüksek kaliteli bir viral stok elde etmek için herhangi bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvar ortamında kolayca benimsenebilir.
Vero, Bir Afrika yeşil maymun böbrek hücre hattı, oHSV yayılma 9 için en sık kullanılan hücre hattıdır9,10,11,12,13 Vero hücreleri kusurlu bir antiviral interferon sinyal yolu vardır14. Interferon genlerinin inaktive stimülatörü (STING) sinyali veren diğer hücre hatları da oHSV büyümesi için kullanılabilir12,13. Bu protokol, oHSV büyümesi ve plak tahlilleri için Vero hücrelerini kullanır. Yayılmadan sonra, oHSV ile enfekte hücreler toplanır, yutulur ve saflaştırmaya tabi tutulur, burada lislenmiş hücreler ilk olarak konak hücre DNA'sını bozmak, nükleik asit-protein toplamasını önlemek ve hücre lisatının viskozitesini azaltmak için benzonaz çekirdeği ile tedavi edilir. Benzonazın uygun aktivasyonu genellikle Mg2 +gerektirdiğinden, bu protokolde 1-2 mM MgCl2 kullanılır15. Benzonazla işlenmiş hücre lisatından konak hücre kalıntıları, yüksek hızlı sakkaroz-gradyan santrifüjlemeden önce seri filtrasyon ile daha da ortadan kalkar. Viskoz% 25 sakkaroz çözelti yastığı, sakkaroz tabakasından daha yavaş bir virüs geçiş hızı sağlamaya yardımcı olur, konak hücre ile ilgili bileşenleri süpernatanta bırakır, böylece saflaştırmayı iyileştirir ve peletteki virüs kaybını sınırlar16. Saflaştırılmış oHSV daha sonra Vero hücreleri üzerinde titratlanır ve viral plaklar Giemsa boyama17 veya X-gal boyama (LacZ kodlama oHSV'leri için)18ile görselleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV büyümesi
NOT: oHSV ile çalışmadan önce kurumsal biyogüvenlik komitesi onayını sağlayın. Bu çalışma 18007 sayılı onaylanmış IBC Protokolü kapsamında gerçeklenmiştır. BSL2 önlemlerini koruyun: virüsle temas eden tüm pipetleri, uçları, tüpleri ve diğer malzemeleri ağartın. Eller BSL2 hücre kültürü başlığından ayrılmadan önce eldivenleri% 70 izopropil alkolle püskürtün. Bir virüsle çalıştıktan sonra ellerinizi her zaman sabunlu suyla iyice yıkayın.
- Gün -1, tohum düşük geçişli Vero hücreleri 20 T-150 cm2 şişelerde 7-8 × 106 hücre / şişe yoğunluğunda normal Vero hücre ortamında.
NOT: Vero ortamı, Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) %10 ısı inaktive fetal baldır serumu (IFCS) ile takviye edilmesiyle hazırlanır. - 0. Günde (hücreler% 80-90 birleştiğinde), Vero hücrelerine oHSV inoculum ekleyin.
- Virüs inokülumunun hazırlanması
- Virüs amplifikasyonu için 0,01 'lik çok miktarda enfeksiyon (MOI) kullanın (MOI, virüsün çoğaltma kapasitesine bağlı olarak 0,01 ila 0,1 arasında değişebilir). 20 şişe için virüs (mL) miktarını hesaplamak için formülü (1) kullanın.
20 şişe için virüs miktarı (mL) = virüs stoğunun ihtiyaç duyduğu virüs miktarı (pfu)/titer (pfu/mL)(1) - Virüs inoculum hazırlamak için %1 IFCS ile desteklenmiş yüksek glikoz dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) kullanın (T-150 cm 2 şişe başına7 mL, yani 20 şişe için ~140 mL). Gerekli miktarda oHSV'yi 140 mL yüksek glikoz DPBS/%1 IFCS çözeltisine, girdabı 1 dakikaya ekleyin ve karışımı Vero hücrelerine ek olarak hazır tutun.
- Virüs amplifikasyonu için 0,01 'lik çok miktarda enfeksiyon (MOI) kullanın (MOI, virüsün çoğaltma kapasitesine bağlı olarak 0,01 ila 0,1 arasında değişebilir). 20 şişe için virüs (mL) miktarını hesaplamak için formülü (1) kullanın.
- T-150 cm2 şişeleri %1 IFCS (10 mL/yıkama) ile desteklenmiş yüksek glikozlu DPBS ile 2x yıkayın. DPBS/%1 IFCS'yi epire edin ve 7 mL virüs inoculum/T-150 cm2 şişe ekleyin.
- İnoculumun Vero monolayer üzerinde uygun dağılımı için bir şişe rocker kullanarak şişeleri 5 dakika hafifçe sallayın ve ardından şişeleri 37 °C'de 1,5-2 saat kuluçkaya yatırın. İnkübatör rafın düz olduğundan emin olun.
- Inoculum'u çıkarın ve %1 IFCS (25 mL/şişe) ile desteklenmiş DMEM ekleyin. Şişeleri 2-4 gün kuluçkaya yatırın.
- Virüs inokülumunun hazırlanması
- Şişeleri günlük %90-100 CPE için kontrol edin (bkz. Şekil 2).
- OHSV ile enfekte olmuş Vero hücrelerini hasat edin.
- Kültür üstnatantını (~20 mL) her şişeden (her şişede ~5 mL bırakın) 50 mL konik santrifüj tüplerinde veya ortam kabında toplayın.
- Hücreleri şişelerin dibinden hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
NOT: Hücreler hızla şişelerden çıkmalıdır. - Her şişeye ~15 mL kültür süpernatantını ekleyin (adım 1.4.1'de toplanır) (her şişede ~20 mL hacmini, yani 20 şişe için 400 mL'lik hacim getirir) ve şişelerin altını 10 mL steril serolojik pipet kullanarak birkaç kez hafifçe yıkayın.
NOT: Kuvvetli bir şekilde boru yapmayın. Tüm hücreleri sağlam tutmayı hedefleyin. - Hücreleri (+ orta) buz üzerinde 50 mL konik santrifüj tüpleri halinde toplayın (20 şişeden 400 mL hasat edilen hücreleri tutmak için 8 tüp kullanın).
- Hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 g'da döndürün ve süpernatantı aspire edin.
- 1,25 mL ekleyin (%50) Virüs Arabelleği (VB) ve 1,25 mL (%50) kültür süpernatantı (adım 1.4.1'de toplanır) her santrifüj tüpüne ve her peletin iyice yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri sekiz adet 50 mL santrifüj tüpünden bir adet 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Tablo 1'deVB çözümünün hazırlanmasına bakın. Vb çözeltisini bir ortam sterilizasyon filtresi kullanarak filtreleyin. Yeniden süspansiyon için T-150 cm 2 şişe başına 0,5 mL VB +0,5 mL süpernatant kullanın, yani 20 şişe (20 mL) için 10 mL VB ve 10 mL kültür süpernatant kullanın. - Yeniden askıya alınan hücreleri kuru buz/%100 etanol kullanarak çıtlatın ve -80 °C'de saklayın.
2) oHSV saflaştırma
- Snap-freeze (kuru buzda ve% 100 etanolde)/çözünme (37 °C ılık su banyosunda) hücrelerin üst üste virüs salmasını sağlamak için toplam 3 döngü boyunca 1 dakika boyunca su banyosu sonication takip eder.
NOT: 40 kHz, 120 V güç kullanarak 1 dakika boyunca sonication gerçekleştirin. Ayarlanabilir bir sonicator mevcut değilse, ultrasonik su banyosu sonicator kullanın. Bölüm 3'te titrasyon için 50 μL aliquot alın, bu da saflaştırma prosedürü sırasında aşağıdaki adımlardan hangisinin potansiyel virüs kaybından sorumlu olduğunu belirlemeye yardımcı olacaktır. - Hücre lisatını Benzonase Nükleaz (175 birim/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M stok = 2 μL/mL), girdap ile tedavi edin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü buza yerleştirin ve aşağıdaki adımları 4 °C'de uygulayın.
- Düşük hızlı santrifüjleme ile hücre kalıntılarını peletle.
- Hücre lisatını 10 dakika boyunca 300 g'da döndürün.
- Süpernatantı yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpünde toplayın (hücre peletini 0,5 mL VB'de yeniden askıya alın, pelet-1 olarak belirleyin ve adım 2.3.5'te kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın; bkz. Şekil 1).
- Süpernatantı (adım 2.3.2'de elde edilir) 10 dakika boyunca 500 g'da tekrar döndürün.
- Süpernatantı yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpünde toplayın (hücre peletini 0,5 mL VB'de yeniden askıya alın, pelet-2 olarak belirleyin ve adım 2.3.5'te kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın; bkz. Şekil 1).
- Yeniden askıya alınan pelet-1 (2.3.2'den itibaren) ve pelet-2'yi (2.3.4'ten itibaren) yeni bir 1.7 mL santrifüj tüpünde, girdap / sonicate (su banyosu) 2x'te birleştirin ve 10 dakika boyunca 400 g'da döndürün. Süpernatantı toplayın ve adım 2.3.4'te elde edilen üstünlükle birleştirin; Bkz. Şekil 1).
NOT: 2.4. adımda filtrasyon prosedüründen önce viral toplamayı önlemek için 40 kHz, 120 V güç kullanarak 1 dakika boyunca sonication gerçekleştirin. Bölüm 3'te titrasyon için kombine süperndantin 50 μL aliquot'ını alın.
- Aşağıdaki 3 adımlı filtrasyon yöntemini kullanarak birleşik süpernatantı (~21 mL, yani 1,4,6'dan 20 mL, 2,3,2'den 0,5 mL ve 2,3,4'ten 0,5 mL) filtreleyin.
- 10 mL şırıng kullanarak (filtreden kolay geçiş için her seferinde 5-7 mL) süpernatanttan 21 mL çizin ve yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne (TUBE 1olarak etiketlenmiş) yerleştirilen steril 5 μm polivinylidene difluoride (PVDF) membran filtresinden geçirin.
- 2.4.1'de boşaltılmış 50 mL konik santrifüj tüpüne 1 mL VB ekleyin (kalan virüs süpernatant miktarını toplamak için), girdap ve TUBE 1'e yerleştirilen aynı 5 μm PVDF filtreden geçirin (toplamı 22 mL filtrata getirin). 2.4.2 adımına geçin.
- TUBE 1'den (2.4.1'de olduğu gibi) 22 mL filtrat çekin ve yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne (TUBE 2 olarak etiketlenmiş) yerleştirilen steril 0,8 μm karışık selüloz ester (MCE) membran filtresinden geçirin.
- 2.4.2, girdap adımında boşaltılan TUBE 1'e 1 mL VB ekleyin ve TUBE 2'ye yerleştirilen aynı 0.8 μm MCE filtresinden geçirin (toplam 23 mL filtrat ekleyin). 2.4.3 adımına geçin.
- TUBE 2'den 23 mL filtrat çekin (2.4.1'de olduğu gibi) ve yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne (TUBE 3olarak etiketlenmiş) yerleştirilen steril 0.45 μm PVDF filtreden geçirin.
- 2.4.3, girdap adımında boşaltılan TUBE 2'ye 1 mL VB ekleyin ve TUBE 3'e yerleştirilen aynı 0.45 μm PVDF filtresinden geçirin (toplam 24 mL filtrat ekleyin).
NOT: Bölüm 3'te titrasyon için filtrat 50 μL aliquot alın.
- 2.4.3, girdap adımında boşaltılan TUBE 2'ye 1 mL VB ekleyin ve TUBE 3'e yerleştirilen aynı 0.45 μm PVDF filtresinden geçirin (toplam 24 mL filtrat ekleyin).
- 10 mL şırıng kullanarak (filtreden kolay geçiş için her seferinde 5-7 mL) süpernatanttan 21 mL çizin ve yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne (TUBE 1olarak etiketlenmiş) yerleştirilen steril 5 μm polivinylidene difluoride (PVDF) membran filtresinden geçirin.
- Sakkaroz gradyan yöntemini kullanarak yüksek hızlı santrifüjleme
NOT: Bu protokolde sabit açılı F13-14x50cy rotor kullanılmıştır. Aşağıdaki adımlara geçmeden önce hem rotor hem de santrifüj 4 °C'de olmalıdır.- Yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne 10 mL buz gibi, steril filtreli %25 sakkaroz çözeltisi (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin 100 mL'sinde 25 g sakkaroz tozu çözülerek hazırlanır) ekleyin.
- Yavaşça (3 mL / dak) sakkaroz tabakasının üzerine 24 mL virüs filtratı (adım 2.4.3.1'den elde edilir) ekleyin. Virüs filtratının ve sakkaroz çözeltisinin ayrı katmanlarını korumaya özen edin.
NOT: Virüs tabakasının 30 mL'ye kadar olan kısmı sakkaroz çözeltisinin 10 mL'sine kadar eklenebilir. - Tüpü 4 °C'de 22.620 g'da 90 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantı ve sakkaroz tabakasını 50 mL konik santrifüj tüpünden çıkarın.
NOT: Virüs peleni beyazımsı olmalıdır. Bölüm 3'te titrasyon için süpernatanttan 50 μL aliquot ve sakkaroz tabakasının 50 μL aliquot'ını alın.
- Peleti % 10 gliserol / PBS çözeltisinde yeniden askıya alın.
- Peleti örtmek için 50 mL konik santrifüj tüpüne 1 mL steril % 10 gliserol (PBS ile seyreltilmiş) ekleyin.
NOT: Yeniden askıya alınan karışımın miktarı pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir (0,8-1,2 mL gibi). Daha küçük bir hacim daha yüksek bir virüs konsantrasyonu sağlar. - 50 mL konik santrifüj tüpünü 2-4 saat boyunca buza yerleştirin. Bu süre zarfında, peletin yerinden edilmesine / yeniden askıya almasına yardımcı olmak için 30 s boyunca her 15 dakikada bir pelet sonatik/girdap.
- Yeniden askıya alınan peleti (1 mL% 10 gliserol / PBS + pelet boyutu toplam hacmi ~ 1.3 mL'ye getirecektir) 2 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın. [İsteğe bağlı: Peletin kalan iz miktarını toplamak için aynı 50 mL konik santrifüj tüpüne 0,3 mL daha ekleyin, yukarı ve aşağı borulayın ve toplam hacmi ~1,6 mL'ye getirmek için 2.6.3 adımında yeniden askıya alınan peletle birleştirin.]
- 2.6.3 adımındaki süspansiyon bulanık veya bulutluysa (hücre kalıntıları nedeniyle), tüpü 10 dakika boyunca 500 g'da santrifüj edin, süpernatantı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2.6.4 adımına geçin.
- Bölüm 3'te oHSV titrasyonu için 50 μL aliquot alın. Çözeltinin geri kalanını (250 μL/aliquot) vidalı kapaklı steril mikrosantrifüj tüplere (uzun süreli depolama için iyi kapatılmış), snap-freeze'e alın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın (oHSV titresi belirlendikten sonra deneysel çalışmalara hazır).
NOT: Virüsle temas eden tüm malzemeler, kaputtan veya bertaraftan çıkarılmadan önce ultraviyole radyasyonla ağartılmalı veya tedavi edilmelidir.
- Peleti örtmek için 50 mL konik santrifüj tüpüne 1 mL steril % 10 gliserol (PBS ile seyreltilmiş) ekleyin.
3. oHSV titrasyon ve plak tahlil
- Tohum 1.7-1.8 x 105 Vero hücreleri/kuyu vero hücre ortamında 6 kuyulu hücre kültür plakasında (%10 IFCS ile DMEM; bkz. adım 1.1).
NOT: Hücrelerin kuyu boyunca homojen bir şekilde dağıtıldığından emin olun; kuyuların ortasında hücrelerin birikmesine neden olabilecek plakayı döndürmeyin. Girdabı önlemek için, plakayı yavaşça elle dikey, sonra yatay olarak sallayın ve ardından plakayı inkübatöre hafifçe yerleştirin. - Ertesi gün (hücreler% 70-80 izdiah ulaştığında), kültür ortamını aspire edin ve% 1 IFCS ile desteklenmiş 1 mL / kuyu yüksek glikoz PBS ekleyin. 3.3. adım tamamlanana kadar plakayı hücre kültürü başlığında bırakın.
- PBS/%1 IFCS kullanarak 5 mL polipropilen tüplerde virüsü seri olarak seyreltin (Şekil 3).
NOT: Seri seyreltme için 2.6.4 adımında toplanan 50 μL aliquot'ı kullanın. 1st tüpte (10-3 seyreltme), 1998'de 2 μL virüs ekleyin μL PBS / 1% IFCS, girdap. 2nd tüpte (10-5 seyreltme), PBS/% 1 IFCS, girdap 990 μL'de 1st tüpten 10 μL alın. 3rd tüpte (10-6 seyreltme), 900 μL PBS / % 1 IFCS, girdapta 2nd tüpten 100 μL alın; 10 kat seri seyreltme 10-9 seyreltme kadar devam. Şekil 3'tekiayrıntılara bakın. - PBS/1% IFCS'yi aspire edin ve Vero hücrelerine seri olarak seyreltilmiş virüsün (10-5 ila 10-9'danbaşlayarak) 0,7 mL / kuyu ekleyin.
NOT: Hücrelerin kurumasına izin vermeyin. - Plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir rocker üzerinde hafifçe sallayın (virüs inoculumunun homojen dağılımını sağlamak için).
- Plakayı 37 °C'de 1,5 saat kuluçkaya yaslanın.
NOT: Bu kuluçka döneminde, DMEM'de %1 IFCS ile desteklenmiş 1:1000 insan immünoglobulin G (IgG) seyreltilmesini hazırlayın. 6 kuyulu bir plaka için, 12,5 mL hazırlayın, böylece 3,7 adımda 2 mL / kuyu kullanılabilir. Seyreltmeyi, insan IgG'sinde lot varyasyonlarını hesaba katacak şekilde ayarlayın. - Virüs inoculumunu kuyulardan çıkarın ve %1 IFCS ile desteklenmiş DMEM'de %0,1 insan IgG'sinin 2 mL/kuyusunu ekleyin (kültür ortamında oHSV'yi nötralize etmek ve ikincil plak oluşumunu önlemek için). Plakayı 3-4 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Berrak plaklar genellikle 3 gün içinde oluşur. - Plakaları sabitleme ve boyama
- Üstnatantı çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca saf metanol (1 mL / kuyu) içinde sabitleyin. Metanol çıkarın ve plakaların havayla kurumasını bekleyin.
- Giemsa lekesini (1:5) deiyonize suyla seyreltin ve kuyu başına 1 mL seyreltilmiş Giemsa lekesi ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Lekeyi çıkarın, musluk suyuyla durulayın ve plakaların havayla kurumasını bekleyin.
- Parçalayan bir mikroskop kullanarak plakları sayın.
- LacZ ifadeli oHSV'ler için isteğe bağlıdır:
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri soğuk% 0.2 glutaraldehit / % 2 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 5-10 dakika sabitlayın.
- Fiksatif çözeltiyi çıkarın ve hücreleri PBS ile 3x yıkayın.
- Hücrelere X-gal çözeltisi ekleyin (1 mL / kuyu) ve plakayı 2 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: X-gal lekesi lekelenme gününde taze olarak hazırlanmalıdır; uzun süreli depolama, rengin solmasına neden olabilir. Tablo 1'deX-gal çözümünün hazırlanmasına bakın. - X-gal lekesini çıkarın ve plakayı musluk suyuyla 1 dakika yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca Nötr Kırmızı çözeltili (1 mL/ kuyu) karşı leke.
NOT: Tablo 1'deNötr Kırmızı çözeltinin hazırlanmasına bakın. - Plakayı musluk suyu ile 1 dakika yıkayın; plakaların havayla kurumasını bekleyin.
- Diseksiyon mikroskobu kullanarak mavi plakları sayın (Şekil 4).
- Formül kullanarak titreyi hesaplama (2)
PFU/mL'de titer (plak oluşturan üniteler) = Plak sayısı/0,7 mL × seyreltme faktörü (2)
NOT: Örneğin, 10-9 seyreltme kuyusunda 25 plak bulunursa, titre 25/0,7 × 10 9 =35,7 × 109 = 3,57 ×10 10 pfu/mL'dir. Bu, adım 2.6.4'te hazırlanan aliquotların son oHSV titer'ıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm protokolün kısa bir özeti Şekil 1'de, oHSV'nin büyümesi, saflaştırılması ve titrasyonunda yer alan kritik adımları temsil eder. Vero hücrelerinde CPE, HSV sonrası enfeksiyon 19.000'de4saat kadar erken tespit edilebilir. Şekil 2, Vero hücrelerinde OHSV enfeksiyonundan sonra üç farklı zaman noktasında CPE'yi göstermektedir. CPE seviyesi zamanla artar. Bu protokolde, genellikle düşük MOI oHSV aşılamasının 48 saat içinde %90-100 CPE gözlenir (saflaştırma için hücreleri hasat etmek için en iyi zamandır). Ancak, 1.2 adımında aşılanan oHSV MOI'ye ve/veya oHSV'nin çoğaltma potansiyeline bağlı olarak 4 güne kadar sürebilir. Bu sürenin ötesinde, CPE'li hücreler, virüsün süpernatanta salınmasınınsına yol açan lysed edilebilir. Bu nedenle, yüksek viral bir titre elde etmek için, CPE'den etkilenen hücreleri sağlam olduklarında hasat etmek önemlidir. Son virüs titresine katkıda bulunan bir diğer önemli faktör de oHSV amplifikasyonu için kullanılan doku kültürü şişelerinin sayısı veya büyüklüğüdür. Şekil 3, plak testinin titer tayini için gerekli olan belirli bir virüs stoğunun seri seyreltme işlemini (10-3 ila 10-9)(adım 2.6.4'te elde edilir) tasvir eder. LacZ ekspresyonlu oHSV'ler için viral plaklar X-gal boyama ile görselleştirilebilir (Şekil 4). Bu protokolde 1 × 10 10 pfu/mL titre ile 1.3-1.6 mL oHSV stokunun beklenebilir olduğu20 adet T-150 cm2 adet doku kültürü şişesi kullanılmıştır.
Şekil 1: OHSV büyümesi, saflaştırılması ve plak tahlilinde yer alan önemli adımların şematik sunumu. Kısaltmalar: oHSV = onkolitik herpes simpleks virüsü; CPE = sitopatik etki; VB = Virüs Arabelleği; HBSS = Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OHSV enfeksiyonu sonrası Vero hücrelerinde sitopatik etki. Vero hücreleri 0.01 MOI'de mCherry için oHSV kodlaması (kırmızı floresan olarak gösterilmiştir) ile aşılandı ve 36, 48 ve 72 h virüs sonrası enfeksiyonda (10x büyütme) görüntülendi. CPE, oHSV ile enfekte olmuş hücrelerin yuvarlanmasıyla tanımlanır (siyah oklarla gösterilir). Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltma: oHSV = onkolitik herpes simpleks virüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Plak tahlilleri için bir oHSV stoğunun seri seyreltilmesi. Ayrıca bkz. Kısaltma: oHSV = onkolitik herpes simpleks virüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: OHSV sonrası enfeksiyonda 72 saat X-gal lekeli plakların temsili bir görüntüsü. Seyreltilmemiş (üst kuyu) ve seyreltilmemiş (1:10; alt kuyu) oHSV ile enfekte hücre kültürü süpernatantları Vero hücrelerine eklendi (%70-80 birleştiğinde), ardından bölüm 3.8.5'te açıklanan X-gal boyama protokolü (Nötr Kırmızı ile karşı boyama hariç). X-gal lekeli bir virüs plağı (sol panelden) temsili görüntüleri ortada (4x; ölçek çubukları = 1000 μm) ve sağda (10x; ölçek çubukları = 200 μm) panellerde sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm Kompozisyonu | |
| Virüs tamponunun hazırlanması | miktar |
| 1 M Sodyum klorür | 15 mL |
| 1 M Tris-hidroklorür | 3 mL |
| Arıtılmış su | 132 mL |
| pH'ı 6,8'e ayarlama | |
| X-gal çözeltisinin hazırlanması (bir 6 kuyu plakası için ~ 6.5 mL) | |
| 250 mM potasyum ferrikyanür | 130 μL |
| 250 mM potasyum ferrosiyanür | 130 μL |
| 1 M Magnezyum klorür | 13 μL |
| X-gal önceden çözülmüş (20 mg/mL) dimetil sülfit (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Bir adet 6 kuyu plakası için Nötr Kırmızı çözelti hazırlanması | |
| Nötr Kırmızı çözüm | 100 μL |
| metanol | 1 mL |
| Arıtılmış su | 7 mL |
Tablo 1: Çözelti bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol, düşük geçişli Vero hücrelerinde oHSV'nin büyümesiyle başlar. Vero hücre monolayerinin izdiahı, aşırı büyümüş hücreler Vero hücrelerine oHSV girişini azaltabilecek sıkı lifli yapılar geliştirebileceğinden virüs aşısı sırasında ~% 80 olmalıdır 20. % 90-100 CPE gözlendikten sonra, kültür süpernatantı çıkarılır, hücreler toplanır, VB / supernatant'ta yeniden depolanır (bkz. adım 1.4.6), snap-frozen ve daha sonra saflaştırma için -80 ° C'de saklanır. Blaho ve meslektaşları, enfekte Vero hücrelerinin toplanması ve depolanmasının biraz farklı bir yöntemini istihdam etti. Örneğin, hücreleri ve kültür medyasını içeren şişeler (% 1 sığır serum albümin ve potasyumlu PBS ile desteklenir) başlangıçta -80 ° C'de en az 15 dakika boyunca saklanır ve ardından şişelerin oda sıcaklığında yavaşça ısınması. Hücreler daha sonra hasat edilir, steril sütle karıştırılır ve saflaştırma 20'ye kadar-80° C'de saklanır. Bu durumda, steril süt bir dengeleyici görevi görür ve steril süt / ortamda depolandığında bir virüs stoğunun titresinin sadece orta20'yegöre önemli ölçüde daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, başka bir çalışmada, -80 ° C'de birkaç herpesvirüsün depolenmesi için kullanılan farklı stabilizatörler (steril süt dahil) arasında doğrudan bir karşılaştırma, nihai virüs titreleri üzerinde önemli bir etki göstermedi21. Burada, hücre peleti VB'de tris-tampon salin (pH 6.8) ve% 10 gliserol ile bir depolama dengeleyici olarak oluşturulmuş, bu da genellikle deneysel çalışmalar için yüksek bir virüs titresi (adım 3.10'da belirtildiği gibi) verir.
Yüksek kaliteli bir virüs stoğu elde etmek için hücresel ve medya ile ilgili tüm bileşenlerin yeniden askıya alınan peletten çıkarılması önemlidir. Viral olmayan parçacıkların uzaklaştırılması, in vivo deneyler sırasında potansiyel bağışıklık reaksiyonlarını önlemek için çok önemlidir. Santrifüjleme22, farklı gradyan yöntemleri 23 , filtrasyon24ve benzeşim kromatografisi25dahil olmak üzere çeşitli virüs saflaştırma yöntemleri tanımlanmıştır. Bu protokol sakkaroz-gradyan yöntemi kullanılarak yüksek hızlı santrifüjlemeye dayansa da, iodixanol11,26 , Percoll27ve Ficoll-Nycodenz23gibi başkaları tarafından çeşitli gradyan yöntemleri kullanılmıştır. Bu gradyan yöntemleri virüsü yoğunluğa göre ayırır ve virüsün peletlendiği sakkaroz yastığı yerine bandın gradyandan izole edilmesini gerektirir. Sakkaroz-gradyan yöntemi, viral enfeksiyattan korurken viral zarf proteinlerini bozma riskini en aza indirdiği için viral parçacıkları ayırmak için nazik bir yaklaşım sunar. Bu avantajlara rağmen, konsantre sakkaroz çözeltisinin yüksek ozmolaritesi viral parçacıkları susuz bırakabilir; bu nedenle, bu dezavantajın üstesinden gelmek için iyodixanol gradyan yöntemi geliştirilmiştir. Bununla birlikte, iyodixanol gradyan yöntemi ultracentrifuge ve virion bandının toplanmasını gerektirir. OHSV saflaştırması sırasında dikkate alınması gereken diğer faktörler, santrifüjlenme hızı ve zamanı ve uzun süreli depolama için kullanılan virüs tamponunun seçimidir. Bu protokol, oHSV'nin saflığının onaylanmaması sınırlamasına sahiptir; bununla birlikte, belirli bir saflaştırılmış oHSV stoğunda Vero hücreleri üzerinde titrasyon ile yüksek sayıda fonksiyonel virüs parçacığı bulunmuştur (bkz. bölüm 3).
oHSV, Vero hücreleri üzerinde plaklar oluşturur (Şekil 4). Viral plaklar, kolay ve kullanışlı bir yöntem olan Giemsa lekeleme ile tanımlanabilir. Giemsa, Vero hücrelerini lekeler, viral plakları kolayca görselleştirilebilen (çıplak göz) ve diseksiyon mikroskobu kullanılarak sayılan şeffaf veya boş bırakır. Medyayı agarose veya metilselüloz ile kaplamak, virüsün yayılmasını önlemek için plak oluşumu sırasında (adım 3.7'de) yaygın olarak kullanılırken ve ikincil enfeksiyonlar ve plak kuyrukları28, kültür süpernatantında oHSV'yi nötralize etmek için insan IgG kullanımı daha kolay ve daha uygundur. LacZifade eden oHSV'ler için plaklar X-gal boyama ile görselleştirilebilir (Şekil 4), floresan mikroskopi floresan protein (yani yeşil floresan protein) ifade eden oHSV'ler için kullanılır18. oHSV ile enfekte olmuş hücreleri tespit etmek için ek tahliller arasında immün-histokimyasal veya -floresan ile oHSV spesifik antikorlar29 veya yakın kızılötesi florofor-konjuge oHSV spesifik antikorların lazer tabanlı taranması30bulunur.
Mikrobiyal (bakteri, maya veya küf) kirlenmesini ve sağlıklı Vero hücrelerini önlemek için steriliteyi korumak gibi iyi bir virüs stoğu elde etmek için uyulması gereken kritik önlemler vardır. oHSV zarfı son derece termosensitifolduğundan 20, oHSV stoğu% 10 gliserol gibi bir kriyoprotektifte ele alınmalıdır. Genel olarak, bu protokol laboratuvar ortamında kolayca kullanılabilir ve uygulanabilir, ancak büyük ölçekli virüs üretimi için yararlı olmayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR, Amgen ve ActiVec Inc.'den telif hakkı alan ve EG 427 Bilimsel Danışma Kurulu'nda yer alan Georgetown Üniversitesi ve Massachusetts General Hospital'ın sahibi ve yönettiği onkolitik herpes simpleks virüsleri ile ilgili patentler konusunda ortak bir mucittir. Diğer yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Saha laboratuvarındaki araştırmalar kısmen DOD (W81XWH-20-1-0702) ve Dodge Jones Foundation-Abilene'den gelen fonlar tarafından desteklendi. Samuel D. Rabkin ve Melissa R.M. Humphrey nih (R01 CA160762) tarafından kısmen desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
