Summary
Neste manuscrito, descrevemos um método simples de crescimento, purificação e titulação do vírus herpes simplex oncolítico para uso pré-clínico.
Abstract
Os vírus oncolíticos (OVs), como o vírus herpes simplex oncolítico (oHSV), são uma estratégia de tratamento em rápido crescimento no campo da imunoterapia contra o câncer. Os OVs, incluindo oHSV, replicam-se seletivamente e matam células cancerígenas (poupando células saudáveis/normais) ao induzir a imunidade anti-tumor. Devido a essas propriedades únicas, as estratégias de tratamento baseadas em oHSV estão sendo cada vez mais utilizadas para o tratamento do câncer, preclinicamente e clinicamente, incluindo talimogene laherparevec aprovado pela FDA (T-Vec). Crescimento, purificação e titulação são três técnicas essenciais de laboratório para quaisquer OVs, incluindo oHSVs, antes que possam ser utilizados para estudos experimentais. Este artigo descreve um método simples passo a passo para amplificar oHSV em células Vero. À medida que os OHSVs se multiplicam, eles produzem um efeito citopático (CPE) nas células Vero. Uma vez que 90-100% das células infectadas apresentam um CPE, elas são colhidas suavemente, tratadas com cloreto de benzonase e magnésio (TMN2),filtradas e submetidas à purificação usando o método de suênula-gradiente. Após a purificação, o número de oHSV infecciosos (designados como unidades formadoras de placas ou PFUs) é determinado por um "ensaio de placa" em células Vero. O protocolo aqui descrito pode ser usado para preparar estoque de oHSV de alta titulação para estudos in vitro na cultura celular e experimentos in vivo em animais.
Introduction
Os vírus oncolíticos (OVs) são uma forma emergente e única de imunoterapia contra o câncer. Os OVs replicam-se seletivamente em células tumorais e lises (poupando células normais/saudáveis)1 ao induzir imunidade anti-tumor2. O vírus herpes simplex oncolítico (oHSV) é um dos vírus mais estudados entre todos os OVs. É mais distante na clínica, com Talimogene laherparepvec (T-VEC) sendo o primeiro e único OV a receber aprovação da FDA nos EUA para o tratamento de melanoma avançado3. Além do T-VEC, muitos outros oHSVs geneticamente modificados estão sendo testados pré-clínico e clinicamente em diferentes tipos de câncer3,4,5,6,7,8. A atual biotecnologia avançada de DNA recombinante aumentou ainda mais a viabilidade da engenharia de novos oHSVs codificação para transgenes terapêuticos3,5. Um sistema eficiente de propagação, purificação e determinação de oHSV é fundamental antes que qualquer oHSV (recém-desenvolvido) possa ser testado para estudos in vitro e in vivo. Este artigo descreve um método simples passo-a-passo de crescimento oHSV (em células Vero), purificação (pelo método de gradiente de sacarose) e titulação (por um ensaio de placa oHSV em células Vero)(Figura 1). Pode ser facilmente adotado em qualquer configuração de laboratório de Nível 2 (BSL2) de Biossegurança para obter um estoque viral de alta qualidade para estudos pré-clínicos.
Vero, uma linha de células renais de macaco verde africano, é a linha celular mais usada para propagação oHSV9,10,11,12,13 como as células Vero têm uma via de sinalização antiviral defeituosa14. Outras linhas celulares com estimulador inativado de sinais de genes interferon (STING) também podem ser usadas para o crescimento oHSV12,13. Este protocolo utiliza células Vero para o crescimento e ensaio de placas oHSV. Após a propagação, as células infectadas pelo OHSV são colhidas, lised e submetidas à purificação, onde as células lised são tratadas pela primeira vez com nuclease de benzonase para degradar o DNA das células hospedeiras, prevenir a agregação nucleico ácido-proteína e reduzir a viscosidade do lisato celular. Como a ativação adequada da benzonase muitas vezes requer Mg2+, 1-2 mM MgCl2 é usado neste protocolo15. Os detritos de células hospedeiras do lysato celular tratado com benzonase são ainda mais eliminados pela filtragem serial antes da centrifugação de sáuera-gradiente de alta velocidade. Uma almofada viscosa de solução de sacarose de 25% ajuda a garantir uma taxa mais lenta de migração de vírus através da camada de sacarose, deixando componentes relacionados com células hospedeiras no sobrenante, melhorando assim a purificação e limitando a perda de vírus na pelota16. O oHSV purificado é então titulado em células Vero, e placas virais são visualizadas por giemsa manchando17 ou X-gal staining (para LacZ codificando oHSVs)18.
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Protocol
1) crescimento do OHSV
NOTA: Garantir a aprovação do comitê de biossegurança institucional antes de trabalhar com o OHSV. Este estudo foi realizado sob o Protocolo IBC aprovado nº 18007. Mantenha as precauções BSL2: alvejante todas as tubulações, pontas, tubos e outros materiais que entram em contato com o vírus. Luvas de spray com 70% de álcool isopropílico antes que as mãos deixem o capô de cultura celular BSL2. Lave sempre as mãos com água com sabão depois de trabalhar com um vírus.
- No dia -1, as células vero de baixa passagem em 20 frascos T-150 cm2 a uma densidade de 7-8 × 106 células/frascos em meio de célula vero regular.
NOTA: O meio Vero é preparado suplementando o meio de águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com soro de bezerro fetal inativado a calor de 10% (IFCS). - No dia 0 (as células são 80-90% confluentes), adicione ohsv inóculo nas células Vero.
- Preparação do vírus inóculo
- Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (MOI pode variar de 0,01 a 0,1, dependendo da capacidade de replicação do vírus) para amplificação do vírus. Use a fórmula (1) para calcular a quantidade de vírus (mL) para 20 frascos.
Quantidade de vírus (mL) para 20 frascos = quantidade de vírus necessária (pfu)/titer de estoque de vírus (pfu/mL)(1) - Use a solução salina tamponada de fosfato de alta glicose Dulbecco (DPBS) suplementada com 1% de IFCS para preparar o inóculo do vírus (7 mL por frasco T-150 cm2, ou seja, ~140 mL para 20 frascos). Adicione a quantidade necessária de oHSV a 140 mL de solução DE ALTA glicose DPBS/1% IFCS, vórtice por 1 min, e mantenha a mistura pronta para adição às células Vero.
- Use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 (MOI pode variar de 0,01 a 0,1, dependendo da capacidade de replicação do vírus) para amplificação do vírus. Use a fórmula (1) para calcular a quantidade de vírus (mL) para 20 frascos.
- Lave os frascos T-150 cm2 2x com DPBS de alta glicose suplementados com 1% de IFCS (10 mL/lavagem). Aspire o DPBS/1% IFCS e adicione 7 mL de vírus inóculo/T-150 cm2 frasco.
- Balance suavemente os frascos por 5 min usando um roqueiro de frasco para distribuição adequada do inóculo sobre a monocamadoreira Vero, e, em seguida, incubar os frascos a 37 °C por 1,5-2 h. Certifique-se de que a prateleira da incubadora esteja nivelada.
- Remova o inóculo e adicione DMEM suplementado com 1% de IFCS (25 mL/frasco). Incubar os frascos por 2-4 dias.
- Preparação do vírus inóculo
- Verifique os frascos diariamente para 90-100% CPE (ver Figura 2).
- Colher as células vero infectadas pelo OHSV.
- Colete a cultura supernante (~20 mL) de cada frasco (deixe ~5 mL em cada frasco) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL ou recipiente de mídia.
- Use um raspador de células para raspar as células do fundo dos frascos suavemente.
NOTA: As células devem sair rapidamente dos frascos. - Adicione ~15 mL da supernasa cultura (coletada na etapa 1.4.1) a cada frasco (que traz o volume de ~20 mL em cada frasco, ou seja, 400 mL para 20 frascos) e lave suavemente o fundo dos frascos algumas vezes usando um tubo serológico estéril de 10 mL.
NOTA: Não encosto vigorosamente. Procure manter todas as células intactas. - Colete as células (+ média) em tubos de centrífuga cônica de 50 mL no gelo (use 8 tubos para conter 400 mL de células colhidas de 20 frascos).
- Gire as células a 300 g por 10 min a 4 °C e aspire o supernasce.
- Adicionar 1,25 mL (50%) de Tampão de Vírus (VB) e 1,25 mL (50%) de supernante de cultura (coletado na etapa 1.4.1) a cada tubo de centrífuga e re-suspender cada pelota completamente. Transfira as células re-suspensas de oito tubos de centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
NOTA: Consulte a preparação da solução VB na Tabela 1. Esterilize a solução VB por meio de um filtro de esterilização de mídia. Use 0,5 mL de VB + 0,5 mL de supernadante por frasco T-150 cm2 para re-suspensão, ou seja, para 20 frascos (20 mL), use 10 mL de VB e 10 mL de supernanato cultural. - Congele as células re-suspensas usando gelo seco/100% etanol e armazene a -80 °C.
2) purificação oHSV
- Snap-freeze (em gelo seco e 100% etanol)/degelo (em um banho de água morna de 37 °C) as células seguidas por sônica de banho de água por 1 min para um total de 3 ciclos para garantir a lise adequada das células para liberar vírus no supernante.
NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência. Se um sônico tunable não estiver disponível, use um sonicator de banho de água ultrassônico. Tome uma alíquota de 50 μL para titulação na seção 3, o que ajudará a identificar qual das etapas seguintes é responsável pela perda potencial do vírus durante o procedimento de purificação. - Trate o nuclease celular com Benzonase Nuclease (175 unidades/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M de estoque = 2 μL/mL), vórtice e incubar por 30 min a 37 °C. Coloque o tubo no gelo e realize as seguintes etapas a 4 °C.
- Pelota os detritos celulares por centrifugação de baixa velocidade.
- Gire a célula lysate a 300 g por 10 min.
- Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-1 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).
- Gire o supernante (obtido na etapa 2.3.2) novamente a 500 g por 10 min.
- Colete o supernante em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (suspenda a pelota celular em 0,5 mL de VB, designe-o como pelota-2 e armazene a 4 °C para uso na etapa 2.3.5; veja a Figura 1).
- Misture a pelota-1 re-suspensa (de 2.3.2) e a pelota-2 (de 2.3.4) em um novo tubo de centrífugo de 1,7 mL, vórtice/sonicato (banho de água) 2x e gire a 400 g por 10 minutos. Recolher o supernante e combiná-lo com o supernacido obtido na etapa 2.3.4; ver Figura 1).
NOTA: Realize a sonicação por 1 min usando 40 kHz, 120 V de potência para evitar a agregação viral antes do procedimento de filtragem na etapa 2.4. Tome uma alíquota de 50 μL do supernatante combinado para titulação na seção 3.
- Filtre o supernante combinado (~21 mL, ou seja, 20 mL de 1,4,6, 0,5 mL de 2,3,2 e 0,5 mL de 2,3,4) utilizando o seguinte método de filtragem de 3 etapas.
- Desenhe 21 mL do supernadante usando uma seringa de 10 mL (5-7 mL cada vez para fácil passagem através do filtro) e passe-a através de um filtro de membrana de difluoreto de polivinida de 5 μm estéril (PVDF) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 1).
- Adicione 1 mL de VB a um tubo de centrífuga cônica de 50 mL esvaziado em 2,4,1 (para coletar a quantidade restante de vestígios de supernascido do vírus), vórtice, e passar pelo mesmo filtro PVDF de 5 μm colocado no TUBE 1 (elevando o total para 22 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.2.
- Retire 22 mL do filtro do TUBE 1 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro de membrana estéril de 0,8 μm de ester de celulose mista (MCE) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 2).
- Adicione 1 mL de VB ao TUBE 1 esvaziado na etapa 2.4.2, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro MCE de 0,8 μm colocado no TUBE 2 (elevando o total para 23 mL de filtrado). Prossiga para a etapa 2.4.3.
- Desenhe 23 mL de filtrado do TUBE 2 (como em 2.4.1) e passe-o através de um filtro PVDF de 0,45 μm estéril colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 3).
- Adicione 1 mL de VB ao TUBE 2 esvaziado na etapa 2.4.3, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro PVDF de 0,45 μm colocado no TUBE 3 (elevando o total para 24 mL de filtrado).
NOTA: Tome uma alíquota de 50 μL do filtrado para titulação na seção 3.
- Adicione 1 mL de VB ao TUBE 2 esvaziado na etapa 2.4.3, vórtice, e passe-o através do mesmo filtro PVDF de 0,45 μm colocado no TUBE 3 (elevando o total para 24 mL de filtrado).
- Desenhe 21 mL do supernadante usando uma seringa de 10 mL (5-7 mL cada vez para fácil passagem através do filtro) e passe-a através de um filtro de membrana de difluoreto de polivinida de 5 μm estéril (PVDF) colocado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL (rotulado como TUBE 1).
- Centrifugação de alta velocidade usando o método de gradiente de sacarose
NOTA: Um rotor F13-14x50cy de ângulo fixo foi usado neste protocolo. Tanto o rotor quanto a centrífuga devem estar a 4 °C antes de prosseguir com as etapas seguintes.- Adicione 10 mL de uma solução de sacarose filtrada 25% filtrada estéril (preparada dissolvendo 25 g de pó de sacarose em 100 mL da Solução de Sal Balanceado da Hank) em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
- Lentamente (3 mL/min) adicione 24 mL do filtrado do vírus (obtido a partir da etapa 2.4.3.1) em cima da camada de sacarose. Tome cuidado para manter camadas separadas do vírus filtrado e da solução de sacarose.
NOTA: Até 30 mL da camada do vírus podem ser adicionados mais de 10 mL da solução de sacarose. - Centrifugar o tubo por 90 min a 22.620 g a 4 °C.
- Remova o supernatante e a camada de sacarose do tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
NOTA: A pelota do vírus deve ser esbranquiçada. Tome uma alíquota de 50 μL do supernante e uma alíquota de 50 μL da camada de sacarose para titulação na seção 3.
- Suspenda a pelota em solução de 10% de glicerol/PBS.
- Adicione 1 mL de glicerol estéril de 10% (diluído em PBS) ao tubo de centrífuga cônica de 50 mL para cobrir a pelota.
NOTA: A quantidade da mistura re-suspensa pode variar (como 0,8-1,2 mL) dependendo do tamanho da pelota. Um volume menor daria uma maior concentração de vírus. - Coloque o tubo de centrífuga cônica de 50 mL no gelo por 2-4 h. Durante este período, sonicato/vórtice a pelota a cada 15 minutos por 30 s para ajudar a desalojar/suspender a pelota.
- Recolher a pelota re-suspensa (1 mL de 10% de glicerol/PBS + o tamanho da pelota levará o volume total para ~1,3 mL) em um tubo de microcentrifusagem de 2 mL. [Opcional: Adicione mais 0,3 mL de 10% de glicerol/PBS ao mesmo tubo de centrífuga cônica de 50 mL para coletar a quantidade restante de traço da pelota, pipeta para cima e para baixo, e combine com a pelota re-suspensa na etapa 2.6.3 para levar o volume total a ~1,6 mL.]
- Se a suspensão na etapa 2.6.3 for turva ou nublada (devido a detritos celulares), centrifugar o tubo a 500 g por 10 min, transfira o supernante para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL e prossiga para a etapa 2.6.4.
- Tome uma alíquota de 50 μL para titulação oHSV na seção 3. Aliquot o resto da solução (250 μL/aliquot) em tubos de microcentrifusagem estéril com tampas de parafuso (selada bem para armazenamento a longo prazo), snap-freeze e armazenar a -80 °C até o uso (pronto para estudos experimentais uma vez que o oHSV é determinado).
NOTA: Todos os materiais que entram em contato com o vírus devem ser branqueados ou tratados com radiação ultravioleta antes da remoção do capô ou descarte.
- Adicione 1 mL de glicerol estéril de 10% (diluído em PBS) ao tubo de centrífuga cônica de 50 mL para cobrir a pelota.
3. titulação oHSV e ensaio de placa
- Semente 1.7-1.8 x 105 células Vero/bem em uma placa de cultura celular de 6 poços no meio celular Vero (DMEM com 10% IFCS; ver passo 1.1).
NOTA: Certifique-se de que as células estão distribuídas de forma homogênea por todo o poço; não gire a placa, o que pode causar acúmulo de células no meio dos poços. Para evitar rodopiar, balance lentamente a placa à mão verticalmente, depois horizontalmente, e, em seguida, coloque suavemente a placa na incubadora. - No dia seguinte (quando as células atingem 70-80% de confluência), aspiram o meio cultura e adicionam 1 mL/poço de PBS de alta glicose suplementada com 1% de IFCS. Deixe a placa no capô da cultura celular até que o passo 3.3 esteja completo.
- Diluir o vírus em tubos de polipropileno de 5 mL usando PBS/1% IFCS(Figura 3).
NOTA: Utilize a alíquota de 50 μL coletada na etapa 2.6.4 para diluição serial. No tubo 1 (10-3 diluição), adicione 2 μL do vírus em 1998 μL de PBS/1%IFCS, vórtice. No tubo 2 (10-5 diluição), tome 10 μL dotubo 1 em 990 μL de PBS/1% IFCS, vórtice. No tubo 3rd (diluição de 10-6), tome 100 μL do tubo2 em 900 μL de PBS/1% IFCS, vórtice; continuar esta diluição serial de 10 vezes até 10-9 diluição. Veja os detalhes na Figura 3. - Aspirar PBS/1% IFCS e adicionar 0,7 mL/bem do vírus diluído serial (a partir de 10-5 a 10-9) às células Vero.
NOTA: Não deixe as células secarem. - Balance suavemente a placa em um roqueiro por 5 minutos à temperatura ambiente (para garantir a distribuição homogênea do inóculo do vírus).
- Incubar a placa por 1,5 h a 37 °C.
NOTA: Durante este período de incubação, prepare 1:1000 diluição da imunoglobulina humana G (IgG) no DMEM complementada com 1% de IFCS. Para uma placa de 6 poços, prepare 12,5 mL para que 2 mL/bem possa ser usado na etapa 3.7. Ajuste a diluição para explicar as variações de lotes no IgG humano. - Remova o inóculo do vírus dos poços e adicione 2 mL/poço de IgG humano de 0,1% (para neutralizar o oHSV no meio da cultura e evitar a formação de placas secundárias) no DMEM complementado com 1% de IFCS. Incubar a placa a 37 °C durante 3-4 dias.
NOTA: Placas claras geralmente se formam em 3 dias. - Placas de fixação e coloração
- Remova o supernasce e fixe as células em metanol puro (1 mL/bem) por 5 minutos. Retire o metanol e deixe as placas secarem ao ar.
- Diluir a mancha de Giemsa (1:5) com água deionizada, e adicionar 1 mL da mancha de Giemsa diluída por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 10-15 min.
- Retire a mancha, enxágue com água da torneira e deixe as placas secarem ao ar.
- Conte as placas usando um microscópio dissecando.
- Opcional para oHSVs com expressão lacZ:
- Remova o supernasce e fixe as células com glutaraldeído de 0,2% a frio/2% paraformaldeído por 5-10 min à temperatura ambiente.
- Remova a solução fixa e lave as células 3x com PBS.
- Adicione a solução X-gal às células (1 mL/bem) e incubar a placa a 37 °C por 2 h.
NOTA: A mancha X-gal deve ser preparada recentemente no dia da coloração; armazenamento a longo prazo pode levar ao desbotamento de cor. Veja a preparação da solução X-gal na Tabela 1. - Retire a mancha X-gal e lave a placa com água da torneira por 1 min.
- Contra-mancha com solução Vermelha Neutra (1 mL/bem) por 2 min a temperatura ambiente.
NOTA: Veja a preparação da solução Vermelho Neutro na Tabela 1. - Lave a placa com água da torneira por 1 min; permitir que as placas sequem ao ar.
- Conte placas azuis usando um microscópio de dissecação(Figura 4).
- Calcule o título usando fórmula (2)
Titer em pfu/mL (unidades formadoras de placas) = Número de placas/0,7 mL × fator de diluição(2)
NOTA: Por exemplo, se 25 placas forem encontradas no poço de diluição10 -9, o título é 25/0,7 ×10 9 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Este é o último oHSV titer de alíquotas preparadas na etapa 2.6.4.
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Representative Results
Uma breve visão geral de todo o protocolo é retratada na Figura 1, que representa as etapas críticas envolvidas no crescimento, purificação e titulação do oHSV. CPE em células Vero pode ser detectado tão cedo quanto 4 h infecção pós-HSV19. A Figura 2 demonstra cpe em células Vero em três pontos de tempo diferentes após a infecção por OHSV. O nível do CPE é aumentado ao longo do tempo. Neste protocolo, 90-100% CPE é geralmente observado dentro de 48 h de inoculação oHSV de baixo MOI (que é o melhor momento para colher células para purificação). No entanto, pode levar até 4 dias, dependendo do oHSV MOI inoculado na etapa 1.2 e/ou no potencial de replicação do oHSV. Além desse período, as células com CPE podem ser liseadas, levando à liberação do vírus no supernasce. Assim, para obter um alto título viral, é fundamental colher células afetadas pelo CPE quando estiverem intactas. Outro fator importante que contribui para o titulador final do vírus é o número ou tamanho dos frascos de cultura tecidual usados para amplificação de oHSV. A Figura 3 retrata o processo de diluição serial (10-3 a 10-9) de um dado estoque de vírus (obtido na etapa 2.6.4) necessário para a determinação do titer pelo ensaio da placa. Para oHSVs com expressão lacZ, placas virais podem ser visualizadas por manchas X-gal(Figura 4). Neste protocolo, foram utilizados frascos de cultura tecidual T-150 cm2, para os quais 1,3-1,6 mL de estoque de oHSV com um título de 1 × 1010 pfu/mL podem ser esperados.
Figura 1: Apresentação esquemática das principais etapas envolvidas no crescimento, purificação e ensaio da placa. Abreviaturas: oHSV = vírus herpes simplex oncolítico; CPE = efeito citópico; VB = Tampão de vírus; HBSS = Solução de Sal Balanceado da Hank; PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito citopático nas células Vero após a infecção por OHSV. As células vero foram inoculadas com codificação oHSV para mCherry (mostrada em fluorescência vermelha) em um MOI de 0,01 e imageda (ampliação de 10x) a 36, 48 e 72 h de infecção pós-vírus. O CPE é identificado pelo arredondamento das células infectadas pelo OHSV (indicadas por setas negras). Barras de escala = 200 μm. Abreviação: oHSV = vírus herpes simplex oncolítico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Uma diluição serial de um estoque oHSV para ensaios de placa. Veja também a etapa 3.3 do protocolo. Abreviação: oHSV = vírus herpes simplex oncolítico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Uma imagem representativa de placas manchadas de X-gal a 72 h infecção pós-oHSV. Supernantes de cultura celular não diluídos (70-80% diluídos (1:10; bem inferior) da cultura celular infectada pelo OHSV adicionados às células Vero (70-80% confluentes), seguidos pelo protocolo de coloração X-gal descrito na seção 3.8.5 (excluindo contra-mancha com vermelho neutro). Imagens representativas de uma placa de vírus manchada de X-gal (do painel esquerdo) são apresentadas nos painéis médio (4x; barras de escala = 1000 μm) e direita (10x; barras de escala = 200 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composição da solução | |
| Preparação do tampão de vírus | quantidade |
| Cloreto de sódio de 1 M | 15 mL |
| 1 M Tris-cloridrato | 3 mL |
| Água purificada | 132 mL |
| ajustar pH para 6,8 | |
| Preparação da solução X-gal (~6,5 mL para uma placa de 6 poços) | |
| Ferricyanida de potássio de 250 mM | 130 μL |
| Ferrocianídeo de potássio de 250 mM | 130 μL |
| Cloreto de magnésio de 1 M | 13 μL |
| X-gal pré-dissolvido (20 mg/mL) em sulfóxido de dimetil (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Preparação de solução vermelha neutra para uma placa de 6 poços | |
| Solução vermelha neutra | 100 μL |
| metanol | 1 mL |
| Água purificada | 7 mL |
Tabela 1: Composição da solução.
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Discussion
O protocolo começa com o crescimento do oHSV em células Vero de baixa passagem. A confluência da monocamada celular Vero deve ser ~80% no momento da inoculação do vírus, pois as células supercultivadas podem desenvolver estruturas fibrosas apertadas que podem reduzir a entrada de OHSV nas células Vero20. Uma vez observadas 90-100% CPE, a cultura sobrenante é removida, as células são colhidas, resuspended em VB/supernante (ver passo 1.4.6), congelado por snap e armazenado a -80 °C para purificação posterior. Blaho e colegas empregaram um método ligeiramente diferente de colheita e armazenamento de células Vero infectadas. Por exemplo, os frascos contendo as células e os meios de cultura (complementados com 1% de albumina de soro bovino e PBS com potássio) são inicialmente armazenados a -80 °C por pelo menos 15 minutos, seguidos por um aquecimento lento dos frascos à temperatura ambiente. As células são então colhidas, misturadas com leite estéril, e armazenadas a -80 °C até a purificação20. Neste caso, o leite estéril age como estabilizador, e foi demonstrado que o título de um estoque de vírus é dramaticamente maior quando é armazenado em leite estéril/médio do que apenas em20. No entanto, em outro estudo, uma comparação direta entre diferentes estabilizadores (incluindo leite estéril) usado para o armazenamento de vários herpesvírus a -80 °C não mostrou nenhum impacto significativo nos tituladores finais do vírus21. Aqui, a pelota celular foi reinstituída em VB constituída com soro fisiológico tris-tampão (pH 6.8) e 10% glicerol como estabilizador de armazenamento, o que geralmente dá um alto titulador de vírus (como descrito na etapa 3.10) para estudos experimentais.
É fundamental remover todos os componentes relacionados à célula e à mídia da pelota re-suspensa para obter um estoque de vírus de alta qualidade. A remoção de partículas não virais é crucial para evitar possíveis reações imunológicas durante experimentos in vivo. Vários métodos de purificação do vírus foram descritos, incluindo centrifugação22,diferentes métodos gradientes23,filtração24e cromatografia de afinidade25. Embora este protocolo seja baseado na centrifugação de alta velocidade usando um método de gradiente de sacarose, uma variedade de outros métodos gradientes têm sido usados por outros, como iodixanol11,26, Percoll27e Ficoll-Nycodenz23. Esses métodos gradientes separam o vírus por densidade e requerem isolamento da banda do gradiente, em vez da almofada de sacarose onde o vírus é pelleted. O método de sálização-gradiente oferece uma abordagem suave para separar partículas virais porque minimiza o risco de interromper proteínas de envelope viral enquanto retém a infectividade viral. Apesar dessas vantagens, a alta osmolaridade da solução concentrada de sacarose pode desidratar as partículas virais; portanto, o método de gradiente iodixanol foi desenvolvido para superar essa desvantagem. No entanto, o método de gradiente iodixanol requer ultracentrífuga e coleção da banda virion. Outros fatores que precisam ser considerados durante a purificação do OHSV são a velocidade e o tempo de centrifugação e a escolha do tampão de vírus usado para armazenamento a longo prazo. Este protocolo tem a limitação de que a pureza do oHSV não seja confirmada; no entanto, um alto número de partículas de vírus funcionais foram encontradas em um dado estoque purificado de oHSV por titulação em células Vero (ver seção 3).
oHSV forma placas em células Vero(Figura 4). As placas virais podem ser identificadas pela coloração de Giemsa, que é um método fácil e conveniente. Giemsa mancha as células Vero, deixando as placas virais transparentes ou vazias que podem ser facilmente visualizadas (a olho nu) e contadas usando um microscópio dissecando. Enquanto sobrepor a mídia com agarose ou metilcelulose é comumente usado durante a formação de placas (na etapa 3.7) para evitar a propagação do vírus e infecções secundárias e caudas de placa28, o uso de IgG humano para neutralizar oHSV na cultura supernaca é mais fácil e conveniente. Para oHSVs expressando lacZ,as placas podem ser visualizadas por manchas X-gal(Figura 4),enquanto a microscopia fluorescente é usada para proteína fluorescente (ou seja, proteína fluorescente verde) expressando oHSVs18. Ensaios adicionais para detectar células infectadas pelo OHSV incluem anticorpos imuno-histoquímicos ou -fluorescência com anticorpos específicos do OHSV29 ou escaneamento baseado em laser de anticorpos oHSV-específicos de fluorophore quase infravermelhos30.
Existem medidas críticas que devem ser seguidas para alcançar um bom estoque de vírus, como a manutenção da esterilidade para evitar a contaminação microbiana (bactérias, leveduras ou mofo) e células Vero saudáveis. Como o envelope da OHSV é extremamente termosensível20,o estoque oHSV deve ser manuseado em um crioprotetor como 10% de glicerol. No geral, este protocolo pode ser facilmente empregado e praticado em um ambiente de laboratório, mas pode não ser útil para a produção de vírus em larga escala.
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Disclosures
SDR é um co-inventor de patentes relacionadas a vírus herpes simplex oncolíticos, de propriedade e gerenciado pela Universidade de Georgetown e pelo Hospital Geral de Massachusetts, que receberam royalties da Amgen e ActiVec Inc. e está no Conselho Consultivo Científico da EG 427. Os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório Saha foi apoiada em parte por fundos do DOD (W81XWH-20-1-0702) e da Fundação Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey foram parcialmente apoiados pelo NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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