Summary
בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה של צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש פרה-קוליני.
Abstract
וירוסים אונקוליטיים (OVs), כגון וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV), הם אסטרטגיית טיפול הגדלה במהירות בתחום האימונותרפיה של סרטן. OVs, כולל oHSV, לשכפל באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים (חוסך תאים בריאים / נורמליים) תוך גרימת חסינות נגד גידולים. בשל תכונות ייחודיות אלה, אסטרטגיות טיפול מבוססות oHSV נמצאות בשימוש הולך וגובר לטיפול בסרטן, פרה-קלינית וקלינית, כולל talimogene laherparevec (T-Vec) שאושר על ידי ה-FDA. צמיחה, טיהור, טיטרציה הן שלוש טכניקות מעבדה חיוניות עבור כל OVs, כולל oHSVs, לפני שהם יכולים להיות מנוצלים למחקרים ניסיוניים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה שלב אחר שלב להגברת oHSV בתאי Vero. כמו oHSVs להכפיל, הם מייצרים אפקט ציטופתי (CPE) בתאי Vero. פעם 90-100% מהתאים הנגועים מראים CPE, הם נקצרים בעדינות, מטופלים עם בנזיונז ומגנזיום כלורי (MgCl2), מסוננים, ונתון לטיהור בשיטת ההדרגתית סוכרוז. לאחר הטיהור, מספר oHSV זיהומיות (המיועד כיחידות יוצרות פלאק או PFUs) נקבע על ידי "פלאק assay" בתאי Vero. הפרוטוקול המתואר בזאת יכול לשמש להכנת מלאי oHSV גבוה טיטר למחקרים במבחנה בתרבית התא בניסויים בבעלי חיים vivo.
Introduction
וירוסים אונקוליטיים (OVs) הם צורה מתפתחת וייחודית של אימונותרפיה של סרטן. OVs לשכפל באופן סלקטיבי תאים סרטניים lyse (חוסך תאים נורמליים / בריאים)1 תוך גרימת חסינות אנטי גידול2. וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV) הוא אחד הווירוסים שנחקרו בהרחבה ביותר בקרב כל OVs. זה הרחוק ביותר יחד במרפאה, עם Talimogene laherparepvec (T-VEC) להיות OV הראשון והיחיד לקבל אישור ה-FDA בארה"ב לטיפול במלנומה מתקדמת3. בנוסף ל- T-VEC, oHSVs מהונדסיםגנטיתרבים אחרים נבדקים באופן פרה-קליני וקליני בסוגי סרטן שונים 3,4,5,6,7,8. הביוטכנולוגיה הנוכחית המתקדמת של דנ"א רקומביננטי הגדילה עוד יותר את ההיתכנות של קידוד oHSVs חדש עבור transgene(s)טיפולית 3,5. מערכת יעילה של התפשטות oHSV, טיהור, וקביעת טיטר הוא קריטי לפני כל (שפותח לאחרונה) oHSV ניתן לבדוק במבחנה ובמחקרים vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה צעד אחר צעד של צמיחת oHSV (בתאי Vero), טיהור (בשיטת ההדרגתית של סוכרוז) ו titration (על ידי בדיקת לוח oHSV בתאי Vero) (איור 1). זה יכול להיות מאומץ בקלות בכל Biosafety רמה 2 (BSL2) הגדרת מעבדה כדי להשיג מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.
ורו, קו תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, הוא קו התאים הנפוץ ביותר להפצת oHSV9,10,11,12,13 כמו תאי Vero יש מסלול איתות אנטי ויראלי פגום14. קווי תאים אחרים עם גירוי מומת של גנים אינטרפרון (STING) איתות יכול לשמש גם לצמיחה oHSV12,13. פרוטוקול זה מנצל תאי Vero לצמיחה oHSV ו פלאק assay. לאחר התפשטות, תאים נגועים oHSV נקצרים, lysed, ונתון לטיהור, שבו תאים lysed מטופלים תחילה עם גרעין בנזונזה כדי להשפיל את ה-DNA של התא המארח, למנוע הצטברות חומצה גרעינית חלבון, ולהפחית את הצמיגות של ליסט התא. כמו הפעלה נכונה של בנזונאס לעתים קרובות דורש Mg2+, 1-2 mM MgCl2 משמש בפרוטוקול זה15. פסולת התא המארח מן lysate התא שטופלו בנזונז הוא בוטל עוד יותר על ידי סינון סדרתי לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה סוכרוז שיפוע. כרית פתרון סוכרוז צמיג 25% מסייעת להבטיח קצב איטי יותר של נדידת וירוסים דרך שכבת סוכרוז, משאיר רכיבים הקשורים לתא המארח ב supernatant, ובכך לשפר את הטיהור והגבלת אובדן וירוסים גלולה16. oHSV מטוהרים לאחר מכן titrated על תאים Vero, לוחות ויראליים הם דמיינו על ידי Giemsa מכתים17 או X-gal כתמים (עבור LacZ קידוד oHSVs)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) צמיחת oHSV
הערה: יש להבטיח את אישור הוועדה המוסדית לתמיכה ביולוגית לפני העבודה עם oHSV. מחקר זה נערך במסגרת פרוטוקול IBC מס' 18007 שאושר. שמור על אמצעי זהירות BSL2: להלבין את כל pipets, טיפים, צינורות, וחומרים אחרים שבאים במגע עם הנגיף. ריסוס כפפות עם 70% אלכוהול איזופרופיל לפני הידיים לעזוב את מכסה המנוע תרבות התא BSL2. תמיד ביסודיות לשטוף ידיים עם מי סבון לאחר עבודה עם וירוס.
- ביום -1, זרעים מעבר נמוך תאי Vero ב 20 T-150 ס"מ2 בקבוקונים בצפיפות של 7-8 × 106 תאים / בקבוקון במדיום תא Vero רגיל.
הערה: מדיום Vero מוכן על ידי השלמת מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% חום מומת סרום עגל עוברי (IFCS). - ביום 0 (תאים הם 80-90% confluent), להוסיף inoculum oHSV על תאי Vero.
- הכנת אינוקולום וירוס
- השתמש בריבוי של זיהום (MOI) של 0.01 (MOI יכול לנוע בין 0.01 ל 0.1 בהתאם לקיבולת השכפול של וירוס) עבור הגברה וירוס. השתמש בנוסחה (1) כדי לחשב את כמות הווירוס (mL) עבור 20 בקבוקונים.
כמות הווירוס (mL) עבור 20 בקבוקונים = כמות הווירוס הדרושה (pfu)/titer של מלאי וירוסים (pfu/mL)(1) - השתמש במים מלוחים עם אגירת פוספט (DPBS) של גלוקוז גבוה (DPBS) בתוספת 1% IFCS להכנת אינוקולום הנגיף (7 מ"ל לכל בקבוקון T-150 ס"מ2, כלומר, ~ 140 מ"ל עבור 20 בקבוקונים). הוסף את הכמות הנדרשת של oHSV ל 140 מ"ל של פתרון DPBS/1% גלוקוז גבוה IFCS, מערבולת במשך 1 דקות, ולשמור על התערובת מוכנה לתוספת לתאי Vero.
- השתמש בריבוי של זיהום (MOI) של 0.01 (MOI יכול לנוע בין 0.01 ל 0.1 בהתאם לקיבולת השכפול של וירוס) עבור הגברה וירוס. השתמש בנוסחה (1) כדי לחשב את כמות הווירוס (mL) עבור 20 בקבוקונים.
- לשטוף את T-150 ס"מ2 בקבוקונים 2x עם DPBS גלוקוז גבוהה בתוספת 1% IFCS (10 מ"ל / לשטוף). לשאוף DPBS/1% IFCS ולהוסיף 7 מ"ל של וירוס inoculum / T-150 ס"מ2 בקבוק.
- בעדינות לנענע את הבקבוקים במשך 5 דקות באמצעות נדנדה בקבוק לחלוקה נכונה של inoculum מעל monolayer Vero, ולאחר מכן לדגר את הבקבוקים ב 37 °C (60 °F) עבור 1.5-2 שעות. ודא מדף האינקובטור הוא ברמה.
- הסר את inoculum ולהוסיף DMEM בתוספת 1% IFCS (25 מ"ל / בקבוק). דגירה את הבקבוקים במשך 2-4 ימים.
- הכנת אינוקולום וירוס
- בדוק את הבקבוקים מדי יום עבור 90-100% CPE (ראה איור 2).
- לקצור את תאי Vero נגועים oHSV.
- לאסוף את התרבות supernatant (~ 20 מ"ל) מכל בקבוקון (להשאיר ~ 5 מ"ל בכל בקבוק) ב 50 צינורות צנטריפוגה חרוט מ"ל או מיכל מדיה.
- השתמש מגרד תאים כדי לגרד את התאים מתחתית הבקבוקים בעדינות.
הערה: התאים צריכים לרדת במהירות את הבקבוקים. - הוסף ~ 15 מ"ל של supernatant התרבות (שנאסף בשלב 1.4.1) לכל בקבוקון (אשר מביא את הנפח של ~ 20 מ"ל בכל בקבוקון, כלומר, 400 מ"ל עבור 20 בקבוקונים) בעדינות לשטוף את החלק התחתון של הבקבוקים כמה פעמים באמצעות צינור סרולוגי סטרילי 10 mL.
הערה: אין לצנרת במרץ. המטרה היא לשמור על כל התאים שלמים. - לאסוף את התאים (+ בינוני) לתוך 50 צינורות צנטריפוגה חרוט מ"ל על קרח (להשתמש 8 צינורות להחזיק 400 מ"ל של תאים שנקטפו מ 20 בקבוקים).
- לסובב את התאים ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס לשאוף את supernatant.
- הוסף 1.25 מ"ל (50%) של מאגר וירוסים (VB) ו- 1.25 מ"ל (50%) של תרבות supernatant (שנאסף בשלב 1.4.1) לכל צינור צנטריפוגה להשעות מחדש כל גלולה ביסודיות. להעביר את התאים המושעים מחדש משמונה צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל לצינור אחד צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל.
הערה: עיין בהכנת פתרון VB בטבלה 1. סינון-עיקור פתרון VB באמצעות מסנן עיקור מדיה. השתמש 0.5 מ"ל של VB + 0.5 מ"ל של supernatant לכל T-150 ס"מ2 בקבוק להשעיה מחדש, כלומר, עבור 20 בקבוקונים (20 מ"ל), להשתמש 10 מ"ל של VB ו 10 מ"ל של תרבות supernatant. - להקפיא את התאים המושעים מחדש באמצעות קרח יבש/100% אתנול ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
2) טיהור oHSV
- הצמד להקפיא (בקרח יבש ו 100% אתנול)/ להפשיר (באמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס) התאים ואחריו אמבט מים sonication במשך 1 דקות במשך סך של 3 מחזורים כדי להבטיח תמוגה נכונה של התאים לשחרר וירוס supernatant.
הערה: בצע sonication במשך דקה אחת באמצעות 40 kHz, 120 V כוח. אם sonicator מתכוונן אינו זמין, להשתמש sonicator אמבט מים קולי. קח aliquot 50 μL עבור טיטרציה בסעיף 3, אשר יסייע לזהות אילו מהשלבים הבאים(ים) אחראי על אובדן וירוסים פוטנציאליים במהלך הליך הטיהור. - לטפל lysate התא עם נוקליאז בנזונס (175 יחידות / מ"ל) + 2 mM MgCl2 (1 M מלאי = 2 μL / מ"ל), מערבולת, דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F). מניחים את הצינור על קרח ולבצע את השלבים הבאים ב 4 מעלות צלזיוס.
- גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה.
- סובב את lysate התא ב 300 גרם במשך 10 דקות.
- לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט חדש 50 מ"ל (להשעות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של VB, לייעד אותו כמו גלולה-1, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 2.3.5; ראה איור 1).
- סובב את supernatant (הושג בשלב 2.3.2) שוב ב 500 גרם במשך 10 דקות.
- לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט חדש 50 מ"ל (להשעות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של VB, לייעד אותו כמו גלולה-2, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 2.3.5; ראה איור 1).
- שלב את גלולה-1 מושעה מחדש (מ 2.3.2) ו pellet-2 (מ 2.3.4) לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.7 מ"ל, מערבולת / sonicate (אמבט מים) 2x, ולהסתובב ב 400 גרם במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant ולשלב אותו עם supernatant שהושג בשלב 2.3.4; ראו איור 1).
הערה: בצע sonication במשך דקה אחת באמצעות 40 kHz, 120 V כוח כדי למנוע צבירה ויראלית לפני הליך הסינון בשלב 2.4. קח aliquot 50 μL של supernatant בשילוב עבור titration בסעיף 3.
- סנן את supernatant בשילוב (~ 21 מ"ל, כלומר, 20 מ"ל מ 1.4.6, 0.5 מ"ל מ 2.3.2, ו 0.5 מ"ל מ 2.3.4) באמצעות שיטת סינון 3 שלבים הבאה.
- לצייר 21 מ"ל של supernatant באמצעות 10 מ"ל מזרק (5-7 מ"ל בכל פעם למעבר קל דרך המסנן) ולהעביר אותו דרך סטרילי 5 מיקרומטר פוליווינילידן difluoride (PVDF) מסנן קרום להציב על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוטית (שכותרתו TUBE 1).
- הוסף 1 מ"ל של VB לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל התרוקן ב 2.4.1 (כדי לאסוף את כמות העקבות הנותרת של וירוס supernatant), מערבולת, ולעבור דרך אותו מסנן PVDF 5 מיקרומטר להציב על TUBE 1 (להביא את הסכום הכולל ל 22 מ"ל של סינון). המשך לשלב 2.4.2.
- לצייר 22 מ"ל של הסינון מ TUBE 1 (כמו ב 2.4.1) ולהעביר אותו דרך סטרילי 0.8 מיקרומטר מעורב תאית אסתר (MCE) מסנן קרום ממוקם על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוט (שכותרתו TUBE 2).
- הוסף 1 מ"ל של VB ל TUBE 1 התרוקן בשלב 2.4.2, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן MCE 0.8 מיקרומטר ממוקם על TUBE 2 (להביא את הסכום הכולל ל 23 מ"ל של סינון). המשך לשלב 2.4.3.
- לצייר 23 מ"ל של סינון מ TUBE 2 (כמו ב 2.4.1) ולהעביר אותו דרך מסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר PVDF ממוקם על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוט (שכותרתו TUBE 3).
- הוסף 1 מ"ל של VB כדי TUBE 2 התרוקן בשלב 2.4.3, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן PVDF 0.45 מיקרומטר ממוקם על TUBE 3 (להביא את הסכום הכולל ל 24 מ"ל של סינון).
הערה: קח aliquot 50 μL של הסינון עבור titration בסעיף 3.
- הוסף 1 מ"ל של VB כדי TUBE 2 התרוקן בשלב 2.4.3, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן PVDF 0.45 מיקרומטר ממוקם על TUBE 3 (להביא את הסכום הכולל ל 24 מ"ל של סינון).
- לצייר 21 מ"ל של supernatant באמצעות 10 מ"ל מזרק (5-7 מ"ל בכל פעם למעבר קל דרך המסנן) ולהעביר אותו דרך סטרילי 5 מיקרומטר פוליווינילידן difluoride (PVDF) מסנן קרום להציב על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוטית (שכותרתו TUBE 1).
- צנטריפוגה במהירות גבוהה בשיטת שיפוע סוכרוז
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ברוטור F13-14x50cy בזווית קבועה. הן הרוטור והן הצנטריפוגה חייבים להיות ב 4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם השלבים הבאים.- הוסיפו 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה כקרח ומסוננת סטרילית של 25% (שהוכנה על ידי המסת 25 גרם של אבקת סוכרוז ב-100 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק) בצינור צנטריפוגה חרוט חדש של 50 מ"ל.
- לאט (3 מ"ל / דקה) להוסיף 24 מ"ל של סינון הנגיף (המתקבל משלב 2.4.3.1) על גבי שכבת סוכרוז. יש להקפיד על שכבות נפרדות של סינון הנגיף ותמיסת סוכרוז.
הערה: עד 30 מ"ל של שכבת הנגיף ניתן להוסיף מעל 10 מ"ל של פתרון סוכרוז. - צנטריפוגה הצינור במשך 90 דקות ב 22,620 גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant ואת שכבת סוכרוז מצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל.
הערה: גלולת הווירוס צריכה להיות לבנבן. קח aliquot 50 μL של supernatant ו 50 μL aliquot של שכבת סוכרוז עבור טיטרציה בסעיף 3.
- להשעות מחדש את גלולה ב 10% גליצרול / PBS פתרון.
- הוסף 1 מ"ל של גליצרול סטרילי 10% (מדולל ב- PBS) לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כדי לכסות את גלולה.
הערה: כמות התערובת המושעית מחדש יכולה להשתנות (כגון 0.8-1.2 מ"ל) בהתאם לגודל גלולה. נפח קטן יותר ייתן ריכוז גבוה יותר של וירוס. - מניחים את צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל על קרח במשך 2-4 שעות. במהלך תקופה זו, sonicate / מערבולת גלולה כל 15 דקות במשך 30 s כדי לעזור לעקור / להשעות מחדש את גלולה.
- לאסוף את גלולה מושעה מחדש (1 מ"ל של 10% גליצרול / PBS + גודל גלולה יביא את הנפח הכולל ~ 1.3 מ"ל) בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל. [אופציונלי: להוסיף עוד 0.3 מ"ל של 10% גליצרול / PBS לאותו צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כדי לאסוף את כמות העקבות הנותרת של גלולה, צינור למעלה ולמטה, ולשלב עם גלולה מושעה מחדש בשלב 2.6.3 להביא את הנפח הכולל ~ 1.6 mL.]
- אם ההשעיה בשלב 2.6.3 היא עכורה או מעוננת (עקב פסולת תאים), צנטריפוגה הצינור ב 500 גרם במשך 10 דקות, להעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 2 מ"ל, ולהמשיך לשלב 2.6.4.
- קח aliquot 50 μL עבור טיטרציה oHSV בסעיף 3. Aliquot שאר הפתרון (250 μL / aliquot) לתוך צינורות microcentrifuge סטרילי עם כובעי בורג (אטום היטב לאחסון לטווח ארוך), הצמד להקפיא, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (מוכן למחקרים ניסיוניים לאחר titer oHSV נקבע).
הערה: יש להלבין או לטפל בכל החומרים שבאים במגע עם הנגיף בקרינה אולטרה סגולה לפני ההסרה מהמכסה המנוע או ההשלכה.
- הוסף 1 מ"ל של גליצרול סטרילי 10% (מדולל ב- PBS) לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כדי לכסות את גלולה.
3. oHSV טיטרציה וקלע פלאק
- זרעים 1.7-1.8 x 105 תאי Vero /well בלוח תרבית תאים של 6 בארות במדיום תאי Vero (DMEM עם 10% IFCS; ראה שלב 1.1).
הערה: ודא כי התאים מופצים הומוגנית ברחבי הבאר; לא מערבולת הצלחת, אשר יכול לגרום הצטברות של תאים באמצע בארות. כדי למנוע מערבולת, לאט לטלטל את הצלחת ביד אנכית, ואז אופקית, ולאחר מכן בעדינות למקם את הצלחת באינקובטור. - למחרת (כאשר התאים מגיעים 70-80% מפגש), לשאוף את המדיום התרבותי, ולהוסיף 1 מ"ל / באר של PBS גלוקוז גבוהה בתוספת 1% IFCS. השאירו את הצלחת במכסה המנוע של תרבות התאים עד להשלמת שלב 3.3.
- לדלל את הנגיף באופן סדרתי בצינורות פוליפרופילן 5 מ"ל באמצעות PBS/1% IFCS (איור 3).
הערה: השתמש aliquot μL 50 שנאספו בשלב 2.6.4 לדילול סדרתי. בצינור 1st (10-3 דילול), להוסיף 2 μL של הנגיף ב 1998 μL של PBS / 1%IFCS, מערבולת. בצינור2 nd (10-5 דילול), לקחת 10 μL מצינור 1st ב 990 μL של PBS / 1% IFCS, מערבולת. בצינור3 rd (10-6 דילול), לקחת 100 μL מן הצינור2 nd ב 900 μL של PBS / 1% IFCS, מערבולת; המשיכו בדילול סדרתי זה של פי 10 עד לדילול של10-9. ראו את הפרטים באיור 3. - לשאוף PBS/1% IFCS, ולהוסיף 0.7 מ"ל / באר של הווירוס בדילול סדרתי (החל מ 10-5 עד 10-9) לתאי Vero.
הערה: אל תתנו לתאים להתייבש. - בעדינות לטלטל את הצלחת על נדנדה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (כדי להבטיח הפצה הומוגנית של אינוקולום הנגיף).
- דגירה את הצלחת במשך 1.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: במהלך תקופת דגירה זו, להכין 1:1000 דילול של אימונוגלובולין אנושי G (IgG) ב DMEM בתוספת 1% IFCS. עבור צלחת 6-well, להכין 12.5 מ"ל, כך 2 מ"ל / באר ניתן להשתמש בשלב 3.7. להתאים את הדילול כדי להסביר וריאציות הרבה IgG האנושי. - הסר את הנגיף inoculum מן הבארות, ולהוסיף 2 מ"ל / באר של 0.1% אנושי IgG (כדי לנטרל את oHSV במדיום התרבות ולמנוע היווצרות של לוחות משניים) ב DMEM בתוספת 1% IFCS. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
הערה: לוחות ברורים נוצרים בדרך כלל ב- 3 ימים. - תיקון וכתמים של צלחות
- הסר את supernatant, ולתקן את התאים מתנול טהור (1 מ"ל / טוב) במשך 5 דקות. מוציאים את המתנול, ומאפשרים ללוחות להתייבש באוויר.
- לדלל כתם Giemsa (1:5) עם מים deionized, ולהוסיף 1 מ"ל של כתם Giemsa מדולל לכל באר. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 - 15 דקות.
- מוציאים את הכתם, שוטפים במי ברז ומאפשרים ללוחות להתייבש באוויר.
- לספור את הלוחות באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
- אופציונלי עבור oHSVs עם ביטוי lacZ:
- הסר את supernatant, ולתקן את התאים עם קר 0.2% glutaraldehyde/2% paraformaldehyde במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את הפתרון המתקן, ולשטוף את התאים 3x עם PBS.
- מוסיפים את פתרון X-gal לתאים (1 מ"ל / טוב), ומדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
הערה: יש להכין את כתם ה-X-gal טרי ביום הכתמים; אחסון לטווח ארוך עלול להוביל לדהיית צבע. ראה הכנת פתרון X-gal בטבלה 1. - מוציאים את כתם ה-X-gal, ושוטפים את הצלחת במי ברז למשך דקה.
- כתם נגדי עם פתרון אדום ניטרלי (1 מ"ל / טוב) במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ראה הכנת פתרון אדום ניטרלי בטבלה 1. - לשטוף את הצלחת עם מי ברז במשך 1 דקות; אפשרו ללוחות להתייבש באוויר.
- ספירת לוחות כחולים באמצעות מיקרוסקופ מנתח(איור 4).
- חישוב המקש המהינוס באמצעות נוסחה (2)
טיטר ב pfu /mL (יחידות יוצרות פלאק) = מספר לוחות /0.7 מ"ל × גורם דילול (2)
הערה: לדוגמה, אם נמצאו 25 לוחות בבאר הדילול 10-9, הטיטר הוא 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL. זהו טיטר oHSV הסופי של aliquots מוכן בשלב 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה קצרה של הפרוטוקול כולו מתוארת באיור 1, המייצג את הצעדים הקריטיים הכרוכים בצמיחה, טיהור וטייטרציה של oHSV. CPE בתאי Vero ניתן לזהות כבר 4 שעות לאחר זיהום HSV19. איור 2 מדגים CPE בתאי Vero בשלוש נקודות זמן שונות בעקבות זיהום oHSV. רמת ה- CPE גדלה עם הזמן. בפרוטוקול זה, 90-100% CPE נצפתה בדרך כלל בתוך 48 שעות של חיסון oHSV moI נמוך (וזה הזמן הטוב ביותר לקצור תאים לטיהור). עם זאת, זה יכול לקחת עד 4 ימים בהתאם MOI oHSV מחוסן בשלב 1.2 ו/או פוטנציאל השכפול של oHSV. מעבר לתקופה זו, תאים עם CPE ניתן lysed, המוביל לשחרורו של הנגיף supernatant. לכן, כדי לקבל טיטר ויראלי גבוה, זה קריטי כדי לקצור תאים מושפעים CPE כאשר הם שלמים. גורם חשוב נוסף התורם טיטר הנגיף הסופי הוא מספר או גודל של צלושי תרבית הרקמה המשמשים להגברת oHSV. איור 3 מתאר את תהליך הדילול הסדרתי (10-3 עד 10-9) של מלאי וירוסים נתון (המתקבל בשלב 2.6.4) הנדרש לקביעת טיטר על-ידי ה- Plaque assay. עבור oHSVs עם ביטוי lacZ, ניתן לדמיין לוחות ויראליים על ידי כתמי X-gal (איור 4). בפרוטוקול זה, 20 T-150 ס"מ2 בקבוקים תרבית רקמה שימשו, אשר 1.3-1.6 מ"ל של מלאי oHSV עם טיטר של 1 × 1010 pfu / mL ניתן לצפות.
איור 1: מצגת סכמטית של צעדים מרכזיים המעורבים בצמיחה oHSV, טיהור, ואת פלאק assay. קיצורים: oHSV = וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי; CPE = אפקט ציטופתי; VB = מאגר וירוסים; HBSS = פתרון המלח המאוזן של האנק; PBS = מלוחים עם אגירת פוספט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השפעה ציטופתית בתאי ורו לאחר זיהום oHSV. תאי Vero היו מחוסנים עם קידוד oHSV עבור mCherry (מוצג בפלואורסצנטיות אדומה) ב MOI של 0.01 ו imagedd (10x הגדלה) ב 36, 48, ו 72 שעות לאחר זיהום לאחר וירוס. CPE מזוהה על ידי עיגול של תאים נגועים oHSV (מסומן על ידי חצים שחורים). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצור: oHSV = וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דילול סדרתי של מניית oHSV עבור מבחני פלאק. ראה גם שלב 3.3 של הפרוטוקול. קיצור: oHSV = וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה מייצגת של לוחות מוכתמים X-gal בזיהום 72 שעות לאחר oHSV. לא מדולל (באר עליונה) ומדולל (1:10; באר תחתונה) oHSV נגוע סופרנטנטים תרבות התא הוסיף לתאי Vero (70-80% confluent), ואחריו פרוטוקול הכתמת X-gal המתואר בסעיף 3.8.5 (למעט כתמי נגד עם אדום ניטרלי). תמונות מייצגות של לוח וירוס X-gal מוכתם (מלוח שמאלי) מוצג באמצע (4x; סרגלי קנה מידה = 1000 מיקרומטר) וימינה (10x; סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר) לוחות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הרכב פתרון | |
| הכנת מאגר וירוסים | כמות |
| 1 מ' נתרן כלורי | 15 מ"ל |
| 1 מ' טריס-הידרוכלוריד | 3 מ"ל |
| מים מטוהרים | 132 מ"ל |
| התאמת pH ל- 6.8 | |
| הכנת פתרון X-gal (~ 6.5 מ"ל לצלחת אחת של 6 בארות) | |
| 250 מ"מ אשלגן פריציאניד | 130 μL |
| 250 מ"מ אשלגן פרוציאניד | 130 μL |
| 1 מ' מגנזיום כלוריד | 13 מיקרו-ל |
| X-gal מומס מראש (20 מ"ג/מ"ל) בדמתיל סולפוקסיד (DMSO) | 162.5 מיקרול |
| PBS | 6064.5 μL |
| הכנת פתרון אדום ניטרלי לצלחת אחת של 6 בארות | |
| פתרון אדום ניטרלי | 100 μL |
| מתנול (רתנול) | 1 מ"ל |
| מים מטוהרים | 7 מ"ל |
טבלה 1: הרכב פתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מתחיל עם הצמיחה של oHSV בתאי Vero מעבר נמוך. המפגש של monolayer תא Vero צריך להיות ~ 80% בזמן חיסון וירוס כמו תאים מגודלים יכולים לפתח מבנים סיביים הדוקים שיכולים להפחית את כניסת oHSV לתאי Vero20. לאחר 90-100% CPE נצפתה, supernatant התרבות מוסרת, תאים נקצרים, respended ב VB / supernatant (ראה שלב 1.4.6), הצמד קפוא, ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר. בלאהו ועמיתיו השתמשו בשיטה שונה במקצת של קציר ואחסון של תאי Vero נגועים. לדוגמה, הבקבוקים המכילים את התאים ואת התקשורת התרבותית (בתוספת 1% אלבומין סרום שור ו PBS עם אשלגן) מאוחסנים בתחילה ב -80 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות, ואחריו חימום איטי של הבקבוקים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן נקטפים התאים, מעורבבים בחלב סטרילי ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עדלטיהור 20. במקרה זה, חלב סטרילי פועל כמייצב, והוכח כי טיטר של מלאי וירוסים גבוה באופן דרמטי כאשר הוא מאוחסן בחלב סטרילי / בינוני מאשר במדיום בלבד20. עם זאת, במחקר אחר, השוואה ישירה בין מייצבים שונים (כולל חלב סטרילי) המשמשים לאחסון של מספר הרפסוירוסים ב -80 מעלות צלזיוס לא הראתה השפעה משמעותית על titers הנגיף הסופי21. כאן, גלולת התא הושעה מחדש VB היווה עם מלוחים חיץ טריס (pH 6.8) ו 10% גליצרול כמייצב אחסון, אשר בדרך כלל נותן טיטר וירוס גבוה (כמתואר בשלב 3.10) למחקרים ניסיוניים.
זה קריטי כדי להסיר את כל הרכיבים הקשורים לתאים ומדיה מן גלולה מושעה מחדש כדי להשיג מלאי וירוס באיכות גבוהה. הסרת חלקיקים שאינם ויראליים היא חיונית כדי למנוע תגובות חיסוניות פוטנציאליות במהלך ניסויים vivo. מספר שיטות של טיהור וירוסים תוארו כולל צנטריפוגה22, שיטות הדרגתיות שונות23,סינון 24, ו כרומטוגרפיה זיקה25. למרות פרוטוקול זה מבוסס על צנטריפוגה במהירות גבוהה באמצעות שיטת שיפוע סוכרוז, מגוון של שיטות הדרגתיות אחרות שימשו אחרים, כגון iodixanol11,26, Percoll27, ו Ficoll-Nycodenz23. שיטות שיפוע אלה מפרידות את הנגיף על ידי צפיפות ודורשות בידוד של הלהקה מן השיפוע, במקום כרית סוכרוז שבו הנגיף הוא pelleted. שיטת שיפוע סוכרוז מציעה גישה עדינה לחלקיקים נגיפיים נפרדים משום שהיא ממזערת את הסיכון לשיבוש חלבוני מעטפה נגיפיים תוך שמירה על זיהומיות ויראלית. למרות יתרונות אלה, האוסמולריות הגבוהה של תמיסת סוכרוז מרוכזת עלולה לייבש את החלקיקים הנגיפיים; לכן, שיטת שיפוע יודיקסנול פותחה כדי להתגבר על חיסרון זה. עם זאת, שיטת השיפוע iodixanol דורש ultracentrifuge ואוסף של הלהקה virion. גורמים אחרים שיש לקחת בחשבון במהלך טיהור oHSV הם מהירות וזמן של צנטריפוגה ובחירה של מאגר הנגיף המשמש לאחסון לטווח ארוך. לפרוטוקול זה יש מגבלה שטוהר oHSV אינו מאושר; עם זאת, מספר גבוה של חלקיקי וירוסים פונקציונליים נמצאו במלאי oHSV מטוהר נתון על ידי טיטרציה על תאי Vero (ראה סעיף 3).
oHSV יוצר לוחות בתאי Vero (איור 4). את הלוחות הנגיפיים ניתן לזהות על ידי כתמי גימסה, שהיא שיטה קלה ונוחה. Giemsa מכתים תאי Vero, משאיר את הלוחות הנגיפיים שקופים או ריקים שניתן לדמיין בקלות (עין בלתי מזוינת) ונספר באמצעות מיקרוסקופ מנתח. בעוד כיסוי התקשורת עם agarose או methylcellulose משמש בדרך כלל במהלך היווצרות פלאק (בשלב 3.7) כדי למנוע את התפשטות הנגיף וזיהומים משניים זנבות פלאק28, השימוש IgG האנושי כדי לנטרל oHSV בתרבות supernatant קל ונוח יותר. עבור oHSVs המבטאים lacZ, ניתן לדמיין לוחות על ידי כתמי X-gal(איור 4),בעוד מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת לחלבון פלואורסצנטי (כלומר, חלבון פלואורסצנטי ירוק)-ביטוי oHSVs18. מבחנים נוספים לגילוי תאים נגועים ב- oHSV כוללים חיסוני-היסטוכימי או פלואורסצנטי עם נוגדנים ספציפיים ל- oHSV29 או סריקה מבוססת לייזר של נוגדנים פלואורופוריים כמעט אינפרא אדום מצומדים oHSV ספציפי30.
ישנם אמצעים קריטיים שיש לעקוב אחריהם כדי להשיג מלאי וירוסים טוב כגון שמירה על סטריליות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי (חיידקים, שמרים או עובש) ותאי Vero בריאים. כמו המעטפה של oHSV הוא מאוד תרמוסטיבי20, מניית oHSV צריך להיות מטופל cryoprotectant כגון 10% גליצרול. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק בקלות מתורגל במסגרת מעבדה, אבל לא יכול להיות שימושי עבור ייצור וירוס בקנה מידה גדול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR הוא ממציא שותף על פטנטים הקשורים וירוסים הרפס סימפלקס oncolytic, בבעלות ומנוהל על ידי אוניברסיטת ג'ורג'טאון ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס, אשר קיבלו תמלוגים אמגן ActiVec Inc. והוא על המועצה המדעית המייעצת של EG 427. למחברים האחרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר במעבדת סאהא נתמך בחלקו על ידי קרנות ממשרד המשפטים (W81XWH-20-1-0702) וקרן דודג' ג'ונס-אבילין. סמואל ד. רבקין ומליסה ר.M האמפרי נתמכו חלקית על ידי NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
