Summary
I detta manuskript beskriver vi en enkel metod för tillväxt, rening och titrering av onkolytiska herpes simplex virus för preklinisk användning.
Abstract
Onkolytiska virus (OVs), såsom onkolytiska herpes simplex virus (oHSV), är en snabbt växande behandlingsstrategi inom området cancer immunterapi. OVs, inklusive oHSV, replikerar selektivt i och dödar cancerceller (skonar friska /normala celler) samtidigt som de inducerar antitumörimmunitet. På grund av dessa unika egenskaper används oHSV-baserade behandlingsstrategier alltmer för behandling av cancer, prekliniskt och kliniskt, inklusive FDA-godkänd talimogene laherparevec (T-Vec). Tillväxt, rening och titrering är tre viktiga laboratorietekniker för alla OVs, inklusive oHSVs, innan de kan användas för experimentella studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg metod för att förstärka oHSV i Vero celler. När oHSVs multipliceras producerar de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. När 90-100% av de infekterade cellerna visar en CPE skördas de försiktigt, behandlas med benzonas och magnesiumklorid (MgCl2),filtreras och utsätts för rening med hjälp av sackarosgradientmetoden. Efter rening bestäms antalet infektiösa oHSV (betecknade som plackbildande enheter eller PFC) av en "plackanalys" i Vero-celler. Protokollet som beskrivs häri kan användas för att förbereda hög titer oHSV-bestånd för in vitro-studier i cellkultur och in vivo-djurförsök.
Introduction
Onkolytiska virus (OVs) är en framväxande och unik form av cancer immunterapi. OVs replikerar selektivt i och lyse tumörceller (skonar normala / friska celler)1 medan inducera anti-tumör immunitet2. Onkolytiskt herpes simplexvirus (oHSV) är ett av de mest studerade virusen bland alla OVs. Det är längst fram på kliniken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) som den första och enda OV som får FDA-godkännande i USA för behandling av avancerat melanom3. Förutom T-VEC testas många andra genetiskt konstruerade oHSVs prekliniskt och kliniskt i olika cancertyper3,4,5,6,7,8. Den nuvarande avancerade rekombinanta DNA-biotekniken har ytterligare ökat genomförbarheten av att konstruera nya oHSVs-kodning för terapeutiska transgener3,5. Ett effektivt system för oHSV-förökning, rening och titerbestämning är avgörande innan någon (nyutvecklad) oHSV kan testas för in vitro- och in vivo-studier. Detta dokument beskriver en enkel steg-för-steg-metod för oHSV-tillväxt (i Vero-celler), rening (med sackarosgradientmetoden) och titrering (med en oHSV-plackanalys i Vero-celler) (figur 1). Det kan enkelt antas i alla Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieinställning för att uppnå ett högkvalitativt viruslager för prekliniska studier.
Vero, en afrikansk grön apa njure cellinje, är den vanligaste cellinjen för oHSV förökning9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antivirala interferon signalering väg14. Andra cellinjer med inaktiverad stimulator av interferongener (STING) signalering kan också användas för oHSV tillväxt12,13. Detta protokoll använder Vero celler för oHSV tillväxt och plack analys. Efter förökning skördas, lysas och utsätts oHSV-infekterade celler för rening, där lysade celler först behandlas med benzonaskärna för att bryta ner värdcellens DNA, förhindra nukleinsyraproteinaggregering och minska celllystikens viskositet. Eftersom korrekt aktivering av benzonas ofta kräver Mg2 +, används 1-2 mM MgCl2 i detta protokoll15. Värdcellsskräp från benzonasbehandlade celllyat elimineras ytterligare genom seriell filtrering före höghastighets sackarosgradientcentrifugation. En trögflytande 25% sackaroslösningskudde hjälper till att säkerställa en långsammare virusmigration genom sackarosskiktet, vilket lämnar värdcellsrelaterade komponenter i supernaten, vilket förbättrar reningen och begränsar virusförlusten i pelleten16. Den renade oHSV titreras sedan på Vero-celler, och virala plack visualiseras av Giemsafärgning 17 eller X-gal färgning (för LacZ kodning oHSVs)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV-tillväxt
OBS: Säkerställ godkännande av institutionella biosäkerhetskommittéer innan du arbetar med oHSV. Denna studie utfördes enligt godkänt IBC-protokoll nr 18007. Underhåll BSL2 försiktighetsåtgärder: bleka alla rör, spetsar, rör och andra material som kommer i kontakt med viruset. Sprayhandskar med 70% isopropylalkohol innan händerna lämnar BSL2 cellkulturhuven. Tvätta alltid händerna noggrant med tvålvatten efter att ha arbetat med ett virus.
- På dag -1, så lågpassage Vero celler i 20 T-150 cm2 flaskor med en densitet av 7-8 × 106 celler /kolv i vanliga Vero cell medium.
OBS: Vero medium framställs genom att komplettera Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum (IFCS). - På dag 0 (cellerna är 80-90% konfluenta), tillsätt oHSV inokulat på Vero-cellerna.
- Beredning av virusinokulat
- Använd en multiplicitet av infektion (MOI) på 0,01 (MOI kan variera från 0,01 till 0,1 beroende på virusets replikeringskapacitet) för virusförstärkning. Använd formel (1) för att beräkna mängden virus (mL) för 20 flaskor.
Mängd virus (ml) för 20 flaskor = mängd virus som behövs (pfu)/titer av viruslager (pfu/ml)(1) - Använd högsockerDulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) kompletterad med 1% IFCS för att förbereda viruset inokulat (7 ml per T-150 cm2 kolv, dvs ~ 140 ml för 20 flaskor). Tillsätt den önskade mängden oHSV till 140 ml högsocker DPBS/1% IFCS-lösning, virvel i 1 min och håll blandningen redo för tillsats av Vero-celler.
- Använd en multiplicitet av infektion (MOI) på 0,01 (MOI kan variera från 0,01 till 0,1 beroende på virusets replikeringskapacitet) för virusförstärkning. Använd formel (1) för att beräkna mängden virus (mL) för 20 flaskor.
- Tvätta T-150 cm2 flaskor 2x med högsocker-DPBS kompletterat med 1% IFCS (10 ml/tvätt). Aspirera DPBS/1% IFCS och tillsätt 7 ml virusinokulat/T-150 cm2 kolv.
- Gunga försiktigt kolvarna i 5 minuter med en flaskvippare för korrekt fördelning av inokulat över Monoskiktet Vero och inkubera sedan kolvarna vid 37 °C i 1,5–2 timmar. Se till att inkubatorhyllan är jämn.
- Ta bort inokulatet och tillsätt DMEM kompletterat med 1% IFCS (25 ml/kolv). Inkubera flaskorna i 2-4 dagar.
- Beredning av virusinokulat
- Kontrollera kolvarna dagligen för 90-100% CPE (se figur 2).
- Skörda de oHSV-infekterade Vero-cellerna.
- Samla kulturspjutet (~20 ml) från varje kolv (lämna ~5 ml i varje kolv) i 50 ml koniska centrifuger eller mediebehållare.
- Använd en cellskrapa för att försiktigt skrapa cellerna från kolvernas botten.
OBS: Cellerna ska snabbt lossna från kolvarna. - Tillsätt ~15 ml av kultursprickan (insamlad i steg 1.4.1) till varje kolv (vilket ger volymen ~20 ml i varje kolv, dvs. 400 ml för 20 flaskor) och tvätta försiktigt kolvarnas botten några gånger med en 10 ml steril serologisk rörledning.
OBS: Rör inte kraftigt. Sikta på att hålla alla celler intakta. - Samla cellerna (+ medium) i 50 ml koniska centrifuger på is (använd 8 rör för att hålla 400 ml skördade celler från 20 flaskor).
- Snurra cellerna vid 300 g i 10 min vid 4 °C och aspirera supernaten.
- Tillsätt 1,25 ml (50 %) virusbuffert (VB) och 1,25 ml (50 %) av odlingsspjutant (insamlat i steg 1.4.1) till varje centrifugeringsrör och suspendera varje pellet noggrant. Överför de återhängda cellerna från åtta 50 ml centrifugeringsrör till ett koniskt centrifugeringsrör på 50 ml.
OBS: Se beredningen av VB-lösning i tabell 1. Filtersterilisera VB-lösningen med hjälp av ett mediesteriliseringsfilter. Använd 0,5 ml VB + 0,5 ml supernatant per T-150 cm2 kolv för återupphängning, dvs. för 20 flaskor (20 ml), använd 10 ml VB och 10 ml kultur supernatant. - Snäpp-frys de återhängda cellerna med torr is/100% etanol och förvara vid -80 °C.
2) oHSV-rening
- Snap-freeze (i torr is och 100% etanol)/tina (i ett varmt vattenbad på 37 °C) cellerna följt av vattenbads ultraljudsbehandling i 1 min i totalt 3 cykler för att säkerställa korrekt lys av cellerna för att frigöra virus i supernatanten.
OBS: Utför ultraljudsbehandling i 1 min med 40 kHz, 120 V effekt. Om en tunable ljudsignal är tillgänglig, använd en ultraljud vatten bad ultraljudsbehandling. Ta en 50 μL alikvot för titrering i avsnitt 3, vilket hjälper till att identifiera vilket av följande steg som är ansvarigt för potentiell virusförlust under reningsprocessen. - Behandla celllysatet med Benzonase Nuclease (175 enheter/ml) + 2 mM MgCl2 (1 M lager = 2 μL/ml), virvel och inkubera i 30 min vid 37 °C. Placera röret på is och utför följande steg vid 4 °C.
- Pellet cellskräpet genom låg hastighet centrifugation.
- Snurra celllyset vid 300 g i 10 min.
- Samla supernatanten i ett nytt koniskt centrifugerör på 50 ml (suspendera cellpelleten igen i 0,5 ml VB, ange det som pellet-1 och förvara det vid 4 °C för användning i steg 2.3.5, se figur 1).
- Snurra supernaten (erhålls i steg 2.3.2) igen vid 500 g i 10 min.
- Samla supernatanten i ett nytt koniskt centrifugerör på 50 ml (häng upp cellpelleten igen i 0,5 ml VB, ange det som pellet-2 och förvara det vid 4 °C för användning i steg 2.3.5, se figur 1).
- Kombinera den återhängda pelletsen-1 (från 2.3.2) och pellets-2 (från 2.3.4) till ett nytt 1,7 mL centrifugerör, virvel/sonicate (vattenbad) 2x och snurra på 400 g i 10 min. Samla supernaten och kombinera den med supernaten som erhålls i steg 2.3.4; Se figur 1).
OBS: Utför ultraljudsbehandling i 1 min med 40 kHz, 120 V effekt för att förhindra virusaggregering före filtreringsproceduren i steg 2.4. Ta en 50 μL alikvot av den kombinerade supernatanten för titrering i avsnitt 3.
- Filtrera det kombinerade supernatantet (~21 ml, dvs. 20 ml från 1,4,6, 0,5 ml från 2,3,2 och 0,5 ml från 2,3,4) med följande 3-stegs filtreringsmetod.
- Dra 21 ml av supernatanten med en 10 ml spruta (5-7 ml varje gång för enkel passage genom filtret) och passera den genom ett sterilt 5 μm polyvinyliden difluorid (PVDF) membranfilter placerat på ett nytt 50 mL koniskt centrifugeringsrör (märkt som TUBE 1).
- Tillsätt 1 ml VB till ett koniskt centrifugerör på 50 ml tömt i 2.4.1 (för att samla in den återstående spårmängden av virusmetaturant), virvel och passera genom samma 5 μm PVDF-filter som placerats på TUBE 1 (vilket ger totalt 22 ml filtrat). Fortsätt till steg 2.4.2.
- Dra 22 ml av filtratet från TUBE 1 (som i 2.4.1) och passera det genom ett sterilt 0,8 μm membranfilter för blandad cellulosa (MCE) placerad på ett nytt 50 ml koniskt centrifugeringsrör (märkt som RÖR 2).
- Tillsätt 1 ml VB till RÖR 1 tömt i steg 2.4.2, virvel, och passera det genom samma 0,8 μm MCE-filter som placeras på RÖR 2 (vilket ger totalt 23 ml filtrat). Fortsätt till steg 2.4.3.
- Dra 23 ml filtrat från TUBE 2 (som i 2.4.1) och passera det genom ett sterilt 0,45 μm PVDF-filter placerat på ett nytt koniskt centrifugerör på 50 ml (märkt som TUBE 3).
- Tillsätt 1 ml VB till RÖR 2 tömt i steg 2.4.3, virvel, och passera det genom samma 0,45 μm PVDF-filter som placerats på TUBE 3 (vilket ger totalt 24 ml filtrat).
OBS: Ta en 50 μL alikvot av filtratet för titrering i avsnitt 3.
- Tillsätt 1 ml VB till RÖR 2 tömt i steg 2.4.3, virvel, och passera det genom samma 0,45 μm PVDF-filter som placerats på TUBE 3 (vilket ger totalt 24 ml filtrat).
- Dra 21 ml av supernatanten med en 10 ml spruta (5-7 ml varje gång för enkel passage genom filtret) och passera den genom ett sterilt 5 μm polyvinyliden difluorid (PVDF) membranfilter placerat på ett nytt 50 mL koniskt centrifugeringsrör (märkt som TUBE 1).
- Höghastighetscentrifugation med sackarosgradientmetoden
OBS: En fast vinkel F13-14x50cy rotor användes i detta protokoll. Både rotorn och centrifugen måste vara vid 4 °C innan följande steg fortsätter.- Tillsätt 10 ml av en iskall, sterilfiltrerat 25% sackaroslösning (beredd genom att lösa upp 25 g sackarospulver i 100 ml Hanks balanserade saltlösning) i ett nytt koniskt centrifugrör på 50 ml.
- Tillsätt långsamt (3 ml/min) 24 ml av virusfilratet (erhållet från steg 2.4.3.1) ovanpå sackarosskiktet. Var noga med att upprätthålla separata lager av virusfiltratet och sackaroslösningen.
OBS: Upp till 30 ml av virusskiktet kan tillsättas över 10 ml sackaroslösningen. - Centrifugera röret i 90 minuter vid 22 620 g vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och sackarosskiktet från det koniska centrifugeringsröret på 50 ml.
OBS: Viruspelleten ska vara vitaktig. Ta en 50 μL alikvot av supernatanten och en 50 μL alikvot av sackarosskiktet för titrering i avsnitt 3.
- Suspendera pelleten igen i 10% glycerol/PBS-lösning.
- Tillsätt 1 ml steril 10% glycerol (utspädd i PBS) till 50 ml koniskt centrifugeringsrör för att täcka pelleten.
OBS: Mängden återhängd blandning kan variera (t.ex. 0,8-1,2 ml) beroende på pelletsstorleken. En mindre volym skulle ge en högre koncentration av virus. - Placera det koniska centrifugröret på 50 ml på is i 2-4 timmar. Under denna period, sonicate/virvel pelleten var 15: e minut i 30 s för att hjälpa till att lossa / suspendera pelleten igen.
- Samla upp den återhängda pelleten (1 ml 10% glycerol/PBS + pelletsstorleken ger den totala volymen till ~ 1,3 ml) i ett 2 mL mikrocentrifugrör. [Valfritt: Tillsätt ytterligare 0,3 ml 10 % glycerol/PBS till samma koniska centrifugrör på 50 ml för att samla in den återstående spårmängden av pelleten, rör upp och ner, och kombinera med den återhängda pelleten i steg 2.6.3 för att få den totala volymen till ~ 1,6 mL.]
- Om fjädringen i steg 2.6.3 är grumlig eller grumlig (på grund av cellskräp), centrifugera röret vid 500 g i 10 min, överför supernatanten till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör och fortsätt till steg 2.6.4.
- Ta en 50 μL alikvot för oHSV-titrering i avsnitt 3. Alikvot resten av lösningen (250 μL/alikvot) i sterila mikrocentrifugrör med skruvlock (förseglade väl för långtidslagring), snäppfrys och förvara vid -80 °C tills de används (redo för experimentella studier när oHSV-titern har bestämts).
OBS: Alla material som kommer i kontakt med viruset måste blekas eller behandlas med ultraviolett strålning innan de avlägsnas från huven eller bortskaffandet.
- Tillsätt 1 ml steril 10% glycerol (utspädd i PBS) till 50 ml koniskt centrifugeringsrör för att täcka pelleten.
3. oHSV titrering och plackanalys
- Frö 1,7-1,8 x 105 Vero-celler/brunn i en 6-brunns cellkulturplatta i Vero-cellmedium (DMEM med 10% IFCS; se steg 1.1).
OBS: Se till att cellerna är homogent fördelade över hela brunnen; snurra inte plattan, vilket kan orsaka ackumulering av celler i mitten av brunnarna. För att förhindra virvlande, vagga långsamt plattan för hand vertikalt, sedan horisontellt och placera sedan försiktigt plattan i inkubatorn. - Nästa dag (när cellerna når 70-80% sammanflöde), aspirerar odlingsmediet och lägger till 1 ml/ brunn av högsocker PBS kompletterat med 1% IFCS. Lämna plattan i cellkulturhuven tills steg 3.3 är klart.
- Späd viruset i 5 ml polypropylenrör med PBS/1% IFCS(figur 3).
OBS: Använd de 50 μL alikvot som samlats in i steg 2.6.4 för seriell utspädning. I 1st röret (10-3 utspädning), tillsätt 2 μL av viruset 1998 μL PBS/1%IFCS, virvel. I2:a röret (10-5 utspädning) ska du ta 10 μL från 1:a röret i 990 μL PBS/1% IFCS, virvel. I 3rd-röret (10-6 utspädning), ta 100 μL från 2:aröret i 900 μL PBS/1% IFCS, virvel; fortsätta denna 10-faldiga seriella utspädning tills10-9 utspädning. Se detaljerna i figur 3. - Aspirera PBS/1% IFCS och tillsätt 0,7 ml/brunn av det seriellt utspädda viruset (från 10-5 till 10-9) till Vero-celler.
OBS: Låt inte cellerna torka. - Gunga försiktigt plattan på en vipp i 5 min vid rumstemperatur (för att säkerställa homogen fördelning av viruset inokulat).
- Inkubera plattan i 1,5 timmar vid 37 °C.
OBS: Under denna inkubationsperiod, bered 1:1000 utspädning av humant immunglobulin G (IgG) i DMEM kompletterat med 1% IFCS. För en 6-brunnsplatta, förbered 12,5 ml så att 2 ml/brunn kan användas i steg 3,7. Justera utspädningen för att ta hänsyn till partivariationer i den mänskliga IgG. - Ta bort viruset inokulat från brunnarna och tillsätt 2 ml/brunn på 0,1% human IgG (för att neutralisera oHSV i odlingsmediet och förhindra bildandet av sekundära plack) i DMEM kompletterat med 1% IFCS. Inkubera plattan vid 37 °C i 3-4 dagar.
OBS: Tydliga plack bildas vanligtvis om 3 dagar. - Fixerings- och färgplattor
- Ta bort supernatanten och fixera cellerna i ren metanol (1 ml/brunn) i 5 min. Ta bort metanolen och låt plattorna lufttorka.
- Späd Giemsa fläck (1:5) med avjoniserat vatten och tillsätt 1 ml av den utspädda Giemsa fläcken per brunn. Inkubera plattan i rumstemperatur i 10-15 min.
- Ta bort fläcken, skölj med kranvatten och låt plattorna lufttorka.
- Räkna plack med hjälp av ett dissekerande mikroskop.
- Valfritt för oHSV:er med lacZ-uttryck:
- Ta bort supernatanten och fixera cellerna med kall 0,2% glutaraldehyd/2% paraformaldehyd i 5-10 min vid rumstemperatur.
- Ta bort fixeringslösningen och tvätta cellerna 3x med PBS.
- Tillsätt X-gal-lösning till cellerna (1 ml/brunn) och inkubera plattan vid 37 °C i 2 timmar.
OBS: X-gal-fläcken ska beredas ny på färgningsdagen; långtidslagring kan leda till blekning av färg. Se beredningen av X-gal-lösningen i tabell 1. - Ta bort X-gal-fläcken och tvätta plattan med kranvatten i 1 minut.
- Motfläck med Neutral Röd lösning (1 ml/brunn) i 2 min vid rumstemperatur.
OBS: Se beredning av neutral röd lösning i tabell 1. - Tvätta plattan med kranvatten i 1 min; låt plattorna lufttorka.
- Räkna blå plack med hjälp av ett dissekerande mikroskop (figur 4).
- Beräkna titern med hjälp av formel (2)
Titer i pfu/ml (plackbildande enheter) = Antal plack/0,7 ml × utspädningsfaktor (2)
OBS: Om till exempel 25 plack finns i utspädningsbrunnen 10-9 är titern 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Detta är den sista oHSV titern av alikvoter som förberetts i steg 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kort översikt över hela protokollet visas i figur 1, som representerar de kritiska stegen som är involverade i tillväxt, rening och titrering av oHSV. CPE i Vero celler kan detekteras så tidigt som 4 h post-HSV infektion19. Figur 2 visar CPE i Vero celler vid tre olika tidpunkter efter oHSV infektion. CPE-nivån höjs med tiden. I detta protokoll observeras vanligtvis 90-100% CPE inom 48 h av lågMOI oHSV-inokulering (vilket är den bästa tiden att skörda celler för rening). Det kan dock ta upp till 4 dagar beroende på oHSV MOI inokuleras i steg 1.2 och/eller oHSV: s replikeringspotential. Utöver denna period kan celler med CPE lysas, vilket leder till att viruset frigörs i supernatanten. Således, för att få en hög viral titer, är det viktigt att skörda CPE-drabbade celler när de är intakta. En annan viktig faktor som bidrar till den slutliga virustitern är antalet eller storleken på de vävnadskulturflaskor som används för oHSV-förstärkning. Figur 3 visar processen med seriell utspädning (10-3till 10 -9)av ett givet viruslager (erhållet i steg 2.6.4) som krävs för titerbestämning genom plackanalysen. För oHSV med lacZ-uttryck kan virala plack visualiseras genom X-gal färgning (Figur 4). I detta protokoll användes 20 T-150 cm2 vävnadskulturkolvar, för vilka 1,3-1,6 ml oHSV-lager med en titer på 1 ×10 10 pfu/ml kan förväntas.
Figur 1: En schematisk presentation av viktiga steg som är involverade i oHSV-tillväxt, rening och plackanalys. Förkortningar: oHSV = onkolytiskt herpes simplexvirus; CPE = cytopatisk effekt; VB = Virusbuffert; HBSS = Hanks balanserade saltlösning; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Cytopatisk effekt i Vero-celler efter oHSV- infektion. Vero celler var inokuleras med oHSV kodning för mCherry (visas i röd fluorescens) vid en MOI av 0,01 och avbildas (10x förstoring) vid 36, 48 och 72 h post-virus infektion. CPE identifieras genom avrundning av de oHSV-infekterade cellerna (indikeras av svarta pilar). Skalstänger = 200 μm. Förkortning: oHSV = onkolytiskt herpes simplexvirus. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:En seriell utspädning av ett oHSV-lager för plackanalyser. Se även steg 3.3 i protokollet. Förkortning: oHSV = onkolytiskt herpes simplexvirus. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: En representativ bild av X-gal-färgade plack vid 72 h post-oHSV infektion. Outspädda (övre brunn) och utspädda (1:10; nedre brunn) oHSV-infekterade cellkultur supernatants läggs till Vero celler (70-80% konfluent), följt av X-gal färgning protokoll beskrivs i avsnitt 3.8.5 (exklusive motfärgning med neutral röd). Representativa bilder av en X-gal-färgad virusplack (från vänster panel) presenteras i mitten (4x; skalstänger = 1000 μm) och höger (10x; skalstänger = 200 μm) paneler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Lösningskomposition | |
| Förberedelse av virusbuffert | kvantitet |
| 1 M natriumklorid | 15 ml |
| 1 M Trishydroklorid | 3 ml |
| Renat vatten | 132 ml |
| justera pH till 6,8 | |
| Beredning av X-gal lösning (~ 6,5 ml för en 6-brunnsplatta) | |
| 250 mM kalium ferricyanid | 130 μL |
| 250 mM kalium ferrocyanid | 130 μL |
| 1 M Magnesiumklorid | 13 μL |
| X-gal förupplöst (20 mg/ml) i dimetylsulfoxid (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Beredning av Neutral Röd lösning för en 6-brunnsplatta | |
| Neutral röd lösning | 100 μL |
| metanol | 1 ml |
| Renat vatten | 7 ml |
Tabell 1: Lösningskomposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet börjar med tillväxten av oHSV i veroceller med låg passage. Vero-cellmonoskiktens beredskap bör vara ~ 80% vid tidpunkten för virusinympning eftersom övervuxna celler kan utveckla snäva fibrösa strukturer som kan minska oHSV-inträde i Vero-celler20. När 90-100% CPE observeras avlägsnas kulturens supernatant, celler skördas, återanvänds i VB/supernatant (se steg 1.4.6), fästfryses och lagras vid -80 °C för senare rening. Blaho och kollegor använde en något annorlunda metod för skörd och lagring av infekterade Vero-celler. Till exempel lagras flaskorna som innehåller cellerna och odlingsmedierna (kompletterade med 1% bovint serumalbumin och PBS med kalium) initialt vid -80 °C i minst 15 min, följt av en långsam uppvärmning av kolvarna vid rumstemperatur. Cellerna skördas sedan, blandas med steril mjölk och lagras vid -80 °C tills rening20. I detta fall fungerar steril mjölk som en stabilisator, och det visades att titern för ett viruslager är dramatiskt högre när den lagras i steril mjölk / medium än i medium ensam20. I en annan studie visade dock inte en direkt jämförelse mellan olika stabilisatorer (inklusive steril mjölk) som används för lagring av flera herpesvirus vid -80 °C någon signifikant inverkan på de slutliga virustitrarna21. Här återhängdes cellpelleten i VB med Tris-buffert saltlösning (pH 6,8) och 10% glycerol som lagringstabilisator, vilket vanligtvis ger en hög virus titer (som beskrivs i steg 3.10) för experimentella studier.
Det är viktigt att ta bort alla cellulära och medierelaterade komponenter från den återhängda pelleten för att få ett högkvalitativt viruslager. Avlägsnandet av icke-virala partiklar är avgörande för att undvika potentiella immunreaktioner under in vivo-experiment. Flera metoder för virusrening har beskrivits inklusive centrifugation22, olikagradientmetoder 23, filtrering24, och affinitetskromatografi25. Även om detta protokoll är baserat på höghastighetscentrifugation med hjälp av en sackarosgradientmetod, har en mängd andra gradientmetoder använts av andra, såsom iodixanol11,26, Percoll27och Ficoll-Nycodenz23. Dessa gradientmetoder separerar viruset med densitet och kräver isolering av bandet från lutningen, istället för sackaroskudden där viruset pelleteras. Metoden med sackarosgradient erbjuder ett skonsamt tillvägagångssätt för att separera viruspartiklar eftersom det minimerar risken för att störa virushöljets proteiner samtidigt som virusinfektionen bibehålls. Trots dessa fördelar kan den höga osmolariteten hos den koncentrerade sackaroslösningen dehydrera viruspartiklarna; Därför utvecklades iodixanol gradient metod för att övervinna denna nackdel. Iodixanol gradient metod kräver dock ultracentrifuge och samling av virion bandet. Andra faktorer som måste beaktas vid oHSV-rening är centrifugeringshastighet och centrifugeringstid och val av virusbuffert som används för långtidslagring. Detta protokoll har begränsningen att renheten hos oHSV inte bekräftas. ett stort antal funktionella viruspartiklar hittades dock i ett givet renat oHSV-lager genom titrering på Vero-celler (se avsnitt 3).
oHSV bildar plack på Veroceller (figur 4). De virala plack kan identifieras av Giemsa färgning, vilket är en enkel och bekväm metod. Giemsa fläckar Vero celler, lämnar virala plack transparenta eller tomma som lätt kan visualiseras (blotta ögat) och räknas med hjälp av ett dissekerande mikroskop. Medan överlägg av media med agarose eller metylcellulosa används ofta under plackbildning (i steg 3.7) för att förhindra spridning av viruset och sekundära infektioner och placksvansar28, är användningen av mänsklig IgG för att neutralisera oHSV i kulturövernaturliga lättare och bekvämare. För oHSV som uttrycker lacZkan plack visualiseras genom X-gal färgning(figur 4), medan fluorescerande mikroskopi används för fluorescerande protein (dvs. grönt fluorescerande protein)-uttrycker oHSVs18. Ytterligare analyser för att upptäcka oHSV-infekterade celler inkluderar immuno-histochemical eller -fluorescens med oHSV-specifika antikroppar29 eller laserbaserad skanning av nära infraröd fluorphore-konjugerade oHSV-specifika antikroppar30.
Det finns kritiska åtgärder som måste följas för att uppnå ett bra viruslager som att upprätthålla sterilitet för att förhindra mikrobiell (bakterier, jäst eller mögel) förorening och friska Vero-celler. Eftersom kuvertet av oHSV är extremt termokänsligt20, bör oHSV-beståndet hanteras i en kryoprotektant som 10% glycerol. Sammantaget kan detta protokoll enkelt användas och övas i laboratoriemiljö, men kanske inte vara användbart för storskalig virusproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SDR är en meduppfinnare av patent relaterade till onkolytiska herpes simplexvirus, ägda och förvaltade av Georgetown University och Massachusetts General Hospital, som har fått royalties från Amgen och ActiVec Inc. och är i Scientific Advisory Board på EG 427. De andra författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningen i Saha-labbet stöddes delvis av medel från DOD (W81XWH-20-1-0702) och Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin och Melissa R.M. Humphrey stöddes delvis av NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
