Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Evaluering af in vivo antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler

Published: June 28, 2021 doi: 10.3791/62683

Summary

En standardprotokol er beskrevet til undersøgelse af antitumoraktiviteten og associeret toksicitet af IL-1α i en syngeneisk musemodel af HNSCC.

Abstract

Cytokinterapi er en lovende immunterapeutisk strategi, der kan producere robuste antitumorimmunresponser hos kræftpatienter. Det proinflammatoriske cytokin interleukin-1 alfa (IL-1α) er blevet evalueret som et anticancermiddel i flere prækliniske og kliniske undersøgelser. Imidlertid har dosisbegrænsende toksiciteter, herunder influenzalignende symptomer og hypotension, dæmpet entusiasmen for denne terapeutiske strategi. Polyanhydrid nanopartikel (NP)-baseret levering af IL-1α ville udgøre en effektiv tilgang i denne sammenhæng, da dette kan muliggøre en langsom og kontrolleret frigivelse af IL-1α systemisk, samtidig med at toksiske bivirkninger reduceres. Her beskrives en analyse af antitumoraktiviteten af IL-1a-belastede polyanhydrid NP'er i en pladecellekarcinom (HNSCC) syngeneisk musemodel for hoved og hals. Murin orofaryngeal epitelceller, der stabilt udtrykte HPV16 E6 / E7 sammen med hRAS og luciferase (mEERL) celler blev injiceret subkutant i højre flanke af C57BL / 6J mus. Når tumorer nåede 3-4 mm i enhver retning, blev en 1,5% IL-1a - belastet 20:80 1,8-bis (p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan: 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) hexan (CPTEG: CPH) nanopartikel (IL-1α-NP) formulering administreret til mus intraperitonealt. Tumorstørrelse og kropsvægt blev kontinuerligt målt, indtil tumorstørrelse eller vægttab nåede eutanasikriterier. Blodprøver blev taget for at evaluere antitumorimmunresponser ved submandibulær venipunktur, og inflammatoriske cytokiner blev målt gennem cytokinmultiplexassays. Tumor- og inguinale lymfeknuder blev resekteret og homogeniseret i en enkeltcellesuspension for at analysere forskellige immunceller gennem flerfarvet flowcytometri. Disse standardmetoder vil gøre det muligt for efterforskere at studere antitumorimmunresponset og den potentielle mekanisme for immunstimulerende NP'er og andre immunterapimidler til kræftbehandling.

Introduction

Et af de nye områder inden for kræftimmunterapi er brugen af inflammatoriske cytokiner til at aktivere patienternes immunsystem mod deres tumorceller. Flere proinflammatoriske cytokiner (dvs. interferon-alfa (IFNα), interleukin-2 (IL-2) og interleukin-1 (IL-1)) kan montere betydelig antitumorimmunitet, hvilket har skabt interesse for at udforske antitumoregenskaberne såvel som sikkerheden ved cytokinbaserede lægemidler. Interleukin-1 alfa (IL-1α) er især et proinflammatorisk cytokin kendt som master cytokin af inflammation1. Siden opdagelsen af dette cytokin i slutningen af 1970'erne er det blevet undersøgt som et anticancermiddel såvel som et hæmatopoietisk lægemiddel til behandling af de negative virkninger af kemoterapi2. I slutningen af 1980'erne blev der udført flere prækliniske og kliniske undersøgelser for at bestemme anticancervirkningerne af IL-1α 3,4,5,6. Disse undersøgelser fandt lovende antitumoraktivitet af rekombinant IL-1α (rIL-1α) mod melanom, renalcellekarcinom og ovariekarcinom. Imidlertid blev toksiciteter, herunder feber, kvalme, opkastning, influenzalignende symptomer og mest alvorligt dosisbegrænsende hypotension almindeligt observeret. Desværre dæmpede disse dosisrelaterede toksiciteter entusiasmen for yderligere klinisk anvendelse af rIL-1α.

For at forsøge at løse det kritiske problem med IL-1a-medierede toksiciteter vil polyanhydrid nanopartikel (NP) formuleringer, der muliggør kontrolleret frigivelse af IL-1α ved overfladeerosionskinetik blive undersøgt. Disse NP-formuleringer er beregnet til at høste fordelene ved antitumoregenskaberne ved IL-1α og samtidig reducere dosisbegrænsende bivirkninger7. Polyanhydrider er FDA-godkendte polymerer, der nedbrydes gennem overfladeerosion, hvilket resulterer i næsten nul-ordens frigivelse af indkapslede midler 8,9,10,11,12. Amfifile polyanhydridcopolymerer indeholdende 1,8-bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctan (CPTEG) og 1,6-bis-(p-carboxyphenoxy) hexan (CPH) er rapporteret at være fremragende leveringssystemer til forskellige nyttelast i onkologi- og immunologibaseret forskning 8,12. I den følgende protokol vil 20:80 CPTEG:CPH NP'er fyldt med 1,5 vægt% rIL-1α (IL-1α-NP'er) blive brugt til at studere antitumoraktiviteten og toksiciteten af dette cytokin i en musemodel af HNSCC.

Det overordnede mål med følgende procedurer er at vurdere antitumoraktiviteten af IL-1a-NP'er på HNSCC'er. De beskrevne procedurer, herunder vurdering af tumorvækst og overlevelse, kan anvendes på ethvert immunmodulerende middel af interesse. Disse procedurer bør udføres i en syngeneisk musemodel med et intakt immunsystem13 for at maksimere klinisk relevans. IL-1a-NP toksicitet vil også blive vurderet ved at måle ændringer i cirkulerende niveauer af proinflammatoriske cytokiner og dyrevægt. Der er mange metoder til bestemmelse af in vivo lægemiddeltoksicitet; De mest anvendte metoder omfatter imidlertid måling af serumenzymer for organtoksicitet og histologiske ændringer i disse organer. For at udføre histologiske analyser skal dyret dog ofres, hvilket vil påvirke eksperimentets overlevelseskurver. Derfor vil denne protokol indeholde en protokol for indsamling af blod fra levende mus til måling af cytokiner i serumprøver. Det indsamlede serum kan anvendes til måling af eventuelle ønskede serumanalysander for organtoksicitet. Flerfarvet flowcytometri vil blive brugt til at forstå ændringerne i immuncellepopulationen i tumormikromiljøet og immuncellemigration til lymfeknuden. Andre metoder kan anvendes til at identificere immunceller, herunder immunhistokemi og/eller immunfluorescens af konserverede afsnit14. Disse teknikker kan dog være tidskrævende og kedelige at udføre på et stort antal dyr. Samlet set vil følgende metoder gøre det muligt for efterforskere at studere antitumorimmunresponset og potentielle mekanismer for immunstimulerende midler til kræftbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in vivo-procedurer , der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af Institutional Animal Care and UseCommittee (IACUC) ved University of Iowa.

1. Forberedelse og vedligeholdelse af HNSCC-cellelinje

BEMÆRK: I dette studie vil murine orofaryngeal epitelcellelinjen stabilt transformeret med HPV E6 og E7 sammen med hRas og luciferase (mEERL) blive anvendt. Denne cellelinje blev udviklet fra C57BL/6J musestamme og var en gave fra Dr. Paola D. Vermeer (Department of Surgery, University of South Dakota Sanford School of Medicine, South Dakota, USA).

  1. Optø et frosset hætteglas med mEERL-celler i et forvarmet (37 °C) vandbad og overfør derefter til et 15 ml konisk rør indeholdende varme kulturmedier (Dulbeccos modificerede ørnemedium [DMEM] suppleret med 40,5% 1:1 DMEM/skinker F12, 10% føtalt bovint serum [FBS], 0,1% gentamicin, 0,005% hydrocortison, 0,05% transferrin, 0,05% insulin, 0,0014% tri-iodothyronin og 0,005% epidermal vækstfaktor).
  2. Det koniske rør centrifugeres ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for at fjerne mediet. Derefter resuspenderes cellepillen i 3-5 ml friske medier og overføres til en T-25-cellekulturkolbe. For optimal genopretning fra frossen opbevaring, pladeceller ved høj densitet.
    BEMÆRK: T-25-kolber blev brugt på grund af deres mindre størrelse, hvilket resulterer i hurtigere restitutionstider fra frossen opbevaring, når celler er tæt på sammenlignet med T-75-kolber.
  3. Lad cellerne vokse i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2, udvide til større kolber (dvs. T-75 eller T-150) og passere hver 3. dag. Når der er nok celler til den ønskede implantation i alle mus, fjernes kolberne, mediet kasseres, og cellerne skylles forsigtigt med fosfatbufret saltvand (PBS). Derefter tilsættes 4 ml (hvis der anvendes T150-kolber) 0,25% trypsin-EDTA, og der inkuberes ved 37 °C i 2 minutter. Skaler mængden af trypsin op eller ned afhængigt af den skål/kolbestørrelse, der bruges.
    BEMÆRK: Typen af cellelinje og graden af sammenløb kan påvirke trypsiniseringstider. Lange trypsiniseringsperioder kan beskadige celler, hvilket resulterer i lav levedygtighed. Brug den mindste tid, der er nødvendig for trypsinisering.
  4. Under mikroskopet bevæger de løsrevne celler på trypsinisering frit. Hvis nogle celler stadig er fastgjort, skal du trykke meget forsigtigt på kolben for at mobilisere de resterende klæbende celler. Tilsæt friske medier (skaler mængden af medier efter ønske) for at stoppe trypsinreaktionen og opsaml cellesuspensionen i 50 ml koniske rør. Der centrifugeres ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for at fjerne mediet.
  5. Ophvirvl cellerne igen i friske medier, og tæl cellerne. Der centrifugeres endnu en gang (som beskrevet ovenfor), og der tilsættes derefter kold PBS til cellerne for at opnå en slutkoncentration på 10 × 106 celler/ml. Opbevar cellesuspensionen/-suspensionerne på is før injektion til mus.

2. Tumorimplantation, lægemiddelbehandling og måling

BEMÆRK: Forsøgsdyrene blev holdt i Animal Care Facility ved University of Iowa og fulgte passende aseptiske procedurer for at håndtere dem.

  1. Bedøv C57Bl / 6J mus med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) blanding. Barber forsigtigt flankeområdet eller det ønskede injektionssted med en elektrisk barbermaskine.
    BEMÆRK: Husk at dokumentere brugen af kontrollerede stoffer som krævet af institutionelle (eller andre) regler og forskrifter.
  2. Flankeområdet desinficeres med en ethanolpude og injiceres langsomt 100 μL (indeholdende 1 x 106 celler) af cellesuspensionen subkutant ved hjælp af en 25-28 G sprøjte. Bedøv musene før injektion for at forhindre pludselige bevægelser og celletab. Før hver injektion blandes cellesuspensionen forsigtigt for at forhindre, at cellerne sætter sig i bunden af hætteglasset eller konisk rør.
  3. Når du har taget cellesuspensionen op i sprøjten, skal du fjerne alle bobler og dødrum fra toppen. Injicer cellesuspensionen langsomt og stabilt. Brug ikke den samme nål på flere mus. Foretag altid ekstra cellesuspensioner for at tage højde for utilsigtet tab.
  4. Placer dyret i deres respektive bure og overvåg dem, indtil de kommer sig efter anæstesi. Under anæstesi er dyr i fare for hypotermi; Sørg derfor for supplerende varme eller placer musene tæt på hinanden for at holde varmen (hvis de er anbragt i samme bur).
  5. Når tumorer når 3 mm i en hvilken som helst retning, randomisere musene (efter tumorstørrelse og / eller vægt) i behandlingsgrupperne og derefter starte lægemiddelbehandlingen. Injicer musene intraperitonealt (i.p.) med NP'er15 indeholdende 3,75 μg rIL-1α/mus på dag 4 og 9. Mål og registrer tumorvolumen ((længde x bredde 2) /2) og musevægten dagligt eller hver anden dag, indtil tumorstørrelsen eller musene når eutanasikriterierne.
    BEMÆRK: Selv med en erfaren forsker er det svært at implantere den samme størrelse tumor i alle mus. Randomiser dyr i eksperimentelle grupper baseret på tumorstørrelse og musevægt.

3. Blodindsamling og serumseparation

BEMÆRK: Blodindsamling fra en submandibulær vene er en nem og effektiv teknik, der tillader blodindsamling fra bevidste dyr eller dyr under anæstesi. Til denne undersøgelse blev blod indsamlet fra dyrene, da de var under anæstesi.

  1. Bedøv musene med en injektion af ketamin/xylazinblanding som nævnt ovenfor.
  2. Tag fat i den løse hud over skulderen ved hjælp af den ikke-dominerende hånd og punktere den submandibulære vene med en 18 G nål eller lancet, lidt bag underkæben (en hvid plet på dette område).
  3. Punktering venen for at sikre blodgennemstrømning med det samme. Saml 200-300 μL blod (afhængigt af musevægt) i et 1,5 ml polypropylenmikrocentrifugerør eller serumseparatorrør. Efter blodindsamling påføres forsigtigt tryk på punkteringsstedet, indtil blødningen er stoppet. Returner musene til deres respektive bure og observer, indtil de kommer sig efter anæstesi.
    BEMÆRK: Saml ikke mere end 1% af musens kropsvægt i en samling eller over en periode på 24 timer.
  4. Lad det opsamlede blod størkne ved stuetemperatur i 20-30 min. Placer rørene på is, indtil de er klar til at blive centrifugeret.
  5. Det størknede blod centrifugeres ved 1540 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  6. Saml det øverste lag (serum) uden at forstyrre de røde blodlegemer. Opbevares ved -80 °C indtil brug.

4. Multiplexing af opsamlet serum

  1. Optø serum- eller plasmaprøverne, mens de opbevares på is.
  2. Prøverne centrifugeres ved 1540 x g i 5 minutter ved 4 °C for at sedimentere cellerester og opsamles forsigtigt fra toppen.
  3. Tag multiplexsættet frem ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Der er flere kommercielt tilgængelige multiplexsæt, der er designet til specifikke cytokiner, kemokiner eller vækstfaktorer. Det er også muligt at tilpasse sættet baseret på proteinet af interesse.
  4. Udfør analysen i henhold til producentens protokol for at detektere cytokiner.
    BEMÆRK: De fleste multiplexsæt bruger magnetiske perler til at binde det fangede antistof. Så det er vigtigt at bruge en automatiseret eller håndholdt magnetisk skive under vask. Ellers vil de magnetiske perler vaske af pladen, og man vil ikke have nok begivenheder til at tage læsningen.

5. Indsamling af tumor og inguinal lymfeknude og fremstilling af enkeltcellesuspension

  1. Bedøv musene med ketamin / xylazin mix. For at sikre fuldstændig sedation skal du bruge pedalrefleks (fast tåklemme). Hvis musene ikke reagerer, skal du aflive musene ved cervikal dislokation.
  2. Læg hver mus på ryggen og spray 70% ethanol på huden i abdominalområdet. Brug tang og saks til at skære tumoren ud fra venstre side af musene og lymfeknuden fra højre side. Hvis tumoren er stor, skæres i små stykker og tager 500-600 mg af vævet. For lymfeknuden skal du samle hele organet.
    BEMÆRK: Der er to lymfeknuder på begge sider af lyskeregionen. Afhængigt af de eksperimentelle mål kan lymfeknuden og tumoren isoleres fra samme side. Men hvis tumoren bliver meget stor, vil det ikke være let at samle lymfeknuden fra samme side.
  3. Anbring vævene på de respektive dissociatorrør, der indeholder 3-5 ml RPMI-medier. Homogeniser vævet ved hjælp af en automatiseret dissociator.
    BEMÆRK: Andre automatiserede eller håndholdte homogenisatorer kan bruges.
  4. Efter homogenisering overføres cellesuspensionen gennem et 70 μm filter til et 50 ml konisk rør. Der centrifugeres ved 277 x g i 5 minutter ved 25 °C for at fjerne mediet. Vask og resuspender cellerne i 1-2 ml kold PBS.

6. FACS-farvning af enkeltcellesuspension

  1. Brug 0,4% trypanblå farvning til at tælle de levedygtige celler i et hæmocytometer. Beregn det volumen, der kræves for at få 2-3 millioner celler og overfør dem til det respektive FACS-rør.
  2. Brug levedygtighedsfarvestof til at gate på levende celler; Ellers kan der forekomme uspecifik binding af antistoffet med døde celler, der kan give et falsk-positivt resultat.
    BEMÆRK: Zombiefarvestof blev brugt til farvning af levende og døde celler i dette eksperiment. Flere fikserbare og ikke-fikserbare farvestoffer (f.eks. propidiuciodid) er kommercielt tilgængelige.
  3. De tællede celler centrifugeres (277 x g i 5 minutter ved 25 °C). Supernatanten dekanteres, og cellerne resuspenderes til 300 μl PBS. Tilsæt 0,5-1 μL zombiefarvestof/rør. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter i mørke.
  4. Der centrifugeres (277 x g i 5 minutter ved 25 °C), og cellerne vaskes med 1-2 ml FACS-buffer og resuspenderes til 200 μL FACS-buffer.
  5. Der tilsættes Fc-receptorblokker (2 μL pr. 200 μL eller i henhold til producentens protokol) og inkuberes cellerne i 10 minutter.
  6. Der centrifugeres (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) og cellerne vaskes med 1-2 ml FACS-buffer. Tilsæt antistofcocktailen og inkuber i 30 minutter ved 4 °C i mørke.
  7. Efter inkubationen centrifugeres (277 x g i 5 minutter ved 25 °C) og cellerne vaskes med 1-2 ml FACS-buffer. Tilsæt 300-400 μL 2% paraformaldehydopløsning og genopslæm til fiksering. Opbevar cellerne på dette trin i et par dage ved 4 °C eller analysér straks ved flerfarvet flowcytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette studie blev antitumoraktiviteten af polyanhydrid IL-1α i en syngeneisk musemodel af HNSCC undersøgt. Rekombinant IL-1α (rIL-1α) bremsede signifikant mEERL tumorvækst (figur 1A), selvom vægttab blev observeret hos de behandlede mus, som blev genoprettet efter seponering af behandlingen (figur 1B). IL-1a-NP'er inducerede ikke en signifikant antitumoreffekt sammenlignet med saltvand eller blank-NP'er (figur 1A) og blev ledsaget af et vist vægttab, skønt ikke så fremtrædende som rIL-1α (figur 1B). Mus behandlet med rIL-1α overlevede signifikant længere end de andre behandlingsgrupper (figur 1C). Derudover var cirkulerende niveauer af IL-1α, IL-1β og IFN-γ højere hos rIL-1α-behandlede mus sammenlignet med de andre behandlingsgrupper (figur 2A-C). Disse resultater tyder på, at forbedringer i IL-1a-NP med hensyn til antitumor effekt er berettiget.

Figure 1
Figur 1: Effekt af rIL-1α på tumorvækst, overlevelse og kropsvægt. C57BL/6J-hanmus (n = 10-11 mus/behandlingsgruppe) med mEERL HNSCC-tumorer blev behandlet i.p. på dag 1 og dag 5 med rIL-1α (3,75 μg rIL-1α), IL-1α-NP (0,25 mg NP'er indeholdende 3,75 μg rIL-1α), Blank-NP (0,25 mg NP'er) og 100 μL saltopløsning (CON). Vist er ændringer i gennemsnitlig tumorvolumen (A), normaliserede kropsvægte (B) og overlevelseskurver (C). Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. *p < 0,05 vs. andre behandlingsgrupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Effekt af rIL-1α på cirkulerende cytokiner. Blodprøver blev indsamlet fra en delmængde af mus (n = 4 mus / behandlingsgruppe) efter den anden lægemiddeladministration og analyseret for cirkulerende cytokinniveauer ved multiplexanalyse. Vist er cirkulerende niveauer af IL-1α (A), IL-1β (B) og IFN-γ (C). Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol vil gøre det muligt for enhver efterforsker at studere antitumoraktiviteten og nogle af de underliggende mekanismer for immunmodulerende lægemidler i et in vivo tumormusemodelsystem. Her blev der anvendt en syngeneisk subkutan tumormodel, som har flere fordele i forhold til ortopiske modeller, herunder dens teknisk ligefremme protokol, let overvågning af tumorvækst, mindre dyresygelighed og højere producerbarhed. Subkutane tumormodeller kan også modificeres til en bilateral tumormodel ved at injicere tumorceller på både venstre og højre flanke. I denne bilaterale tumormodel kan strålebehandling eller lægemidler administreres til en tumor intratumoralt, og abskopale reaktioner kan overvåges. Ortopiske HNSCC-musemodeller, mens de er mere klinisk relevante, er teknisk udfordrende at generere, vanskelige at overvåge tumorvækst, og tumorbyrden i mundhulen resulterer ofte i for tidlig eutanasi på grund af musenes manglende evne til at spise og drikke.

Forberedelsen af celler er et vigtigt skridt til dannelse af symmetriske og lignende størrelse tumorer hos alle mus. Dårlig forberedelse af celler resulterer i nedsat cellelevedygtighed og påvirker i høj grad tumorgenerering hos mus. Tumorcellerne anbefales at være ved et tidligt passagenummer og inden for 80% -90% sammenløb. Højere passageantal og sammenløb påvirker cellelevedygtigheden og dermed tumorgenerering. Celler bør også injiceres så hurtigt efter tilberedning som muligt, da levedygtigheden reduceres, hvis de opbevares i PBS ud over 20-30 minutter. Hvis et stort antal mus skal implanteres med tumorer, anbefales det at fremstille en stamopløsning af celler, der opbevares i medier, og forberede injicerbare cellesuspensioner i PBS til en mindre gruppe dyr.

Der er flere kritiske trin i protokollen, der skal vedligeholdes omhyggeligt efter forberedelse af tumorceller til injektion. Injektion af tumorceller til det subdermale rum kan producere forskellige tumorvækstmønstre og størrelser sammenlignet med det subkutane rum. Derfor bør der lægges omhyggelig vægt på nåleplacering for konsekvent tumordannelse. Valg af nål er også vigtigt. Hvis nålen er mindre end kræftcellen, kan mindre nåle stresse cellerne, hvilket resulterer i mindre levedygtighed. Hvis nålen er meget stor, kan det skade dyret og resultere i cellelækage fra det injicerede sted. Selv for erfarne forskere med den korrekte nålestørrelse kan der være cellelækage på det injicerede sted, hvilket resulterer i en lille eller ingen tumor. Det er vigtigt, at forskere bruger den korrekte teknik til tumorinjektion og optimal nålestørrelse for at reducere tumorcelletab og øge nøjagtigheden og præcisionen under tumorcelleimplantation. Tumormålinger skal udføres omhyggeligt ved hjælp af Vernier-kalibre (manuelle eller elektroniske). Den bedste praksis er at være i overensstemmelse med retningen af tumorlængde og breddemåling for at reducere variabilitet. Tumormåling af den samme forsker gennem hele undersøgelsen kan reducere variabiliteten.

Som forventet tabte mus, der fik rIL-1α, sig under behandlingen, hvilket understøtter tidligere fund15,16. Selvom vægttab er en enkel og ligetil måde at vurdere toksicitet på, er der andre toksikologiske endepunkter, der kan udnyttes. Vurdering af blodlegemer (hvide blodlegemer, røde blodlegemer og blodpladetal) og leverenzymniveauer (aspartattransaminase, alaninaminotransferase og alkalisk fosfatase) giver værdifuld information om lægemiddeltoksicitet. Derudover kan en delmængde af mus ofres, og histopatologisk analyse af organer (lever, nyrer, bugspytkirtel, lunge osv.) Systemisk inflammation bruges ofte som indikator for toksicitet. Her blev en række cirkulerende proinflammatoriske cytokiner analyseret i musene efter lægemiddelbehandling med submandibulær venepunktur med en 18 G nål. Submandibulær venipunktur på mus kræver en færdighed, der kommer fra mange gentagelser af proceduren. Hvis punkteringen er for dyb, kan det forårsage blødning fra øret og indre vævsskade. Mens nålen ikke trænges langt nok ind, kan der opsamles en utilstrækkelig mængde blod. Alternativer til nåle er brugen af engangsblødningslancetter. Der er forskellige slags blødende lancetter, der er kommercielt tilgængelige, der adskiller sig i deres længde. Forskere bør bruge en passende lancetstørrelse for at sikre optimal blodindsamling og human behandling af dyr. For denne procedure vises resultater for tre cytokiner (figur 2A-C). Det er sandsynligt, at en stigning i cirkulerende proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-1α, IL-1β og IFN-γ observeret hos rIL-1α-behandlede mus, kan være forbundet med akut vægttab (figur 1B) observeret i denne behandlingsgruppe.

Endelig beskrives en protokol til isolering og fremstilling af enkeltcellesuspensioner af musetumor og lymfeknuder. Denne metode er nyttig for dem, der søger at opdage ændringer i immuncelleaktivering og rekruttering på grund af lægemiddelbehandling. Under dissektion af tumorer bør fedtvæv, hud, hår og andet affald elimineres så meget som muligt. Normalt bør tumorvolumenet være større end 30 mm3 for at have nok celler til flowcytometri. Men hvis tumoren er meget stor, kan det være svært at forberede enkeltcellesuspensioner. Store tumorer skal skæres i små stykker, inden de placeres i dissociatorrøret. Processen skal udføres hurtigt for at få optimale levedygtige celler. Derudover gør store tumorer det vanskeligt at finde den inguinale lymfeknude på tumorsiden. I dette tilfælde kan den inguinale lymfeknude indsamles fra det modsatte sted. Når enkeltcellesuspensioner er opnået, kan de farves med forskellige antistoffer og analyseres ved flerfarvet flowcytometri.

Samlet set giver disse protokoller en effektiv måde at studere antitumoraktiviteten af immunmodulerende lægemidler og de tilhørende ændringer i de cirkulerende cytokiner og immuncellepopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Merit Review Award #I01BX004829 fra USA Department of Veterans Affairs, Biomedical Laboratory Research and Development Service og støttet af Mezhir Award Program gennem Holden Comprehensive Cancer Center ved University of Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex 200 Systems Bio-Rad The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay Bio-Rad M60009RDPD
C57BL/6J Mice Jakson Labs 664 4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Thermo Fisher Scientific 11320033
EGF Millipore Sigma SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma 12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution IBI Scientific IB02030
gentleMACS Dissociator Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer Thermo Fisher Scientific EPX-55555-000
Hydrocortisone Millipore Sigma H6909-10ML
Insulin Millipore Sigma I0516-5ML
Ketamine/xylazine Injectable anesthesia
MEERL cell line Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper Millipore Sigma Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Cardinal COV5110.PMP
Transferrin Human Millipore Sigma T8158-100MG
Tri-iodothyronin Millipore Sigma T5516-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
  2. de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
  3. Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
  4. Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
  5. Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
  6. Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
  7. Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  8. Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
  9. Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
  10. Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
  11. Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
  12. Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
  13. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  14. Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
  15. Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
  16. Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).

Tags

Kræftforskning udgave 172 Interleukin-1 nanopartikler HNSCC syngeneisk musemodel cytokiner multiplex enkeltcellepræparation flowcytometri
Evaluering af <em>in vivo</em> antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hasibuzzaman, M. M., Ross, K. A.,More

Hasibuzzaman, M. M., Ross, K. A., Salem, A. K., Narasimhan, B., Simons, A. L. Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1α Nanoparticles. J. Vis. Exp. (172), e62683, doi:10.3791/62683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter