Summary
פרוטוקול סטנדרטי מתואר כדי לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית ואת הרעילות הנלווית של IL-1α במודל עכבר סינגני של HNSCC.
Abstract
טיפול בציטוקינים הוא אסטרטגיה אימונותרפית מבטיחה שיכולה לייצר תגובות חיסוניות חזקות נגד גידולים בחולי סרטן. הציטוקין הפרו-דלקתי אינטרלוקין-1 אלפא (IL-1α) הוערך כחומר אנטי-סרטני במספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים. עם זאת, רעילות המגבילה מינון, כולל תסמינים דמויי שפעת ולחץ דם נמוך, הפחיתו את ההתלהבות מאסטרטגיה טיפולית זו. העברה מבוססת ננו-חלקיקי פוליאנהידריד (NP) של IL-1α תייצג גישה יעילה בהקשר זה, שכן הדבר עשוי לאפשר שחרור איטי ומבוקר של IL-1α באופן מערכתי תוך הפחתת תופעות לוואי רעילות. כאן מתואר ניתוח הפעילות האנטי-סרטנית של NPs פוליאנהידרידים טעונים IL-1α במודל עכבר סינגני של קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC). תאי אפיתל מורין אורופרינגיאליים המבטאים ביציבות HPV16 E6/E7 יחד עם תאי hRAS ולוציפראז (mEERL) הוזרקו תת עורית לאגף הימני של עכברי C57BL/6J. ברגע שהגידולים הגיעו ל-3-4 מ"מ לכל כיוון, 1.5% IL-1a - טעון 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) ננו-חלקיקים (IL-1α-NP) נוסחה ניתנה לעכברים תוך צפקית. גודל הגידול ומשקל גופו נמדדו ברציפות עד שגודל הגידול או הירידה במשקל הגיעו לקריטריונים של המתת חסד. דגימות דם נלקחו כדי להעריך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות על ידי ניקור תת-מנדיבולרי, וציטוקינים דלקתיים נמדדו באמצעות בדיקות מולטיפלקס ציטוקינים. בלוטות הגידול והלימפה המפשעתית נכרתו והומוגנו לתרחיף חד-תאי כדי לנתח תאים חיסוניים שונים באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת צבעים. שיטות סטנדרטיות אלה יאפשרו לחוקרים לחקור את התגובה החיסונית נגד הגידול ואת המנגנון הפוטנציאלי של NPs immunostimulatory וחומרים אימונותרפיים אחרים לטיפול בסרטן.
Introduction
אחד התחומים המתפתחים של אימונותרפיה לסרטן הוא השימוש בציטוקינים דלקתיים כדי להפעיל את מערכת החיסון של החולים נגד תאי הגידול שלהם. מספר ציטוקינים מעודדי דלקת (כלומר, אינטרפרון-אלפא (IFNα), אינטרלוקין-2 (IL-2) ואינטרלוקין-1 (IL-1)) יכולים ליצור חסינות אנטי-סרטנית משמעותית, מה שעורר עניין בחקר התכונות האנטי-סרטניות, כמו גם הבטיחות של תרופות מבוססות ציטוקינים. אינטרלוקין-1 אלפא (IL-1α) בפרט, הוא ציטוקין פרו-דלקתי הידוע כציטוקין הראשי של דלקת1. מאז גילוי ציטוקין זה בסוף שנות השבעים, הוא נחקר כסוכן אנטי סרטני, כמו גם תרופה hematopoietic לטיפול בהשפעות השליליות של כימותרפיה2. במהלך סוף שנות השמונים, נערכו מספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי לקבוע את ההשפעות האנטי-סרטניות של IL-1α 3,4,5,6. מחקרים אלה מצאו פעילות אנטי-סרטנית מבטיחה של רקומביננטי IL-1α (rIL-1α) נגד מלנומה, קרצינומה של תאי הכליה וקרצינומה של השחלות. עם זאת, רעילות, כולל חום, בחילות, הקאות, תסמינים דמויי שפעת, ולחץ דם מגביל מינון חמור ביותר נצפו בדרך כלל. למרבה הצער, רעילויות אלה הקשורות למינון הפחיתו את ההתלהבות משימוש קליני נוסף של rIL-1α.
כדי לנסות לטפל בבעיה הקריטית של רעילות בתיווך IL-1α, ייחקרו נוסחאות ננו-חלקיקי פוליאנהידריד (NP) המאפשרות שחרור מבוקר של IL-1α על ידי קינטיקה של שחיקת פני השטח. פורמולציות NP אלה נועדו לקצור את היתרונות של התכונות האנטי-סרטניות של IL-1α תוך הפחתת תופעות לוואי מגבילות מינון7. פוליאנהידרידים הם פולימרים שאושרו על ידי ה-FDA ומתפרקים באמצעות שחיקת פני השטח וכתוצאה מכך שחרור כמעט מסדר אפס של חומרים עטופים 8,9,10,11,12. קופולימרים פוליאנהידרידים אמפיפיליים המכילים 1,8-bis-(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) ו-1,6-bis-(p-carboxyphenoxy) hexane (CPH), דווחו כמערכות אספקה מצוינות עבור מטענים שונים במחקר מבוסס אונקולוגיה ואימונולוגיה 8,12. בפרוטוקול הבא 20:80 CPTEG:CPH NPs טעונים ב-1.5 wt.% rIL-1α (IL-1α-NPs) ישמשו לחקר הפעילות האנטי-סרטנית והרעילות של ציטוקין זה במודל עכברי של HNSCC.
המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא להעריך את הפעילות האנטי-סרטנית של IL-1α-NPs על HNSCCs. ההליכים המתוארים, כולל הערכת צמיחת הגידול והישרדותו, יכולים להיות מיושמים על כל סוכן מווסת חיסון של עניין. הליכים אלה צריכים להתבצע במודל עכבר סינגני עם מערכת חיסון שלמה13 כדי למקסם את הרלוונטיות הקלינית. רעילות IL-1α-NP תוערך גם על ידי מדידת שינויים ברמות במחזור של ציטוקינים מעודדי דלקת ומשקל בעלי חיים. ישנן שיטות רבות לקבוע רעילות סמים in vivo ; עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר כוללות מדידה של אנזימים בסרום עבור רעילות איברים ושינויים היסטולוגיים באיברים אלה. עם זאת, כדי לבצע ניתוחים היסטולוגיים, יש להקריב את החיה, מה שישפיע על עקומות ההישרדות של הניסוי. לכן, פרוטוקול זה יכלול פרוטוקול לאיסוף דם מעכברים חיים למדידת ציטוקינים בדגימות בסרום. הסרום שנאסף יכול לשמש למדידה של כל ניתוח סרום רצוי עבור רעילות איברים. ציטומטריית זרימה צבעונית תשמש להבנת השינויים באוכלוסיית תאי החיסון במיקרו-סביבה של הגידול ובנדידת תאי החיסון לבלוטת הלימפה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי תאים חיסוניים, כולל אימונוהיסטוכימיה ו / או אימונופלואורסנציה של סעיפים14 שהשתמרו. עם זאת, טכניקות אלה יכולות להיות זמן רב ומייגע לבצע על מספר רב של בעלי חיים. בסך הכל, השיטות הבאות יאפשרו לחוקרים לחקור את התגובה החיסונית נגד הגידול ואת המנגנונים הפוטנציאליים של חומרים ממריצים חיסוניים לטיפול בסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי in vivo המשמשים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת איווה.
1. הכנה ותחזוקה של קו תאי HNSCC
הערה: במחקר זה, קו תאי אפיתל אורופרינגיאלי murine השתנה ביציבות עם HPV E6 ו- E7 יחד עם hRas ו luciferase (mEERL) ישמש. קו תאים זה פותח מזן עכבר C57BL/6J והיה מתנה מד"ר פאולה ד. ורמיר (המחלקה לכירורגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרום דקוטה סנפורד, דרום דקוטה, ארה"ב).
- הפשירו בקבוקון קפוא של תאי mEERL באמבט מים שחומם מראש (37°C) ולאחר מכן העבירו לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל מדיה תרבית חמה (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco [DMEM] בתוספת 40.5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% סרום בקר עוברי [FBS], 0.1% גנטמיצין, 0.005% הידרוקורטיזון, 0.05% טרנספרין, 0.05% אינסולין, 0.0014% טרי-יודותירונין ו-0.005% גורם גדילה אפידרמלי).
- צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C כדי להסיר את התקשורת. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא במדיה טרייה של 3-5 מ"ל ולהעביר אותה לצלוחית תרבית תאים T-25. להתאוששות אופטימלית מאחסון קפוא, תאי צלחת בצפיפות גבוהה.
הערה: צלוחיות T-25 שימשו בגלל גודלן הקטן יותר, מה שמביא לזמני התאוששות מהירים יותר מאחסון קפוא כאשר התאים נמצאים בקרבת מקום בהשוואה לצלוחיות T-75. - תן לתאים לגדול באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2, להתרחב צלוחיות גדולות יותר (כלומר, T-75 או T-150), ולעבור כל 3 ימים. כאשר יש מספיק תאים להשתלה הרצויה בכל העכברים, הסירו את הצלוחיות, השליכו את המדיה ושטפו בעדינות את התאים במי מלח חוצצים פוספט (PBS). לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל (אם אתה משתמש בצלוחיות T150) של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגר ב 37 ° C במשך 2 דקות. יש להגדיל או להקטין את כמות הטריפסין בהתאם לגודל המנה/בקבוק שבו משתמשים.
הערה: סוג קו התאים ומידת המפגש עשויים להשפיע על זמני הטריפסיניזציה. תקופות טריפסיניזציה ארוכות עלולות לפגוע בתאים וכתוצאה מכך הכדאיות נמוכה. השתמש בפרק הזמן המינימלי הדרוש לטריפסיניזציה. - מתחת למיקרוסקופ, התאים המנותקים בטריפסיניזציה נעים בחופשיות. אם חלק מהתאים עדיין מחוברים, הקש בעדינות רבה על הבקבוק כדי לגייס את התאים הדבקים הנותרים. הוסף מדיה טרייה (קנה מידה של כמות מדיה לפי הצורך) כדי לעצור את תגובת טריפסין ולאסוף את תרחיף התא בצינורות חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C כדי להסיר את המדיה.
- השהה מחדש את התאים במדיה חדשה וספור את התאים. צנטריפוגה פעם נוספת (כמתואר לעיל), ולאחר מכן להוסיף PBS קר לתאים כדי להפוך ריכוז סופי של 10 × 106 תאים / מ"ל. יש לשמור את מתלי התאים על קרח לפני הזרקתם לעכברים.
2. השתלת גידול, טיפול תרופתי ומדידה
הערה: חיות הניסוי הוחזקו במתקן לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת איווה ועקבו אחר נהלים אספטיים מתאימים לטיפול בהם.
- מרדימים עכברי C57Bl/6J עם תערובת קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). יש לגלח בזהירות את אזור האגף או את אתר ההזרקה הרצוי באמצעות סכין גילוח חשמלי.
הערה: זכור לתעד את השימוש בחומרים מבוקרים כנדרש על-ידי כללים ותקנות מוסדיים (או אחרים). - יש לחטא את אזור האגף עם כרית אתנול ולהזריק באיטיות 100 μL (המכיל 1 x 106 תאים) של תרחיף התא באופן תת עורי באמצעות מזרק 25-28 גרם. מרדימים את העכברים לפני ההזרקה כדי למנוע תנועות פתאומיות ואובדן תאים. לפני כל הזרקה, ערבבו בעדינות את תרחיף התא כדי למנוע מהתאים לשקוע לתחתית הבקבוקון או הצינור החרוטי.
- לאחר נטילת תרחיף התא לתוך המזרק, להסיר את כל הבועות ואת החלל המת מלמעלה. הזריקו את מתלה התא בצורה איטית ויציבה. אין להשתמש באותה מחט על עכברים מרובים. בצע תמיד מתלים נוספים של תאים כדי להסביר אובדן בשוגג.
- הכניסו את בעלי החיים לכלובים שלהם והשגיחו עליהם עד שהם מתאוששים מההרדמה. במהלך ההרדמה, בעלי חיים נמצאים בסיכון להיפותרמיה; לכן, ספקו תוספת חום או הניחו את העכברים קרוב זה לזה כדי להתחמם (אם הם שוכנים באותו כלוב).
- כאשר הגידולים מגיעים ל-3 מ"מ לכל כיוון, יש לחלק את העכברים באופן אקראי (לפי גודל הגידול ו/או משקלו) בקבוצות הטיפול ולאחר מכן להתחיל בטיפול התרופתי. הזריקו לעכברים NPs 15 המכילים 3.75 מיקרוגרםrIL-1α /עכבר בימים 4 ו-9. מדוד ורשום את נפח הגידול ((אורך x רוחב 2) /2) ואת משקל העכבר מדי יום או פעם ביומיים עד שגודל הגידול או העכברים מגיעים לקריטריונים של המתת חסד.
הערה: אפילו עם חוקר מנוסה, קשה להשתיל גידול באותו גודל בכל העכברים. חילוק אקראי של בעלי חיים לקבוצות ניסוי בהתבסס על גודל הגידול ומשקל העכבר.
3. איסוף דם והפרדת נסיוב
הערה: איסוף דם מווריד תת-לסתי היא טכניקה קלה ויעילה המאפשרת איסוף דם מבעלי חיים בהכרה או מבעלי חיים תחת הרדמה. לצורך מחקר זה, נאסף דם מבעלי החיים כאשר הם היו תחת הרדמה.
- מרדימים את העכברים בהזרקת תערובת קטמין/קסילזין כאמור לעיל.
- אחוז את העור הרפוי מעל הכתף באמצעות היד הלא דומיננטית ולנקב את הווריד submandibular עם מחט 18 G או lancet, מעט מאחורי הלסת (נקודה לבנה באזור זה).
- נקב את הווריד כדי להבטיח זרימת דם מיידית. לאסוף 200-300 μL של דם (בהתאם למשקל העכבר) לתוך 1.5 מ"ל פוליפרופילן microcentrifuge צינור או צינור מפריד בסרום. לאחר איסוף הדם, יש להפעיל לחץ עדין על אתר הניקוב עד להפסקת הדימום. החזירו את העכברים לכלובים שלהם והתבוננו עד שיתאוששו מההרדמה.
הערה: אין לאסוף יותר מ-1% ממשקל גוף העכבר באוסף אחד או במשך 24 שעות. - תן את קריש הדם שנאסף בטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות. מניחים את הצינורות על קרח עד שהם מוכנים לצנטריפוגה.
- צנטריפוגה הדם קרוש ב 1540 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (75 °F).
- אספו את השכבה העליונה (סרום) מבלי להפריע לכדוריות הדם האדומות. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
4. ריבוב של הסרום שנאסף
- הפשירו את דגימות הסרום או הפלזמה תוך שמירה עליהן על קרח.
- צנטריפוגה את הדגימות ב 1540 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לשקוע כל פסולת התא בזהירות לאסוף את שכבת הסרום מלמעלה.
- הוציאו את ערכת המולטיפלקס בטמפרטורת החדר.
הערה: קיימות מספר ערכות מולטיפלקס זמינות מסחרית המיועדות לציטוקינים, כימוקינים או גורמי גדילה ספציפיים. כמו כן, ניתן להתאים אישית את הערכה על בסיס החלבון המעניין. - בצע את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי לזהות ציטוקינים.
הערה: רוב ערכות המרבבים משתמשות בחרוזים מגנטיים כדי לקשור את הנוגדן שנלכד. לכן, חיוני להשתמש במכונת כביסה מגנטית אוטומטית או ידנית במהלך הכביסה. אחרת, החרוזים המגנטיים יישטפו מהצלחת, ולא יהיו מספיק אירועים כדי לקחת את הקריאה.
5. איסוף סרטנים ובלוטת לימפה מפשעתית והכנת השעיה של תא בודד
- מרדימים את העכברים עם תערובת קטמין/קסילזין. כדי להבטיח הרגעה מלאה, השתמש ברפלקס הדוושה (צביטת בוהן מוצקה). אם העכברים אינם מגיבים, הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.
- הניחו כל עכבר על גבו ורססו 70% אתנול על העור באזור הבטן. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את הגידול מהצד השמאלי של העכברים ואת בלוטת הלימפה מצד ימין. אם הגידול גדול, לחתוך לחתיכות קטנות ולקחת 500-600 מ"ג של הרקמה. עבור בלוטת הלימפה, לאסוף את כל האיבר.
הערה: ישנן שתי בלוטות לימפה משני צידי אזור המפשעה. בהתאם למטרות הניסוי, ניתן לבודד את בלוטת הלימפה ואת הגידול מאותו צד. עם זאת, אם הגידול הופך להיות גדול מאוד, זה לא יהיה קל לאסוף את בלוטת הלימפה מאותו צד. - הניחו את הרקמות על צינורות הדיסוציאטור המתאימים המכילים 3-5 מ"ל של מדיית RPMI. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות דיסוציאטור אוטומטי.
הערה: ניתן להשתמש בהומוגנייזרים אוטומטיים או ידניים אחרים. - לאחר הומוגניזציה, להעביר את השעיית התא דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C כדי להסיר את המדיה. לשטוף ולהשעות מחדש את התאים ב 1-2 מ"ל של PBS קר.
6. צביעת FACS של השעיה חד-תאית
- השתמש 0.4% צביעה כחולה טריפאן כדי לספור את התאים קיימא המוציטומטר. חשב את הנפח הדרוש כדי לקבל 2-3 מיליון תאים ולהעביר אותם לצינור FACS המתאים.
- השתמש בצבע קיימא כדי שער על תאים חיים; אחרת, קשירה לא ספציפית של הנוגדן עם תאים מתים עלולה להתרחש שיכולה להניב תוצאה חיובית שגויה.
הערה: צבע זומבי שימש לצביעת תאים חיים ומתים בניסוי זה. מספר צבעים הניתנים לתיקון ושאינם ניתנים לתיקון (למשל, פרופידיום יודי) זמינים מסחרית. - צנטריפוגה (277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C) התאים שנספרו. דקרו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ל-300 מיקרוליטר של PBS. הוסף 0.5-1 μL של צבע זומבי / צינור. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות בחושך.
- צנטריפוגה (277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C) ולשטוף את התאים עם 1-2 מ"ל של מאגר FACS ולהשעות אותם לתוך 200 μL של מאגר FACS.
- הוסף חוסם קולטן Fc (2 μL לכל 200 μL או על פי פרוטוקול היצרן) ודגר על התאים במשך 10 דקות.
- צנטריפוגה (277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C) ולשטוף את התאים עם 1-2 מ"ל של מאגר FACS. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים ודגרים במשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- לאחר הדגירה, צנטריפוגה (277 x גרם במשך 5 דקות ב 25 ° C) ולשטוף את התאים עם 1-2 מ"ל FACS חיץ . הוסף 300-400 μL של 2% תמיסת paraformaldehyde והשהה מחדש לקיבוע. אחסן את התאים בשלב זה במשך כמה ימים ב 4 °C או לנתח מיד על ידי ציטומטר זרימה צבעוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה נחקרה הפעילות האנטי-סרטנית של פוליאנהידריד IL-1α במודל עכברי סינגני של HNSCC. רקומביננטי IL-1α (rIL-1α) האט באופן משמעותי את צמיחת הגידול ב-mEERL (איור 1A), אף על פי שנצפתה ירידה במשקל בעכברים שטופלו, אשר שוקמה לאחר הגמילה מהטיפול (איור 1B). IL-1α-NPs לא גרמו להשפעה אנטי-סרטנית משמעותית בהשוואה ל-NPs מלוחים או ריקים (איור 1A), והם לוו בירידה מסוימת במשקל, אם כי לא בולטים כמו rIL-1α (איור 1B). עכברים שטופלו ב-rIL-1α שרדו זמן רב יותר באופן משמעותי מקבוצות הטיפול האחרות (איור 1C). נוסף על כך, רמות IL-1α, IL-1β ו-IFN-γ במחזור הדם היו גבוהות יותר בעכברים שטופלו ב-rIL-1α בהשוואה לקבוצות הטיפול האחרות (איור 2A-C). תוצאות אלה מצביעות על כך שיש צורך בשיפורים ב- IL-1α-NP בכל הנוגע ליעילות נגד גידולים.
איור 1: ההשפעה של rIL-1α על גדילת הגידול, הישרדותו ומשקל גופו. עכברי C57BL/6J זכרים (n = 10-11 עכברים / קבוצת טיפול) הנושאים גידולי mEERL HNSCC טופלו ביום 1 וביום 5 עם rIL-1α (3.75 מיקרוגרם של rIL-1α), IL-1α-NP (0.25 מ"ג של NPs המכילים 3.75 מיקרוגרם של rIL-1α), Blank-NP (0.25 מ"ג של NPs), ו 100 מיקרוליטר של תמיסת מלח (CON). מוצגים שינויים בנפח הגידול הממוצע (A), משקל גוף מנורמל (B) ועקומות הישרדות (C). קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. *P < 0.05 לעומת קבוצות טיפול אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההשפעה של rIL-1α על ציטוקינים במחזור. דגימות דם נאספו מתת-קבוצה של עכברים (n = 4 עכברים / קבוצת טיפול) לאחר מתן התרופה השנייה ונותחו לרמות ציטוקינים במחזור על ידי בדיקת מולטיפלקס. מוצגות רמות במחזור של IL-1α (A), IL-1β (B) ו- IFN-γ (C). קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה יאפשר לכל חוקר לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית וחלק מהמנגנונים הבסיסיים של תרופות אימונומודולטוריות במערכת מודל עכבר גידול in vivo . כאן נעשה שימוש במודל גידול תת-עורי סינגני, שיש לו מספר יתרונות על פני מודלים אורתוטופיים, כולל פרוטוקול פשוט מבחינה טכנית, ניטור קל של צמיחת הגידול, פחות תחלואה בבעלי חיים ויכולת ייצור גבוהה יותר. מודלים של גידולים תת-עוריים יכולים גם להשתנות למודל גידול דו-צדדי על ידי הזרקת תאי גידול הן בצד שמאל והן בצד ימין. במודל גידול דו-צדדי זה, ניתן לתת הקרנות או תרופות לגידול אחד תוך גידולי, וניתן לעקוב אחר תגובות אבסקופליות. מודלים אורתוטופיים של עכברי HNSCC, בעוד שהם רלוונטיים יותר מבחינה קלינית, הם מאתגרים מבחינה טכנית ליצור, קשה לעקוב אחר צמיחת הגידול, ונטל הגידול בחלל הפה גורם לעתים קרובות להמתת חסד מוקדמת עקב חוסר היכולת של העכברים לאכול ולשתות.
הכנת תאים היא צעד חשוב להיווצרות גידולים סימטריים בגודל דומה בכל העכברים. הכנה לקויה של תאים גורמת לירידה בכדאיות התאים ומשפיעה מאוד על יצירת הגידול בעכברים. מומלץ שתאי הגידול יהיו במספר מעבר מוקדם ובטווח של 80%-90% מפגש. מספר מעבר גבוה יותר ומפגש משפיעים על כדאיות התא ובכך על יצירת הגידול. כמו כן, יש להזריק תאים בהקדם האפשרי לאחר ההכנה מכיוון שהכדאיות מופחתת אם נשמרים ב- PBS מעבר ל 20-30 דקות. אם יש צורך להשתיל מספר גדול של עכברים עם גידולים, מומלץ להכין תמיסת מלאי של תאים המוחזקים במדיה ולהכין תרחיפים של תאים הניתנים להזרקה ב- PBS עבור קבוצה קטנה יותר של בעלי חיים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לשמור עליהם בזהירות לאחר הכנת תאי הגידול להזרקה. הזרקת תאי גידול לחלל התת-עורי יכולה לייצר דפוסי גדילה וגדלים שונים של הגידול בהשוואה לחלל התת-עורי. לכן, יש לשים לב בזהירות על מיקום המחט להיווצרות גידול עקבי. בחירת מחט חשובה גם היא. אם המחט קטנה יותר מהתא הסרטני, מחטים קטנות יותר עלולות לגרום ללחץ על התאים וכתוצאה מכך פחות כדאיות. אם המחט גדולה מאוד, היא עלולה לפגוע בחיה ולגרום לדליפת תאים מהאתר המוזרק. אפילו עבור חוקרים מנוסים עם גודל המחט הנכון, עלולה להיות דליפת תאים באתר המוזרק וכתוצאה מכך גידול קטן או ללא גידול. חשוב שהחוקרים ישתמשו בטכניקה הנכונה להזרקת הגידול ובגודל המחט האופטימלי על מנת להפחית את אובדן תאי הגידול ולהגביר את הדיוק והדיוק במהלך השתלת תאי הגידול. מדידות הגידול צריכות להיעשות בזהירות באמצעות קליפרים Vernier (ידני או אלקטרוני). השיטה הטובה ביותר היא להיות עקבי עם כיוון מדידת אורך הגידול ורוחבו כדי להפחית את השונות. מדידת הגידול על ידי אותו חוקר לאורך המחקר יכולה להפחית את השונות.
כצפוי, עכברים שקיבלו rIL-1α ירדו במשקל במהלך הטיפול, מה שתומך בממצאים קודמים15,16. למרות שירידה במשקל היא דרך פשוטה ופשוטה להערכת רעילות, ישנן נקודות קצה טוקסיקולוגיות אחרות שניתן להשתמש בהן. הערכה של ספירת תאי הדם (תאי דם לבנים, תאי דם אדומים וספירת טסיות דם) ורמות אנזימי כבד (טרנסמינאז אספרטט, אלנין אמינוטרנספראז ופוספטאז אלקליין) מספקת מידע חשוב על רעילות תרופות. בנוסף, ניתן להקריב תת-קבוצה של עכברים, ולבצע ניתוח היסטופתולוגי של איברים (כבד, כליות, לבלב, ריאות וכו '). דלקת מערכתית משמשת לעתים קרובות כאינדיקטור לרעילות. כאן, מספר ציטוקינים מעודדי דלקת במחזור נותחו בעכברים לאחר טיפול תרופתי על ידי ניקור תת-לסתני באמצעות מחט 18 גרם. ניקור תת-מנדיבולרי בעכברים דורש מיומנות שמגיעה מחזרות רבות על ההליך. אם הנקב עמוק מדי, הוא עלול לגרום לדימום מהאוזן ולנזק לרקמות פנימיות. ואילו, אם המחט אינה חודרת מספיק רחוק, כמות לא מספקת של דם עלולה להיאסף. חלופות למחטים הן שימוש בשרשראות דימום חד פעמיות. ישנם סוגים שונים של שרוכים מדממים הזמינים מסחרית הנבדלים באורכם. החוקרים צריכים להשתמש בגודל שרוך מתאים כדי להבטיח איסוף דם אופטימלי וטיפול הומני בבעלי חיים. עבור הליך זה, מוצגות תוצאות עבור שלושה ציטוקינים (איור 2A-C). סביר להניח שעלייה במחזור ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל IL-1α, IL-1β ו-IFN-γ שנצפתה בעכברים שטופלו ב-rIL-1α, עשויה להיות קשורה לירידה חריפה במשקל (איור 1B) שנצפתה בקבוצת הטיפול הזו.
לבסוף, מתואר פרוטוקול לבידוד והכנה של השעיות חד-תאיות של גידולים בעכברים ובלוטות לימפה. שיטה זו שימושית למי שמבקש לזהות שינויים בהפעלה ובגיוס של תאי מערכת החיסון עקב טיפול תרופתי. במהלך דיסקציה של גידולים, רקמת שומן, עור, שיער, ופסולת אחרת יש לחסל ככל האפשר. בדרך כלל, נפח הגידול צריך להיות גדול מ 30 מ"מ3 כדי לקבל מספיק תאים עבור ציטומטריה זרימה. עם זאת, אם הגידול גדול מאוד, ייתכן שיהיה קשה להכין השעיות תא בודד. גידולים גדולים יש לחתוך לחתיכות קטנות לפני הצבתו לתוך צינור dissociator. התהליך צריך להיעשות במהירות כדי לקבל תאים קיימא אופטימלי. בנוסף, גידולים גדולים מקשים על מציאת בלוטת הלימפה המפשעתית בצד הגידול. במקרה זה, בלוטת הלימפה המפשעה ניתן לאסוף מהאתר הנגדי. לאחר שמתקבלים מתלים חד-תאיים, ניתן להכתים אותם בנוגדנים שונים ולנתח אותם על ידי ציטומטריית זרימה מרובת צבעים.
באופן כללי, פרוטוקולים אלה מספקים דרך יעילה לחקור את הפעילות האנטי-סרטנית של תרופות המווסתות את מערכת החיסון, ואת השינויים הקשורים בציטוקינים ובאוכלוסיות תאי החיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי Merit Review Award #I01BX004829 מארה"ב המחלקה לענייני חיילים משוחררים, שירות מחקר ופיתוח מעבדה ביו-רפואית ונתמכת על ידי תוכנית פרס מז'יר באמצעות מרכז הולדן מקיף לסרטן באוניברסיטת איווה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex 200 Systems | Bio-Rad | The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care | |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay | Bio-Rad | M60009RDPD | |
| C57BL/6J Mice | Jakson Labs | 664 | 4 to 6 weeks old |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EGF | Millipore Sigma | SRP3196-500UG | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | 12103C-500ML | |
| Gentamycin sulfate solution | IBI Scientific | IB02030 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi biotec | ||
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | Thermo Fisher Scientific | EPX-55555-000 | |
| Hydrocortisone | Millipore Sigma | H6909-10ML | |
| Insulin | Millipore Sigma | I0516-5ML | |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| MEERL cell line | Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells | ||
| Portable Balances | Ohaus | ||
| Scienceware Digi-Max slide caliper | Millipore Sigma | Z503576-1EA | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Cardinal | COV5110.PMP | |
| Transferrin Human | Millipore Sigma | T8158-100MG | |
| Tri-iodothyronin | Millipore Sigma | T5516-1MG |
References
- Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).
- de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders. Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).
- Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system. Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).
- Curti, B. D., Smith, J. W. Interleukin-1 in the treatment of cancer. Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).
- Smith, J. W., et al. The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin. New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Carbone, A. L., Uhrich, K. E. Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters). Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021 (2009).
- Gopferich, A., Tessmar, J. Polyanhydride degradation and erosion. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).
- Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. Role of polyanhydrides as localized drug carriers. Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).
- Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. Polyanhydrides: an overview. Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells. Molecules. 22 (6), (2017).
- Espinosa-Cotton, M., et al. Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79 (2019).
- Veltri, S., Smith, J. W. Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects. The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).
