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Cancer Research

पॉलीएनहाइड्राइड आईएल -1 नैनोपार्टिकल्स की विवो एंटीट्यूमर गतिविधि का मूल्यांकन

Published: June 28, 2021 doi: 10.3791/62683
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,4,5,6, 3,4, 1,2,3,5,6,7
1Interdisciplinary Graduate Program in Human Toxicology, University of Iowa, 2Department of Pathology, University of Iowa, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering, Iowa State University, 4Nanovaccine Institute, Iowa State University, 5Division of Pharmaceutics and Translational Therapeutics, College of Pharmacy, University of Iowa, 6Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 7Department of Oral Pathology, Radiology and Medicine, College of Dentistry, University of Iowa

Summary

एचएनएससीसी के सिंजेनिक माउस मॉडल में आईएल -1 की एंटीट्यूमर गतिविधि और संबंधित विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Abstract

साइटोकिन थेरेपी एक आशाजनक इम्यूनोथेराप्यूटिक रणनीति है जो कैंसर रोगियों में मजबूत एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का उत्पादन कर सकती है। प्रोइन्फ्लेमेटरी साइटोकिन इंटरल्यूकिन -1 अल्फा (आईएल -1) का मूल्यांकन कई प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययनों में एंटीकैंसर एजेंट के रूप में किया गया है। हालांकि, फ्लू जैसे लक्षणों और हाइपोटेंशन सहित खुराक-सीमित विषाक्तता ने इस चिकित्सीय रणनीति के लिए उत्साह को कम कर दिया है। आईएल -1 का पॉलीएनहाइड्राइड नैनोपार्टिकल (एनपी) आधारित वितरण इस संदर्भ में एक प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करेगा क्योंकि यह विषाक्त दुष्प्रभावों को कम करते हुए आईएल -1 को व्यवस्थित रूप से धीमी और नियंत्रित रिहाई की अनुमति दे सकता है। यहां सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) सिंजेनिक माउस मॉडल में आईएल -1-लोडेड पॉलीएनहाइड्राइड एनपी की एंटीट्यूमर गतिविधि का विश्लेषण वर्णित है। एचआरएएस और लूसिफेरस (एमईआरएल) कोशिकाओं के साथ एचपीवी 16 ई 6 /ई 7 को स्थिर रूप से व्यक्त करने वाली मुराइन ऑरोफरीन्जियल एपिथेलियल कोशिकाओं को सी 57बीएल / 6 जे चूहों के दाहिने फ्लैंक में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया था। एक बार जब ट्यूमर किसी भी दिशा में 3-4 मिमी तक पहुंच गया, तो 1.5% आईएल -1 ए - लोडेड 20: 80 1,8-बीआईएस (पी-कार्बोक्सीफेनोक्सी) -3,6-डायोक्साओक्टेन: 1,6-बीआईएस (पी-कार्बोक्सीफेनोक्सी) हेक्सेन (सीपीटीईजी: सीपीएच) नैनोपार्टिकल (आईएल -1-एनपी) फॉर्मूलेशन को चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था। ट्यूमर का आकार और शरीर का वजन लगातार मापा गया जब तक कि ट्यूमर का आकार या वजन घटाने इच्छामृत्यु मानदंडों तक नहीं पहुंच गया। सबमैंडिबुलर वेनिपंक्चर द्वारा एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए रक्त के नमूने लिए गए थे, और भड़काऊ साइटोकिन्स को साइटोकिन मल्टीप्लेक्स परख के माध्यम से मापा गया था। मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए ट्यूमर और इंगुइनल लिम्फ नोड्स को एक एकल-कोशिका निलंबन में निकाला और समरूप किया गया था। ये मानक विधियां जांचकर्ताओं को एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कैंसर के उपचार के लिए इम्यूनोस्टिमुलेटरी एनपी और अन्य इम्यूनोथेरेपी एजेंटों के संभावित तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देंगी।

Introduction

कैंसर इम्यूनोथेरेपी के उभरते क्षेत्रों में से एक उनके ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ रोगियों की प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के लिए भड़काऊ साइटोकिन्स का उपयोग है। कई प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (यानी, इंटरफेरॉन-अल्फा (आईएफएन), इंटरल्यूकिन -2 (आईएल -2), और इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1)) महत्वपूर्ण एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को माउंट कर सकते हैं, जिसने एंटीट्यूमर गुणों के साथ-साथ साइटोकिन-आधारित दवाओं की सुरक्षा की खोज में रुचि पैदा की है। विशेष रूप से इंटरल्यूकिन -1 अल्फा (आईएल -1) एक प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन है जिसे सूजन के मास्टर साइटोकिन1 के रूप में जाना जाता है। 1970 के दशक के अंत में इस साइटोकिन की खोज के बाद से, कीमोथेरेपी2 के नकारात्मक प्रभावों का इलाज करने के लिए एंटीकैंसर एजेंट के साथ-साथ हेमटोपोइएटिक दवा के रूप में इसकी जांच की गई है। 1980 के दशक के उत्तरार्ध के दौरान, आईएल -1 के एंटीकैंसर प्रभावों को निर्धारित करने के लिए कई प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन किए गए थे। इन अध्ययनों में मेलेनोमा, गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा और डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा के खिलाफ पुनः संयोजक आईएल -1 (आरआईएल -1) की आशाजनक एंटीट्यूमर गतिविधि पाई गई। हालांकि, बुखार, मतली, उल्टी, फ्लू जैसे लक्षण, और सबसे गंभीर रूप से खुराक-सीमित हाइपोटेंशन सहित विषाक्तता आमतौर पर देखी गई थी। दुर्भाग्य से, इन खुराक से संबंधित विषाक्तताओं ने आरआईएल -1 के आगे नैदानिक उपयोग के लिए उत्साह को कम कर दिया।

आईएल -1-मध्यस्थता विषाक्तता के महत्वपूर्ण मुद्दे को संबोधित करने का प्रयास करने के लिए, पॉलीएनहाइड्राइड नैनोपार्टिकल (एनपी) फॉर्मूलेशन जो सतह क्षरण कैनेटीक्स द्वारा आईएल -1 की नियंत्रित रिहाई की अनुमति देते हैं, की जांच की जाएगी। इन एनपी फॉर्मूलेशन का उद्देश्य आईएल -1 के एंटीट्यूमर गुणों के लाभों को पुनः प्राप्त करना है, जबकि खुराक-सीमितदुष्प्रभावों को कम करना है। पॉलीएनहाइड्राइड एफडीए-अनुमोदित पॉलिमर हैं जो सतह के क्षरण के माध्यम से खराब हो जाते हैं जिसके परिणामस्वरूप एनकैप्सुलेटेड एजेंटों की लगभग शून्य-क्रम रिलीजहोती है 8,9,10,11,12। एम्फीफिलिक पॉलीएनहाइड्राइड कॉपोलिमर जिसमें 1,8-बीआईएस-(पी-कार्बोक्सीफेनोक्सी)-3,6-डायोक्साओक्टेन (सीपीटीईजी) और 1,6-बिस-(पी-कार्बोक्सीफेनोक्सी) हेक्सेन (सीपीएच) होते हैं, को ऑन्कोलॉजी और इम्यूनोलॉजी-आधारित अनुसंधान 8,12 में विभिन्न पेलोडके लिए उत्कृष्ट वितरण प्रणाली बताया गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल 20: 80 सीपीटीईजी में: 1.5 डब्ल्यूटी.% आरआईएल -1 (आईएल -1-एनपी) से भरे सीपीएच एनपी का उपयोग एचएनएससीसी के माउस मॉडल में इस साइटोकिन की एंटीट्यूमर गतिविधि और विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जाएगा।

निम्नलिखित प्रक्रियाओं का समग्र लक्ष्य एचएनएससीसी पर आईएल -1-एनपी की एंटीट्यूमर गतिविधि का आकलन करना है। ट्यूमर के विकास और अस्तित्व का आकलन करने सहित वर्णित प्रक्रियाओं को रुचि के किसी भी प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटरी एजेंट पर लागू किया जा सकता है। नैदानिक प्रासंगिकता को अधिकतम करने के लिए इन प्रक्रियाओं को एक बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली13 के साथ एक सिंजेनिक माउस मॉडल में किया जाना चाहिए। आईएल -1-एनपी विषाक्तता का मूल्यांकन प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और पशु वजन के परिसंचारी स्तरों में परिवर्तन को मापकर भी किया जाएगा। विवो दवा विषाक्तता में निर्धारित करने के कई तरीके हैं; हालांकि, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में अंग विषाक्तता और उन अंगों में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के लिए सीरम एंजाइमों का माप शामिल है। हालांकि, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करने के लिए, जानवर को बलिदान करने की आवश्यकता होती है, जो प्रयोग के उत्तरजीविता वक्रों को प्रभावित करेगा। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में सीरम नमूनों में साइटोकिन्स के माप के लिए जीवित चूहों से रक्त के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल होगा। एकत्रित सीरम का उपयोग अंग विषाक्तता के लिए किसी भी वांछित सीरम विश्लेषण के माप के लिए किया जा सकता है। मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में परिवर्तन और लिम्फ नोड में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास को समझने के लिए किया जाएगा। प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और / या संरक्षितवर्गों 14 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस शामिल हैं। हालांकि, ये तकनीक बड़ी संख्या में जानवरों पर प्रदर्शन करने के लिए समय लेने वाली और थकाऊ हो सकती हैं। कुल मिलाकर, निम्नलिखित विधियां जांचकर्ताओं को एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कैंसर के उपचार के लिए इम्यूनोस्टिमुलेटरी एजेंटों के संभावित तंत्र का अध्ययन करने की अनुमति देंगी।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सभी विवो प्रक्रियाओं को आयोवा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. एचएनएससीसी सेल लाइन की तैयारी और रखरखाव

नोट: इस अध्ययन में, एचपीवी ई 6 और ई 7 के साथ एचआरएएस और ल्यूसिफेरस (एमईआरएल) के साथ मुराइन ऑरोफरीन्जियल एपिथेलियल सेल लाइन का उपयोग किया जाएगा। इस सेल लाइन को C57BL / 6J माउस स्ट्रेन से विकसित किया गया था और डॉ पाओला डी वर्मियर (सर्जरी विभाग, साउथ डकोटा सैनफोर्ड स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय, साउथ डकोटा, यूएसए) से एक उपहार था।

  1. पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पानी के स्नान में एमईआरएल कोशिकाओं की जमी हुई शीशी को पिघलाएं और फिर गर्म संस्कृति मीडिया (डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम [डीएमईएम] के साथ पूरक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें , जिसमें 40.5% 1: 1 डीएमईएम / हैम्स एफ 12, 10% भ्रूण बोवाइन सीरम [एफबीएस], 0.1% जेंटामाइसिन, 0.005% हाइड्रोकार्टिसोन, 0.05% ट्रांसफेरिन, 0.05% इंसुलिन, 0.05% इंसुलिन, 0.05% ट्रांसफेरिन, 0.05% इंसुलिन शामिल हैं।
  2. मीडिया को हटाने के लिए शंक्वाकार ट्यूब को 277 x g पर 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, सेल पेलेट को 3-5 एमएल ताजा मीडिया में फिर से निलंबित करें और इसे टी -25 सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें। जमे हुए भंडारण से इष्टतम वसूली के लिए, उच्च घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं।
    नोट: टी -25 फ्लास्क का उपयोग उनके छोटे आकार के कारण किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जमे हुए भंडारण से तेजी से वसूली का समय होता है जब कोशिकाएं टी -75 फ्लास्क की तुलना में निकटता में होती हैं।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में बढ़ने दें, बड़े फ्लास्क (यानी, टी -75 या टी -150) तक विस्तार करें, और हर 3 दिनों में पारित करें। जब सभी चूहों में वांछित आरोपण के लिए पर्याप्त कोशिकाएं होती हैं, तो फ्लास्क को हटा दें, मीडिया को छोड़ दें, और धीरे से फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। फिर, 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 4 एमएल (यदि टी 150 फ्लास्क का उपयोग कर रहे हैं) जोड़ें, और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उपयोग किए जा रहे डिश / फ्लास्क आकार के आधार पर ट्रिप्सिन की मात्रा को ऊपर या नीचे स्केल करें।
    नोट: सेल लाइन का प्रकार और कंफ्लुएंसी की डिग्री ट्रिप्सिनाइजेशन समय को प्रभावित कर सकती है। लंबी ट्रिप्सिनाइजेशन अवधि कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकती है जिसके परिणामस्वरूप कम व्यवहार्यता होती है। ट्रिप्सिनाइजेशन के लिए आवश्यक न्यूनतम समय का उपयोग करें।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत, ट्रिप्सिनाइजेशन पर अलग कोशिकाएं स्वतंत्र रूप से चलती हैं। यदि कुछ कोशिकाएं अभी भी जुड़ी हुई हैं, तो शेष अनुयायी कोशिकाओं को जुटाने के लिए फ्लास्क को बहुत धीरे से टैप करें। ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ताजा मीडिया (वांछित मीडिया की मात्रा) जोड़ें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में सेल निलंबन एकत्र करें। मीडिया को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  5. ताजा मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और कोशिकाओं की गणना करें। सेंट्रीफ्यूज एक बार फिर (जैसा कि ऊपर वर्णित है), और फिर 10 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए कोशिकाओं में ठंडा पीबीएस जोड़ें। चूहों को इंजेक्शन देने से पहले सेल सस्पेंशन को बर्फ पर रखें।

2. ट्यूमर आरोपण, दवा उपचार, और माप

नोट: प्रयोगात्मक जानवरों को आयोवा विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधा में रखा गया था और उन्हें संभालने के लिए उचित सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं का पालन किया गया था।

  1. केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) मिश्रण के साथ सी 57 बीएल / 6 जे चूहों को एनेस्थेटाइज करें। इलेक्ट्रिक रेजर के साथ फ्लैंक क्षेत्र या वांछित इंजेक्शन साइट को सावधानीपूर्वक शेव करें।
    नोट: संस्थागत (या अन्य) नियमों और विनियमों द्वारा आवश्यक नियंत्रित पदार्थों के उपयोग का दस्तावेजीकरण करना याद रखें।
  2. एक इथेनॉल पैड के साथ फ्लैंक क्षेत्र को कीटाणुरहित करें और धीरे-धीरे 25-28 जी सिरिंज का उपयोग करके सेल निलंबन के 100 μL (1 x 106 कोशिकाओं युक्त) को इंजेक्ट करें। अचानक आंदोलनों और सेल हानि को रोकने के लिए इंजेक्शन से पहले चूहों को एनेस्थेटाइज करें। प्रत्येक इंजेक्शन से पहले, कोशिकाओं को शीशी या शंक्वाकार ट्यूब के तल पर बसने से रोकने के लिए धीरे से सेल निलंबन मिलाएं।
  3. सेल सस्पेंशन को सिरिंज में लेने के बाद, ऊपर से सभी बुलबुले और मृत स्थान को हटा दें। सेल निलंबन को धीमी और स्थिर तरीके से इंजेक्ट करें। कई चूहों पर एक ही सुई का उपयोग न करें। आकस्मिक नुकसान के लिए हमेशा अतिरिक्त सेल निलंबन करें।
  4. जानवर को अपने संबंधित पिंजरों में रखें और एनेस्थीसिया से ठीक होने तक उनकी निगरानी करें। संज्ञाहरण के दौरान, जानवरों को हाइपोथर्मिया का खतरा होता है; इसलिए, पूरक गर्मी प्रदान करें या चूहों को गर्म रखने के लिए एक दूसरे के करीब रखें (यदि एक ही पिंजरे में रखा गया है)।
  5. जब ट्यूमर किसी भी दिशा में 3 मिमी तक पहुंच जाता है, तो उपचार समूहों में चूहों (ट्यूमर के आकार और / या वजन से) को यादृच्छिक करें और फिर दवा उपचार शुरू करें। चूहों को एनपी15 के साथ इंट्रापेरिटोनियल (यानी) इंजेक्ट करें जिसमें 4 और 9 दिनों में 3.75 μg rIL-1 ° / माउस होता है। ट्यूमर की मात्रा ((लंबाई x चौड़ाई 2) /2) और माउस वजन को दैनिक या हर दूसरे दिन मापें और रिकॉर्ड करें जब तक कि ट्यूमर का आकार या चूहे इच्छामृत्यु मानदंड तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: यहां तक कि एक अनुभवी शोधकर्ता के साथ, सभी चूहों में एक ही आकार के ट्यूमर को प्रत्यारोपित करना मुश्किल है। ट्यूमर के आकार और माउस के वजन के आधार पर प्रयोगात्मक समूहों में जानवरों को यादृच्छिक करें।

3. रक्त संग्रह और सीरम पृथक्करण

नोट: एक सबमैंडिबुलर नस से रक्त संग्रह एक आसान और प्रभावी तकनीक है जो संज्ञाहरण के तहत जागरूक जानवरों या जानवरों से रक्त संग्रह की अनुमति देती है। इस अध्ययन के लिए, जानवरों से रक्त एकत्र किया गया था जब वे संज्ञाहरण के अधीन थे।

  1. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, केटामाइन / ज़ाइलज़िन मिश्रण के इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  2. गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग करके कंधे पर ढीली त्वचा को पकड़ें और जबड़े के थोड़ा पीछे (उस क्षेत्र में एक सफेद स्थान) 18 ग्राम सुई या लैंसेट के साथ सबमैंडिबुलर नस को पंचर करें।
  3. रक्त प्रवाह को तुरंत सुनिश्चित करने के लिए नस को पंचर करें। 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब या सीरम विभाजक ट्यूब में 200-300 μL रक्त (माउस के वजन के आधार पर) एकत्र करें। रक्त संग्रह के बाद, पंचर साइट पर कोमल दबाव लागू करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए। चूहों को उनके संबंधित पिंजरों में वापस करें और एनेस्थीसिया से ठीक होने तक निरीक्षण करें।
    नोट: एक संग्रह में या 24 घंटे की अवधि में माउस शरीर के वजन का 1% से अधिक एकत्र न करें।
  4. एकत्रित रक्त को कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए छोड़ दें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें जब तक कि वे सेंट्रीफ्यूज होने के लिए तैयार न हों।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1540 x g पर थक्के वाले रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. लाल रक्त कोशिकाओं को परेशान किए बिना ऊपरी परत (सीरम) एकत्र करें। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. एकत्रित सीरम का मल्टीप्लेक्सिंग

  1. सीरम या प्लाज्मा के नमूनों को बर्फ पर रखते समय उन्हें पिघलाएं।
  2. किसी भी सेल मलबे को तलछट करने और शीर्ष से सीरम परत को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1540 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. कमरे के तापमान पर मल्टीप्लेक्स किट बाहर लाएं।
    नोट: कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीप्लेक्स किट हैं जो विशिष्ट साइटोकिन्स, केमोकाइन या विकास कारकों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इसके अलावा, रुचि के प्रोटीन के आधार पर किट को अनुकूलित करना संभव है।
  4. साइटोकिन्स का पता लगाने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार परख करें।
    नोट: अधिकांश मल्टीप्लेक्स किट कैप्चर किए गए एंटीबॉडी को बांधने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करते हैं। इसलिए, धोने के दौरान स्वचालित या हैंडहेल्ड चुंबकीय वॉशर का उपयोग करना आवश्यक है। अन्यथा, चुंबकीय मोती प्लेट से धुल जाएंगे, और किसी के पास पढ़ने के लिए पर्याप्त घटनाएं नहीं होंगी।

5. ट्यूमर और इंगुइनल लिम्फ नोड का संग्रह और एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी

  1. केटामाइन / ज़ाइलज़िन मिश्रण के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पूर्ण बेहोश करने की क्रिया सुनिश्चित करने के लिए, पेडल रिफ्लेक्स (दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी) का उपयोग करें। यदि चूहे उत्तरदायी नहीं हैं, तो गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  2. प्रत्येक माउस को अपनी पीठ पर रखें और पेट क्षेत्र की त्वचा पर 70% इथेनॉल स्प्रे करें। चूहों के बाईं ओर से ट्यूमर और दाईं ओर से लिम्फ नोड को काटने के लिए बल और कैंची का उपयोग करें। यदि ट्यूमर बड़ा है, तो छोटे टुकड़ों में काट लें और ऊतक के 500-600 मिलीग्राम लें। लिम्फ नोड के लिए, पूरे अंग को इकट्ठा करें।
    नोट: इंगुइनल क्षेत्र के दोनों किनारों पर दो लिम्फ नोड्स हैं। प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर, लिम्फ नोड और ट्यूमर को एक ही तरफ से अलग किया जा सकता है। हालांकि, अगर ट्यूमर बहुत बड़ा हो जाता है, तो लिम्फ नोड को एक ही तरफ से इकट्ठा करना आसान नहीं होगा।
  3. ऊतकों को संबंधित विघटनकारी ट्यूबों पर रखें जिसमें आरपीएमआई मीडिया के 3-5 एमएल होते हैं। एक स्वचालित विघटनकर्ता का उपयोग करके ऊतक को समरूप करें।
    नोट: अन्य स्वचालित या हैंडहेल्ड होमोजेनाइज़र का उपयोग किया जा सकता है।
  4. होमोजेनाइजेशन के बाद, सेल निलंबन को 70 μm फ़िल्टर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। मीडिया को हटाने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g पर सेंट्रीफ्यूज। ठंडे पीबीएस के 1-2 एमएल में कोशिकाओं को धोएं और फिर से निलंबित करें।

6. एकल-सेल निलंबन का एफएसीएस धुंधला होना

  1. हेमोसाइटोमीटर में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए 0.4% ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करें। 2-3 मिलियन कोशिकाओं को प्राप्त करने और उन्हें संबंधित एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
  2. जीवित कोशिकाओं पर गेट करने के लिए व्यवहार्यता डाई का उपयोग करें; अन्यथा, मृत कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी का निरर्थक बंधन हो सकता है जो गलत-सकारात्मक परिणाम दे सकता है।
    नोट: इस प्रयोग में जीवित और मृत सेल धुंधला करने के लिए ज़ोंबी डाई का उपयोग किया गया था। कई फिक्सेबल और नॉन-फिक्सेबल डाई (जैसे, प्रोपिडियम आयोडाइड) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
  3. सेंट्रीफ्यूज (25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g ) गिनी गई कोशिकाएं। सतह पर तैरने वाले को अलग करें और कोशिकाओं को पीबीएस के 300 μL में पुन: निलंबित करें। ज़ोंबी डाई / ट्यूब के 0.5-1 μL जोड़ें। अंधेरे में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. सेंट्रीफ्यूज (25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g ) और कोशिकाओं को 1-2 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धोएं और उन्हें एफएसीएस बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
  5. एफसी-रिसेप्टर ब्लॉकर जोड़ें (2 μL प्रति 200 μL या निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) और कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज (25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g ) और कोशिकाओं को 1-2 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धोएं। एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज (25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 277 x g ) और कोशिकाओं को 1-2 एमएल एफएसीएस बफर के साथ धोएं। 2% पैराफॉर्मलडिहाइड घोल के 300-400 μL जोड़ें और निर्धारण के लिए पुन: निलंबित करें। इस चरण में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए स्टोर करें या मल्टीकलर फ्लो साइटोमीटर द्वारा तुरंत विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में, एचएनएससीसी के एक सिंजेनिक माउस मॉडल में पॉलीएनहाइड्राइड आईएल -1 की एंटीट्यूमर गतिविधि की जांच की गई थी। पुनः संयोजक आईएल -1 (आरआईएल -1) ने एमईआरएल ट्यूमर के विकास को काफी धीमा कर दिया (चित्रा 1 ए), हालांकि इलाज किए गए चूहों में वजन घटाने को देखा गया था, जिसे उपचार वापसी के बाद बहाल किया गया था (चित्रा 1 बी)। आईएल -1-एनपी ने खारा या रिक्त-एनपी (चित्रा 1 ए) की तुलना में एक महत्वपूर्ण एंटीट्यूमर प्रभाव को प्रेरित नहीं किया और कुछ वजन घटाने के साथ था, हालांकि आरआईएल -1 के रूप में प्रमुख नहीं था (चित्रा 1 बी)। आरआईएल -1 के साथ इलाज किए गए चूहे अन्य उपचार समूहों (चित्रा 1 सी) की तुलना में काफी लंबे समय तक जीवित रहे। इसके अतिरिक्त, आईएल -1, आईएल -1, और आईएफएन -γ के परिसंचारी स्तर अन्य उपचार समूहों की तुलना में आरआईएल -1- उपचारित चूहों में अधिक थे (चित्रा 2 ए-सी)। इन परिणामों से पता चलता है कि एंटीट्यूमर प्रभावकारिता के संबंध में आईएल -1-एनपी में सुधार की आवश्यकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर के विकास, अस्तित्व और शरीर के वजन पर आरआईएल -1 का प्रभाव। नर C57BL/6J चूहों (n = 10-11 चूहे/उपचार समूह) जिनके पास MEERL HNSCC ट्यूमर हैं, का इलाज पहले और दिन 5 पर rIL-1 (3.75 μg rIL-1a), IL-1e-NP (0.25 mg NPs जिसमें 3.75 μg rIL-1n, ब्लैंक-NP (0.25 mg NPs) और 100 μL नमकीन घोल (CON) के साथ किया गया था। औसत ट्यूमर की मात्रा (ए), सामान्यीकृत शरीर के वजन (बी), और उत्तरजीविता वक्र (सी) में परिवर्तन दिखाए गए हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी < 0.05 बनाम अन्य उपचार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: परिसंचारी साइटोकिन्स पर आरआईएल -1 का प्रभाव। दूसरे दवा के बाद चूहों (एन = 4 चूहों / उपचार समूह) के एक उप-समूह से रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे और मल्टीप्लेक्स परख द्वारा साइटोकिन स्तर को प्रसारित करने के लिए विश्लेषण किया गया था। आईएल -1 (ए), आईएल -1 (बी), और आईएफएन -γ (सी) के परिसंचारी स्तर दिखाए गए हैं। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल किसी भी अन्वेषक को एंटीट्यूमर गतिविधि और विवो ट्यूमर माउस मॉडल सिस्टम में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं के कुछ अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने की अनुमति देगा। यहां, एक सिंजेनिक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल का उपयोग किया गया था, जिसमें ऑर्थोटोपिक मॉडल पर कई फायदे हैं, जिसमें इसके तकनीकी रूप से सरल प्रोटोकॉल, ट्यूमर के विकास की आसान निगरानी, कम पशु रुग्णता और उच्च प्रजनन क्षमता शामिल है। चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल को बाएं और दाएं फ्लैंक दोनों पर ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्ट करके द्विपक्षीय ट्यूमर मॉडल में भी संशोधित किया जा सकता है। इस द्विपक्षीय ट्यूमर मॉडल में, रेडियोथेरेपी या दवाओं को एक ट्यूमर इंट्राट्यूमरल रूप से प्रशासित किया जा सकता है, और एब्स्कोपल प्रतिक्रियाओं की निगरानी की जा सकती है। ऑर्थोटोपिक एचएनएससीसी माउस मॉडल, जबकि अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक हैं, उत्पन्न करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, ट्यूमर के विकास की निगरानी करना मुश्किल है, और मौखिक गुहा में ट्यूमर के बोझ के परिणामस्वरूप अक्सर चूहों के खाने और पीने में असमर्थता के कारण समय से पहले इच्छामृत्यु होती है।

कोशिकाओं की तैयारी सभी चूहों में सममित और समान आकार के ट्यूमर के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं की खराब तैयारी के परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता कम हो जाती है और चूहों में ट्यूमर उत्पादन को बहुत प्रभावित करता है। ट्यूमर कोशिकाओं को प्रारंभिक मार्ग संख्या पर और 80% -90% कंफ्लुएंसी के भीतर होने की सिफारिश की जाती है। उच्च मार्ग संख्या और कंफ्लुएंसी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं और इस प्रकार ट्यूमर उत्पादन करते हैं। कोशिकाओं को तैयारी के बाद जितनी जल्दी हो सके इंजेक्शन दिया जाना चाहिए क्योंकि 20-30 मिनट से अधिक पीबीएस में रखने पर व्यवहार्यता कम हो जाती है। यदि बड़ी संख्या में चूहों को ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है, तो मीडिया में रखी गई कोशिकाओं का स्टॉक समाधान बनाने और जानवरों के एक छोटे समूह के लिए पीबीएस में इंजेक्टेबल सेल सस्पेंशन तैयार करने की सिफारिश की जाती है।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करने के बाद सावधानीपूर्वक बनाए रखने की आवश्यकता है। ट्यूमर कोशिकाओं को सबडर्मल स्पेस में इंजेक्ट करने से चमड़े के नीचे के स्थान की तुलना में विभिन्न ट्यूमर विकास पैटर्न और आकार पैदा हो सकते हैं। इसलिए, लगातार ट्यूमर गठन के लिए सुई प्लेसमेंट पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। सुई का चयन भी महत्वपूर्ण है। यदि सुई कैंसर कोशिका से छोटी है, तो छोटी सुइयां कोशिकाओं को तनाव दे सकती हैं जिसके परिणामस्वरूप कम व्यवहार्यता हो सकती है। यदि सुई बहुत बड़ी है, तो यह जानवर को चोट पहुंचा सकती है और इसके परिणामस्वरूप इंजेक्शन साइट से सेल रिसाव हो सकता है। यहां तक कि सही सुई के आकार वाले अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए, इंजेक्शन साइट पर सेल रिसाव हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा या कोई ट्यूमर नहीं हो सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ता ट्यूमर सेल हानि को कम करने और ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण के दौरान सटीकता और परिशुद्धता बढ़ाने के लिए ट्यूमर इंजेक्शन और इष्टतम सुई आकार के लिए सही तकनीक का उपयोग करें। ट्यूमर माप को वर्नियर कैलिपर्स (मैनुअल या इलेक्ट्रॉनिक) का उपयोग करके सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई माप की दिशा के अनुरूप होना सबसे अच्छा अभ्यास है। पूरे अध्ययन में एक ही शोधकर्ता द्वारा ट्यूमर माप परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है।

जैसा कि अपेक्षित था, आरआईएल -1 प्राप्त करने वाले चूहों ने उपचार के दौरान वजन कम किया, जो पिछलेनिष्कर्षों 15,16 का समर्थन करता है। यद्यपि वजन घटाने विषाक्तता का आकलन करने का एक सरल और सीधा तरीका है, लेकिन अन्य विषाक्त समापन बिंदु हैं जिनका उपयोग किया जा सकता है। रक्त कोशिका की गिनती (सफेद रक्त कोशिकाओं, लाल रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट काउंट) और यकृत एंजाइम के स्तर (एस्पार्टेट ट्रांसमिनेज, एलानिन एमिनोट्रांसफेरेज़ और क्षारीय फॉस्फेट) का आकलन दवा विषाक्तता के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, चूहों के एक उप-समूह का बलिदान किया जा सकता है, और अंगों (यकृत, गुर्दे, अग्न्याशय, फेफड़े, आदि) का हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण किया जा सकता है। प्रणालीगत सूजन का उपयोग अक्सर विषाक्तता के संकेतक के रूप में किया जाता है। यहां, 18 जी सुई का उपयोग करके सबमैंडिबुलर वेनिपंक्चर द्वारा दवा उपचार के बाद चूहों में कई परिसंचारी प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का विश्लेषण किया गया था। चूहों पर सबमैंडिबुलर वेनिपंक्चर के लिए एक कौशल की आवश्यकता होती है जो प्रक्रिया के कई दोहराव से आता है। यदि पंचर बहुत गहरा है, तो इससे कान से रक्तस्राव और आंतरिक ऊतक क्षति हो सकती है। जबकि, यदि सुई पर्याप्त दूर तक प्रवेश नहीं करती है, तो अपर्याप्त मात्रा में रक्त एकत्र किया जा सकता है। सुइयों के विकल्प डिस्पोजेबल रक्तस्राव लैंसेट का उपयोग है। विभिन्न प्रकार के रक्तस्राव लैंसेट हैं जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जो उनकी लंबाई में भिन्न हैं। शोधकर्ताओं को इष्टतम रक्त संग्रह और जानवरों के मानवीय उपचार को सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त लैंसेट आकार का उपयोग करना चाहिए। इस प्रक्रिया के लिए, तीन साइटोकिन्स के परिणाम दिखाए गए हैं (चित्रा 2 ए-सी)। यह संभावना है कि आरआईएल -1, आईएल -1, और आईएफएन -γ सहित परिसंचारी प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स में वृद्धि इस उपचार समूह में देखे गए तीव्र वजन घटाने (चित्रा 1 बी) से जुड़ी हो सकती है।

अंत में, चूहों के ट्यूमर और लिम्फ नोड्स के एकल-कोशिका निलंबन के अलगाव और तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह विधि उन लोगों के लिए उपयोगी है जो दवा उपचार के कारण प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण और भर्ती में परिवर्तन का पता लगाने की मांग करते हैं। ट्यूमर के विच्छेदन के दौरान, वसा ऊतक, त्वचा, बाल और अन्य मलबे को जितना संभव हो उतना समाप्त किया जाना चाहिए। आमतौर पर, प्रवाह साइटोमेट्री के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए ट्यूमर की मात्रा30 मिमी 3 से अधिक होनी चाहिए। हालांकि, अगर ट्यूमर बहुत बड़ा है, तो एकल-सेल निलंबन तैयार करना मुश्किल हो सकता है। बड़े ट्यूमर को विघटनकारी ट्यूब में रखने से पहले छोटे टुकड़ों में काटा जाना चाहिए। इष्टतम व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को जल्दी से किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, बड़े ट्यूमर ट्यूमर पक्ष पर इंगुइनल लिम्फ नोड को ढूंढना मुश्किल बनाते हैं। इस मामले में, इंगुइनल लिम्फ नोड को विपरीत साइट से एकत्र किया जा सकता है। एक बार एकल-सेल निलंबन प्राप्त होने के बाद, उन्हें विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जा सकता है और मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, ये प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटरी दवाओं की एंटीट्यूमर गतिविधि और परिसंचारी साइटोकिन्स और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को संयुक्त राज्य अमेरिका (यू.एस.) से मेरिट रिव्यू अवार्ड #I01BX004829 द्वारा समर्थित किया गया था। वयोवृद्ध मामलों के विभाग, बायोमेडिकल प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा और आयोवा विश्वविद्यालय में होल्डन कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर के माध्यम से मेझिर पुरस्कार कार्यक्रम द्वारा समर्थित।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio-Plex 200 Systems Bio-Rad The system was provided from the Flow Cytometry Facility University of IOWA Health Care
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay Bio-Rad M60009RDPD
C57BL/6J Mice Jakson Labs 664 4 to 6 weeks old
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Thermo Fisher Scientific 11320033
EGF Millipore Sigma SRP3196-500UG
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma 12103C-500ML
Gentamycin sulfate solution IBI Scientific IB02030
gentleMACS Dissociator Miltenyi biotec
Hand-Held Magnetic Plate Washer Thermo Fisher Scientific EPX-55555-000
Hydrocortisone Millipore Sigma H6909-10ML
Insulin Millipore Sigma I0516-5ML
Ketamine/xylazine Injectable anesthesia
MEERL cell line Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells
Portable Balances Ohaus
Scienceware Digi-Max slide caliper Millipore Sigma Z503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Cardinal COV5110.PMP
Transferrin Human Millipore Sigma T8158-100MG
Tri-iodothyronin Millipore Sigma T5516-1MG

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References

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पॉलीएनहाइड्राइड आईएल -1 नैनोपार्टिकल्स की <em>विवो</em> एंटीट्यूमर गतिविधि का मूल्यांकन
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Hasibuzzaman, M. M., Ross, K. A., Salem, A. K., Narasimhan, B., Simons, A. L. Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1α Nanoparticles. J. Vis. Exp. (172), e62683, doi:10.3791/62683 (2021).

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