Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche
Summary
Presentiamo un protocollo per l’utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell’occhio dopo iniezione subcongiuntivale.
Abstract
L’iniezione subcongiuntivale è una via interessante per somministrare farmaci oculari a causa del facile accesso trans-sclerale che bypassa le barriere oculari anteriori, come la cornea e la congiuntiva. Mentre gli effetti terapeutici e la farmacocinetica dei farmaci dopo iniezione subcongiuntivale sono stati descritti in alcuni studi, pochissimi valutano la distribuzione oculare dei farmaci o dei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS). Quest’ultimo è fondamentale per l’ottimizzazione della progettazione della DDS intraoculare e della biodisponibilità del farmaco per ottenere la localizzazione oculare desiderata e la durata dell’azione (ad esempio, acuta contro prolungata). Questo studio stabilisce l’uso della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare qualitativamente la distribuzione oculare dei liposomi fluorescenti in tempo reale in topi vivi dopo iniezione sub-congiuntivale. Essendo progettato per l’ispezione visiva in vivo dei tessuti a livello microscopico, questa è anche la prima descrizione completa del metodo di imaging CLM per studiare la distribuzione spazio-temporale degli iniettabili nell’occhio dopo iniezione subcongiuntivale.
Introduction
La clearance del sangue, la distribuzione dei tessuti e l’occupazione target dei farmaci nei sistemi viventi sono pilastri per comprendere la disposizione dei farmaci in vivo. Nei modelli animali preclinici, questi parametri sono tipicamente valutati mediante frequenti campionamenti di sangue e tessuti in particolari momenti successivi alla somministrazione del farmaco. Tuttavia, queste procedure sono generalmente invasive, spesso includono misurazioni di non sopravvivenza e richiedono grandi coorti di animali per l’alimentazione statistica. Potrebbero esserci costi e tempi aggiuntivi sostenuti, insieme a preoccupazioni etiche per l’uso eccessivo di animali. Di conseguenza, l’imaging non invasivo sta rapidamente diventando un passo fondamentale negli studi di biodistribuzione. La microscopia laser confocale (CLM1,2) è adatta per applicazioni oculari per l’immagine non invasiva della distribuzione spazio-temporale delle terapie negli occhi di animali vivi ad alta sensibilità e alta risoluzione1,3,4.
Il CLM ha il potenziale per facilitare uno screening robusto dei sistemi di somministrazione oculare dei farmaci (DDS), come i liposomi, prima della quantificazione completa della DDS e della biodisponibilità dei farmaci. I liposomi sono attraenti per la loro flessibilità nel sintonizzare le loro proprietà fisico-chimiche e biofisiche5,6,7,8,9,10,11 per incapsulare una grande varietà di carico terapeutico e controllare il sito tissutale di rilascio del farmaco e la durata dell’azione. I liposomi sono stati utilizzati in applicazioni oculari per la somministrazione di grandi molecole, come l’anticorpo monoclonale bevacizumab12, e piccole molecole come la ciclosporina13 e il ganciclovir14. I liposomi caricati con farmaci hanno emivite biologiche più lunghe ed effetti terapeutici prolungati rispetto alle formulazioni “free drug” non liposomiali. Tuttavia, la distribuzione del farmaco nel tessuto oculare è tipicamente estrapolata dalle concentrazioni di farmaco nei componenti fluidi dell’occhio (cioè sangue, umore acqueo e umore vitreo15,16,17). Poiché il destino iniziale in vivo del carico di farmaci caricato è definito dalle proprietà del nanovettore stesso, l’imaging CLM dei liposomi fluorescenti può servire come surrogato del farmaco per rivelare il targeting dei tessuti e i tempi di permanenza dei tessuti in situ. Inoltre, l’evidenza visiva della somministrazione con CLM può guidare la riprogettazione della DDS, valutare i benefici terapeutici del farmaco e forse anche prevedere eventi biologici avversi (ad esempio, tossicità tissutale dovuta alla localizzazione indesiderata della DDS per periodi di tempo prolungati).
Qui, una procedura passo-passo è dettagliata su come studiare la biodistribuzione oculare dei liposomi in topi vivi con un sistema CLM a doppia banda. Questo specifico sistema CLM è in grado di rilevare la fluorescenza bicolore (con laser di eccitazione verde e rosso a 488 nm e 660 nm) in tempo reale, con una frequenza di 8 fotogrammi/s. Posizionando fisicamente la sonda di rilevamento sull’occhio, il protocollo dimostra l’acquisizione e l’analisi delle immagini dei liposomi verde-fluorescenti dopo somministrazione subcongiuntivale in topi pre-iniettati per via endovenosa (IV) con colorante Evans Blue (EB) al 2%. Il colorante EB aiuta a visualizzare le strutture vascolarizzate nel canale di fluorescenza rossa. Mostriamo risultati rappresentativi da uno studio che valuta i liposomi neutri a 100 nm composti dal fosfolipide POPC (cioè 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) e drogati con fosfolipide Fl-DHPE marcato con fluoresceina (cioè N-(fluoresceina-5-tiocarbamoil)-1,2-diesa-decanoil-glicero-glicero-3-fosfoetanolammina) con un rapporto del 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM è in grado di catturare i liposomi verdi marcati con fluoresceina a 15 μm assiale e 3,30 μm di risoluzione laterale delineando i confini del tessuto oculare colorato con EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come mostrato dai risultati, CLM fornisce un metodo semplice e fattibile per visualizzare la distribuzione oculare dei liposomi nell’occhio. In precedenza abbiamo dimostrato l’uso della LMC per caratterizzare la localizzazione di varie formulazioni liposomiali all’interno dell’occhio del topo nel tempo1. Per le applicazioni non invasive, CLM consente l’imaging in tempo reale della superficie oculare anteriore per approfondimenti su come i liposomi sono distribuiti nell’occhio dallo stesso animale….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) assegnata (a SV) e in parte dalla sovvenzione della Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013 / 2 e dalla sovvenzione Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) di Singapore H18/01/a0/018 amministrata dall’Agenzia per la scienza, la tecnologia e la ricerca (A * STAR) (ad AMC). Grazie ai membri del Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) per aver facilitato la logistica e l’esecuzione degli studi e della formazione sulle attrezzature. Un ringraziamento speciale alla signora Wisna Novera per la sua assistenza editoriale.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
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