光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング
Summary
我々は、結膜下注射後の眼のリポソームの時空間分布を非侵襲的に研究するための光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査(CLM)の使用のためのプロトコルを提示する。
Abstract
結膜下注射は、角膜や結膜などの前眼の障壁をバイパスする容易なトランスクレラルアクセスのために眼薬を投与するための魅力的なルートです。結膜下注射時の薬剤の治療効果および薬物動態は、いくつかの研究で説明されているが、非常に少数は、薬物または薬物送達システム(DDS)の眼の分布を評価する。後者は、眼内DDS設計と薬物バイオアベイラビリティの最適化のために、所望の眼の局在化および作用持続時間(例えば、急性対長期)を達成するために重要である。本研究は、結膜下注射後の生きたマウスにおける蛍光リポソームの眼分布をリアルタイムで定性的に研究するための光ファイバー共焦点レーザー顕微鏡(CLM)の使用を確立する。これは、顕微鏡レベルでの組織の 生体内 視視検査のために設計されており、結膜下注射後に眼の注射剤の時空間分布を研究するCLMイメージング法の最初の完全な説明でもあります。
Introduction
生体系における薬物の血クリアランス、組織分布、および標的占有率は、生体内薬物の性質を理解するための柱である。前臨床動物モデルでは、これらのパラメータは、通常、薬物投与後の特定の時点で頻繁に血液および組織サンプリングによって評価される。しかし、これらの手順は、一般に侵襲的であり、多くの場合、非生存測定、および統計的パワーのための大きな動物コホートを必要とすることを含む。動物の過度の使用に対する倫理的な懸念と共に、余分なコストと時間が発生する可能性があります。その結果、非侵襲的イメージングは、バイオディストリビューション研究の不可欠なステップになりつつあります。共焦点レーザー顕微鏡(CLM1,2)は、高感度かつ高分解能の生きている動物の目の中で治療の時空間分布を非侵襲的に画像化する眼球用途に適しています1,3,4。
CLMは、DDSおよび薬物バイオアベイラビリティの包括的な定量化に先立ち、リポソームなどの眼内薬物送達システム(DDS)の堅牢なスクリーニングを容易にする可能性を有する。リポソームは、物理化学的および生物物理学的特性を調整する柔軟性に対して魅力的です5,6,7,8,9,10,11は、多種多様な治療貨物をカプセル化し、薬物放出および作用持続期間の組織部位を制御する。リポソームは、モノクローナル抗体ベバシズマブ12などの大きな分子の送達のための眼球用途で使用されており、シクロスポリン13やガンシクロビル14のような小分子が使用されている。薬物を含むリポソームは、非リポソーム「フリードラッグ」製剤と比較して、生物学的半減期および長期治療効果を有する。しかし、眼組織における薬物分布は、典型的には、眼の流体成分(すなわち、血液、房水、および膜膜房15、16、17)における薬物濃度から外挿される。装填された薬物貨物の初期のin vivo運命は、ナノキャリア自体の特性によって定義されるので、蛍光リポソームのCLMイメージングは、組織ターゲティングおよびその地で組織の滞留時間を明らかにする薬物の代理として役立つことができる。さらに、CLMによる送達の視覚的証拠は、DDS再設計を操縦し、薬物の治療上の利点を評価し、おそらく有害な生物学的事象(例えば、長引く期間のDDSの好ましくない局在化による組織毒性)を予測することさえできる。
ここで、デュアルバンドCLM系を有する生きたマウスにおけるリポソームの眼の生体分布を研究する方法について、ステップバイステップの手順を詳述する。この特定のCLMシステムは8フレーム/sの頻度の2色蛍光(緑および赤色の励磁レーザーは488 nmおよび660 nmで)をリアルタイムで検出できる。このプロトコルは、検出プローブを目の上に物理的に配置することにより、2%エバンスブルー(EB)染料で静脈内注射されたマウス(IV)での結膜下投与時の緑色蛍光リポソームの画像取得および分析を示す。EB色素は、赤い蛍光チャネルで血管形成構造を可視化するのに役立ちます。我々は、リン脂質POPC(すなわち、1-パルミトイル-2-オレロイルグリセロ-3-ホスホコリン)とフルオレセインタグリン脂質Fl-DHPE(すなわち、リン脂質を含む)で構成される100nm中性リポソームを評価する研究の代表的な結果を示す N-(フルオレセイン-5-チオカルバモイル)-1,2-ジヘキサ-デカノイルスン-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン) 95% POPC: 5% Fl-DHPE (図1B)).CLMは、EB染色された眼組織境界の線引きによって、15 μm軸方向および3.30 μmの横方向分解能で緑色のフルオレセインタグ付きリポソームを捕捉することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
結果から示されるように、CLMは目のリポソームの眼分布をイメージする簡単で実現可能な方法を提供する。我々は、以前に、時間1のマウスアイ内の様々なリポソーム製剤の局在化を特徴付けるためにCLMを使用することを実証した。非侵襲的な適用のために、CLMは、同じ動物から眼の中でリポソームがどのように分布しているかの洞察のために前眼表面のリアルタイムの画像…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NTU-Northwesternナノ医学研究所(NNIN)助成金(SV)が授与され、シンガポール国立研究財団グラントAG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2、シンガポールの健康・生物医学(HBMS)産業整合基金事前位置決め(IAF-PP)助成金H18/01/a0/018によって資金提供されました。 技術と研究(A*STAR)(AMCへ)。デュークNUSトランスレーショナル・アンド・モレキュライメージング研究所(LTMI)のメンバーに感謝し、機器の研究とトレーニングのロジスティクスと実行を促進しました。ウィスナ・ナフォラ氏の編集支援に感謝します。
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
