Vi presenterer en protokoll for bruk av fiberoptisk konfokal lasermikroendoskopi (CLM) for ikke-invasivt å studere den romlige-temporale fordelingen av liposomer i øyet etter subkonjunktiv injeksjon.
Subkonjunktival injeksjon er en attraktiv rute for å administrere okulære legemidler på grunn av enkel trans-scleral tilgang som omgår fremre okulære barrierer, som hornhinnen og konjunktivene. Mens terapeutiske effekter og farmakokinetikk av legemidler ved subkonjunktival injeksjon har blitt beskrevet i noen studier, svært få vurdere okulær distribusjon av narkotika eller narkotika levering systemer (DDS). Sistnevnte er kritisk for optimalisering av intraokulær DDS-design og legemiddelbiotilgjengelighet for å oppnå ønsket okulær lokalisering og virkningsvarighet (f.eks. akutt versus langvarig). Denne studien fastslår bruken av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi (CLM) for å kvalitativt studere okulær fordeling av fluorescerende liposomer i sanntid hos levende mus etter subkonjunktiv injeksjon. Å være designet for in vivo visuell inspeksjon av vev på mikroskopisk nivå, er dette også den første fullstendige beskrivelsen av CLM-avbildningsmetoden for å studere romlig-temporal fordeling av injeksjoner i øyet etter subkonjunktival injeksjon.
Blodklarering, vevsfordeling og målbelegg for legemidler i levende systemer er pilarer for å forstå in vivo narkotika disposisjon. I prekliniske dyremodeller vurderes disse parametrene vanligvis ved hyppig blod- og vevsprøvetaking på bestemte tidspunkter etter legemiddeladministrasjon. Imidlertid er disse prosedyrene generelt invasive, inkluderer ofte ikke-overlevelsesmålinger, og nødvendiggjør store dyrekohorter for statistisk kraft. Det kan være ekstra kostnader og tid påløpt, sammen med etiske bekymringer for overdreven bruk av dyr. Som et resultat blir ikke-invasiv avbildning raskt et integrert skritt i biodistribusjonsstudier. Confocal lasermikroendoskopi (CLM1,2) er velegnet for okulære applikasjoner for ikke-invasivt bilde den romlige-temporale fordelingen av terapeutiske stoffer i øynene til levende dyr med høy følsomhet og høy oppløsning1,3,4.
CLM har potensial til å legge til rette for robust screening av okulære legemiddelleveringssystemer (DDS), som liposomer, før omfattende kvantifisering av DDS og legemiddelbiotilgjengelighet. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i å justere sine fysisk-kjemiske og biofysiske egenskaper5,6,7,8,9,10,11 for å innkapsle et stort utvalg av terapeutisk last og kontrollere vevsstedet for legemiddelfrigjøring og virkningsvarighet. Liposomer har blitt brukt i okulære applikasjoner for levering av store molekyler, som det monoklonale antistoffet bevacizumab12, og små molekyler som ciklosporin13 og ganciclovir14. Legemiddelbelastede liposomer har lengre biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske effekter sammenlignet med ikke-liposomale “frie legemiddel” formuleringer. Imidlertid er narkotikafordeling i okulært vev vanligvis ekstrapolert fra legemiddelkonsentrasjoner i flytende komponenter i øyet (dvs. blod, vandig humor og glasslegemet humor15,16,17). Som den første in vivo skjebnen til den ladde narkotika lasten er definert av egenskapene til nanocarrier selv, CLM avbildning av fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet for å avsløre vev målretting og in situ vev oppholdstider. Videre kan visuelle bevis på levering med CLM styre DDS-re-design, evaluere terapeutiske fordeler ved stoffet, og kanskje til og med forutsi negative biologiske hendelser (f.eks. vevstoksisitet på grunn av uønsket lokalisering av DDS i lengre perioder).
Heri er en trinnvis prosedyre detaljert om hvordan du studerer okulær biodistribusjon av liposomer hos levende mus med et dual-band CLM-system. Dette spesifikke CLM-systemet kan oppdage tofarget fluorescens (med grønne og røde eksitasjonslasere på 488 nm og 660 nm) i sanntid, med en frekvens på 8 bilder/s. Ved å fysisk plassere deteksjonssonden på øyet, demonstrerer protokollen bildeanskaffelse og analyse av grønn-fluorescerende liposomer ved underleverandøradministrasjon hos mus pre-injisert intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) fargestoff. EB-fargestoff bidrar til å visualisere de vaskulære strukturene i den røde fluorescenskanalen. Vi viser representative resultater fra en studie som vurderer 100 nm nøytrale liposomer sammensatt av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfocholine) og dopet med fluoresceinmerket fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glysero-3-fosfoetanolamin) med et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til å fange de grønne fluorescein-taggede liposomene ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral oppløsning ved avgrensning av EB-farget okulære vevsgrenser.
Som vist fra resultatene, gir CLM en enkel og gjennomførbar metode for å avbilde okulær fordeling av liposomer i øyet. Vi har tidligere demonstrert bruken av CLM for å karakterisere lokaliseringen av ulike liposomale formuleringer i museøyet over tid1. For ikke-invasive applikasjoner tillater CLM sanntidsavbildning av den fremre okulære overflaten for innsikt i hvordan liposomer fordeles i øyet fra samme dyr. Dette gjør CLM egnet for pre-screen nanocarrier /DDS før mer omfattende kvantif…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) stipend tildelt (til SV) og delvis av Singapore National Research Foundation Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013 /2 og Singapores helse- og biomedisinske vitenskap (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) gir H18/01/a0/018 administrert av Agency for Science, Teknologi og forskning (A*STAR) (til AMC). Takk til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for å legge til rette for logistikk og gjennomføring av studier og opplæring på utstyr. Spesiell takk til Ms. Wisna Novera for hennes redaksjonelle hjelp.
0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
Isoflurane | Piramal, USA | ||
Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |