Summary

Spatio-Temporal In Vivo Imaging av okulære legemiddelleveringssystemer ved hjelp av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi

Published: September 27, 2021
doi:

Summary

Vi presenterer en protokoll for bruk av fiberoptisk konfokal lasermikroendoskopi (CLM) for ikke-invasivt å studere den romlige-temporale fordelingen av liposomer i øyet etter subkonjunktiv injeksjon.

Abstract

Subkonjunktival injeksjon er en attraktiv rute for å administrere okulære legemidler på grunn av enkel trans-scleral tilgang som omgår fremre okulære barrierer, som hornhinnen og konjunktivene. Mens terapeutiske effekter og farmakokinetikk av legemidler ved subkonjunktival injeksjon har blitt beskrevet i noen studier, svært få vurdere okulær distribusjon av narkotika eller narkotika levering systemer (DDS). Sistnevnte er kritisk for optimalisering av intraokulær DDS-design og legemiddelbiotilgjengelighet for å oppnå ønsket okulær lokalisering og virkningsvarighet (f.eks. akutt versus langvarig). Denne studien fastslår bruken av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi (CLM) for å kvalitativt studere okulær fordeling av fluorescerende liposomer i sanntid hos levende mus etter subkonjunktiv injeksjon. Å være designet for in vivo visuell inspeksjon av vev på mikroskopisk nivå, er dette også den første fullstendige beskrivelsen av CLM-avbildningsmetoden for å studere romlig-temporal fordeling av injeksjoner i øyet etter subkonjunktival injeksjon.

Introduction

Blodklarering, vevsfordeling og målbelegg for legemidler i levende systemer er pilarer for å forstå in vivo narkotika disposisjon. I prekliniske dyremodeller vurderes disse parametrene vanligvis ved hyppig blod- og vevsprøvetaking på bestemte tidspunkter etter legemiddeladministrasjon. Imidlertid er disse prosedyrene generelt invasive, inkluderer ofte ikke-overlevelsesmålinger, og nødvendiggjør store dyrekohorter for statistisk kraft. Det kan være ekstra kostnader og tid påløpt, sammen med etiske bekymringer for overdreven bruk av dyr. Som et resultat blir ikke-invasiv avbildning raskt et integrert skritt i biodistribusjonsstudier. Confocal lasermikroendoskopi (CLM1,2) er velegnet for okulære applikasjoner for ikke-invasivt bilde den romlige-temporale fordelingen av terapeutiske stoffer i øynene til levende dyr med høy følsomhet og høy oppløsning1,3,4.

CLM har potensial til å legge til rette for robust screening av okulære legemiddelleveringssystemer (DDS), som liposomer, før omfattende kvantifisering av DDS og legemiddelbiotilgjengelighet. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i å justere sine fysisk-kjemiske og biofysiske egenskaper5,6,7,8,9,10,11 for å innkapsle et stort utvalg av terapeutisk last og kontrollere vevsstedet for legemiddelfrigjøring og virkningsvarighet. Liposomer har blitt brukt i okulære applikasjoner for levering av store molekyler, som det monoklonale antistoffet bevacizumab12, og små molekyler som ciklosporin13 og ganciclovir14. Legemiddelbelastede liposomer har lengre biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske effekter sammenlignet med ikke-liposomale “frie legemiddel” formuleringer. Imidlertid er narkotikafordeling i okulært vev vanligvis ekstrapolert fra legemiddelkonsentrasjoner i flytende komponenter i øyet (dvs. blod, vandig humor og glasslegemet humor15,16,17). Som den første in vivo skjebnen til den ladde narkotika lasten er definert av egenskapene til nanocarrier selv, CLM avbildning av fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet for å avsløre vev målretting og in situ vev oppholdstider. Videre kan visuelle bevis på levering med CLM styre DDS-re-design, evaluere terapeutiske fordeler ved stoffet, og kanskje til og med forutsi negative biologiske hendelser (f.eks. vevstoksisitet på grunn av uønsket lokalisering av DDS i lengre perioder).

Heri er en trinnvis prosedyre detaljert om hvordan du studerer okulær biodistribusjon av liposomer hos levende mus med et dual-band CLM-system. Dette spesifikke CLM-systemet kan oppdage tofarget fluorescens (med grønne og røde eksitasjonslasere på 488 nm og 660 nm) i sanntid, med en frekvens på 8 bilder/s. Ved å fysisk plassere deteksjonssonden på øyet, demonstrerer protokollen bildeanskaffelse og analyse av grønn-fluorescerende liposomer ved underleverandøradministrasjon hos mus pre-injisert intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) fargestoff. EB-fargestoff bidrar til å visualisere de vaskulære strukturene i den røde fluorescenskanalen. Vi viser representative resultater fra en studie som vurderer 100 nm nøytrale liposomer sammensatt av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfocholine) og dopet med fluoresceinmerket fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glysero-3-fosfoetanolamin) med et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til å fange de grønne fluorescein-taggede liposomene ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral oppløsning ved avgrensning av EB-farget okulære vevsgrenser.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SingHealth (Singapore). Kvinnelige C57BL/6 J-mus (6-8 uker gamle; 18-20 g) ble hentet fra InVivos, Singapore, og ligger i en temperatur og lyskontrollert vivarium av Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr ble behandlet i henhold til retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. MERK: Et flytskjema som fre…

Representative Results

Protokollen demonstrerer nytten av CLM for å vurdere den romlige-temporale okulære fordelingen av grønne fluorescerende liposomer administrert gjennom subkonjunktival injeksjon. For å benytte seg av den doble fargekapasiteten (488 nm og 660 nm eksitasjonsbølgelengder) av CLM-systemet, ble 100 nm nøytrale POPC-liposomer som skulle injiseres dopet med 5% Fl-DHPE (komposisjons- og karakteriseringsdata vises i figur 1B), og EB ble injisert IV for å identifisere landemerker i øyet. Tilste…

Discussion

Som vist fra resultatene, gir CLM en enkel og gjennomførbar metode for å avbilde okulær fordeling av liposomer i øyet. Vi har tidligere demonstrert bruken av CLM for å karakterisere lokaliseringen av ulike liposomale formuleringer i museøyet over tid1. For ikke-invasive applikasjoner tillater CLM sanntidsavbildning av den fremre okulære overflaten for innsikt i hvordan liposomer fordeles i øyet fra samme dyr. Dette gjør CLM egnet for pre-screen nanocarrier /DDS før mer omfattende kvantif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) stipend tildelt (til SV) og delvis av Singapore National Research Foundation Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013 /2 og Singapores helse- og biomedisinske vitenskap (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) gir H18/01/a0/018 administrert av Agency for Science, Teknologi og forskning (A*STAR) (til AMC). Takk til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for å legge til rette for logistikk og gjennomføring av studier og opplæring på utstyr. Spesiell takk til Ms. Wisna Novera for hennes redaksjonelle hjelp.

Materials

0.08 µm polycarbonate filter Whatman, USA 110604
0.22 µm syringe filter Fisherbrand, Ireland 09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe Hamilton, USA 65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti, USA 850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) Hamilton, USA 7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) WPI, USA ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) Mauna Kea Technologies, France Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform Sigma Aldrich, USA 472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar WPI, USA 500233 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue Sigma Aldrich, USA E2129
Fusidic acid eye drop LEO Pharma, Denmark
ImageJ National Institutes of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical, UK
Methanol Sigma Aldrich, USA 179337
Mini Extruder Avanti, USA 610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) Invitrogen, USA F362
Phosphate Buffered Saline Gibco, USA 10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand Olympus, Tokyo, Japan SZ51 & SZ2-STU3

References

  1. Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
  2. Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
  3. Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
  4. Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
  5. Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
  6. Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
  7. Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
  8. Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
  9. Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
  10. Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
  11. Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
  12. Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
  13. Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
  14. Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
  15. Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
  16. Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
  17. Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
  18. Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
  19. Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
  20. Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
  21. Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
  22. Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
  23. Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
  24. Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).

Play Video

Cite This Article
Chaw, S. Y., Wong, T. T. L., Venkatraman, S., Chacko, A. Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy. J. Vis. Exp. (175), e62685, doi:10.3791/62685 (2021).

View Video