Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

Hier rapporteren we een methode van 3D bioprinting van muriene corticale astrocyten voor het biofabriceren van neurale weefsels om de functionaliteit van astrocyten in het centrale zenuwstelsel en de mechanismen met betrekking tot gliacellen bij neurologische ziekten en behandelingen te bestuderen.

Abstract

Astrocyten zijn gliacellen met een essentiële rol in het centrale zenuwstelsel (CZS), inclusief neuronale ondersteuning en functionaliteit. Deze cellen reageren ook op neurale verwondingen en werken om het weefsel te beschermen tegen degeneratieve gebeurtenissen. In vitro studies van de functionaliteit van astrocyten zijn belangrijk om de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke gebeurtenissen op te helderen en bij te dragen aan de ontwikkeling van therapieën voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Dit protocol beschrijft een methode om een neuraalachtige weefselstructuur rijk aan astrocyten te biofabriceren door astrocyten-beladen bioink 3D-bioprinting. Een op extrusie gebaseerde 3D-bioprinter werd in dit werk gebruikt en astrocyten werden geëxtraheerd uit de hersencorticoces van C57Bl / 6 muizenpups. De bioink werd bereid door corticale astrocyten van maximaal passage 3 te mengen tot een biomateriaaloplossing bestaande uit gelatine, gelatine-methacryloyl (GelMA) en fibrinogeen, aangevuld met laminine, die optimale bioprintingcondities bood. De 3D-bioprintomstandigheden minimaliseerden celstress en droegen bij aan de hoge levensvatbaarheid van de astrocyten tijdens het proces, waarbij 74,08% ± 1,33% van de cellen direct na bioprinting levensvatbaar waren. Na 1 week incubatie nam de levensvatbaarheid van astrocyten aanzienlijk toe tot 83,54% ± 3,00%, wat aangeeft dat de 3D-constructie een geschikte micro-omgeving voor celgroei vertegenwoordigt. De samenstelling van het biomateriaal maakte celaanhechting mogelijk en stimuleerde astrocytisch gedrag, waarbij cellen de specifieke astrocytenmarker marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) tot expressie brengen en typische astrocytische morfologie bezitten. Dit reproduceerbare protocol biedt een waardevolle methode om 3D-neuraalachtig weefsel dat rijk is aan astrocyten te biofabriceren dat lijkt op de inheemse micro-omgeving van cellen, nuttig voor onderzoekers die de functionaliteit van astrocyten en hun relatie tot de mechanismen die betrokken zijn bij neurologische ziekten willen begrijpen.

Introduction

Astrocyten zijn het meest voorkomende celtype in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een sleutelrol in de homeostase van de hersenen. Naast blijvende neuronale ondersteuning, zijn astrocyten verantwoordelijk voor het moduleren van de opname van neurotransmitters, het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het reguleren van neuronale synaptogenese1,2. Astrocyten hebben ook een essentiële rol bij CNS-ontsteking, reagerend op verwondingen aan de hersenen in een proces dat leidt tot astrocitaire reactiviteit of reactieve astrogliose3,4,het vormen van een gliaal litteken dat een gezonde weefselexpositie aan degeneratieve middelen voorkomt5. Deze gebeurtenis resulteert in veranderingen in de genexpressie, morfologie en functie van astrocyten6,7. Daarom zijn studies met betrekking tot de functionaliteit van astrocyten nuttig voor de ontwikkeling van therapieën om neurologische aandoeningen te behandelen.

In vitro modellen zijn cruciaal voor het bestuderen van mechanismen die verband houden met neurologische verwondingen, en hoewel succesvolle isolatie en tweedimensionale (2D) cultuur van corticale astrocyten zijn vastgesteld8, slaagt dit model er niet in een realistische omgeving te bieden die het gedrag van inheemse cellen nabootst en de complexiteit van de hersenen reproduceert9 . In 2D-toestand beïnvloeden de slechte mechanische en biochemische ondersteuning, lage cel-cel- en celmatrixinteracties en celafvlakking die leidt tot de afwezigheid van basaal-apicale polariteit, de celsignaleringsdynamiek en experimentele uitkomsten die leiden tot veranderde celmorfologie en genexpressie, die de respons op behandelingen in gevaar brengen10. Daarom is het cruciaal om alternatieven te ontwikkelen die een meer realistische neurale omgeving bieden, met als doel de resultaten naar de kliniek te vertalen.

Driedimensionale (3D) celcultuur vertegenwoordigt een geavanceerder model dat samenvat met verhoogde getrouwheidskenmerken van organen en weefsels, waaronder het CZS11. Met betrekking tot gliacultuur dragen 3D-modellen bij aan het behoud van astrocytenmorfologie, cel basaal-apicale polariteit en celsignalering12,13. De 3D-bioprinttechnologie kwam naar voren als een krachtig hulpmiddel om 3D-levende weefsels op een gecontroleerde manier te biofabriceren door cellen en biomaterialen te gebruiken om de structuur en eigenschappen van inheemse weefsels na te bootsen. Het gebruik van deze technologie heeft geleid tot een aanzienlijke verbetering van de voorspelling van de resultaten en heeft bijgedragen aan regeneratieve geneeskunde toegepast op het CZS14,15,16.

Het hier beschreven protocol beschrijft de isolatie en cultuur van corticale astrocyten. Het protocol beschrijft ook een reproduceerbare methode om astrocyten ingebed in gelatine / gelatine methacryloyl (GelMA) / fibrinogeen, aangevuld met laminine, te bioprinten. In dit werk werd een op extrusie gebaseerde bioprinter gebruikt om de biomateriaalsamenstelling met corticale astrocyten te printen met een dichtheid van 1 x 106 cellen / ml. Bioprinting schuifspanning werd geminimaliseerd door de printsnelheid te regelen en astrocyten vertoonden een hoge levensvatbaarheid na het proces. Biogeprinte constructies werden gedurende 1 week gekweekt en astrocyten konden zich verspreiden, hechten en overleven in de hydrogel, waarbij de astrocytische morfologie werd gehandhaafd en een specifiek marker glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) werd tot expressiegebracht 4.

Deze procedure is compatibel met zuigeraangedreven bioprinters op basis van extrusie en kan worden gebruikt om astrocyten uit verschillende bronnen te bioprinten. Het hier voorgestelde 3D-bioprintmodel is geschikt voor een breed scala aan neurale engineeringtoepassingen, zoals studies van de mechanismen die betrokken zijn bij astrocytenfunctionaliteit in gezonde weefsels en het begrijpen van de progressie van neurologische pathologieën en de ontwikkeling van behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren volgden internationale richtlijnen voor diergebruik in onderzoek (http://www.iclas.org) en werden goedgekeurd door de Commissie ethiek in onderzoek van Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Muizen hersendissectie

  1. Breng 10 ml koude Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) over in een kweekschaal van 100 mm en 1 ml in een microbuis van 1,5 ml. Bereid één microbuisje per dier voor.
    OPMERKING: Zowel de kweekschaal als de microtube moeten op ijs worden gehouden.
  2. Bereid astrocyten kweekmedium met DMEM F12 + 10% Foetaal Runderserum (FBS), 2% glutamine en 1% Penicilline-Streptomycine (P / S). Steriliseer het medium door te filteren met een filter van 0,2 μm.
  3. Euthanaseer C57Bl/6 muizenjongen (postnatale dag 1) door onthoofding met een scherpe operatieschaar. Trek met een tang aan de huid en leg de schedel bloot. Zorg ervoor dat zowel de schaar als de tang gesteriliseerd zijn met 70% ethanol.
  4. Knip de schedel van het foramen magnum tot de bovenkant van het hoofd langs het sagittale vlak met behulp van een scherpe gebogen puntschaar.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het encefalische weefsel niet beschadigd is.
  5. Gebruik een spatel die eerder is gesteriliseerd met ethanol 70%, til de hersenen uit de schedelholte en plaats deze in de kweekschaal met 10 ml koude HBSS.
  6. Plaats de kweekschaal met de hersenen onder de stereomicroscoop en verwijder met behulp van twee stompe tangen de hersenvliezen uit de hersenen(figuur 1).
  7. Scheid de cortices van de rest van de hersenen door ze voorzichtig weg te rollen van de mediane lijn van de hersenen met behulp van een spatel.
  8. Verzamel beide cortices en breng ze onmiddellijk over naar dezelfde microbuis met 1 ml koude HBSS.

2. Astrocyten isolatie en cultuur

  1. Knip onder de laminaire stroom het corticale weefsel in kleine stukjes met een gebogen microschaar en was ze met 1 ml HBSS door 3x op en neer te pipetteren. Wacht tot het weefsel tot rust is. Verwijder HBSS en voeg nieuwe HBSS toe, waarbij u het proces nog twee keer herhaalt.
  2. Verwijder HBSS en incubeer het weefsel met 1 ml 0,05% trypsine bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Alleen trypsinevertering is op dit moment voldoende.
  3. Dissociëren het weefsel mechanisch door 15x voorzichtig op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: De volledige dissociatie van het weefsel wordt waargenomen door de toename van de troebelheid van de suspensie en door de afwezigheid van grote fragmenten weefsel in de suspensie.
  4. Breng de oplossing over in een conische buis van 15 ml, neutraliseer de trypsineactiviteit door een gelijk volume FBS toe te voegen en filter de oplossing in een celzeeffilter van 0,4 μm om niet-gedissocieerde fragmenten te verwijderen.
  5. Was het filter met 1 ml astrocytenmedium, verzamel de celsuspensie die door de zeef is gegaan en centrifugeer het gedurende 5 minuten bij 200 x g en 25 °C. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en suspensie de pellet in 1 ml astrocytencultuurmedium.
  6. Breng de celsuspensie over in een T25-kweekkolf, maak het volume van het medium aan tot 3,5 ml en incubeer de cellen bij 37 °C en 5 % CO2.
  7. Zorg ervoor dat de cellen na 24 uur aanhangen. Vervang vervolgens het medium en vervang het om de 3 dagen.
  8. Verwijder na 7 dagen microglia en oligodendrocyten uit de kweek door de cellen te wassen met 2 ml 1x PBS.
  9. Vervang de PBS-oplossing door het astrocytencultuurmedium en laat de kweekkolf 's nachts bij 180 tpm in een orbitale shaker staan.
    OPMERKING: Astrocyten vormen een confluente monolaag in ongeveer 10-12 dagen cultuur.

3. Synthese van gelatine methacryloyl (GelMA)

  1. Weeg 10 g gelatine uit varkenshuid en los op in 100 ml PBS door de oplossing op een verwarmingsplaat bij 240 tpm en 50 °C te laten roeren totdat deze volledig is opgelost.
  2. Voeg onder een motorkap 2 ml methacrylzuuranhydride (MA) toe voor een lage mate van functionalisatie en laat de gelatine-emulsie gedurende 2 uur roeren bij 240 tpm en 50 °C.
    LET OP: MA gevarenaanduiding: H302 + H332 (schadelijk bij inslikken of inademen), H311 (giftig bij contact met de huid), 314 (veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging), 315 (veroorzaakt huidirritatie), H317 (kan een allergische huidreactie veroorzaken), H318 (veroorzaakt ernstig oogletsel), 331 (giftig bij inademing), H332 (schadelijk bij inademing), H335 (kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken). Richtlijnen voor hantering: P261 (vermijd het inademen van stof/rook/gas/nevel/dampen/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (INDIEN IN DE OGEN: Spoel voorzichtig met water gedurende enkele minuten. Verwijder contactlenzen, indien aanwezig en gemakkelijk te doen. Ga door met spoelen. Bel onmiddellijk een ANTIGIFCENTRUM/arts), P301 + P312 + P330 (INDIEN INGESLIKT: Bel een ANTIGIFCENTRUM/arts als u zich onwel voelt. Mond spoelen).
    OPMERKING: Voeg MA heel langzaam toe, druppel voor druppel.
  3. Verdun de gelatine-MA-oplossing in 100 ml voorverwarmd PBS (50 °C) tot 200 ml eindvolume en laat de oplossing gedurende 10 minuten roeren bij 240 tpm en 50 °C.
  4. Snijd ~20 cm dialysemembraan (moleculaire cutoff 12-14 kDa) en week het in gedeoniseerd water tot het zacht is.
    OPMERKING: Vul de membranen met gedeioniseerd water om ervoor te zorgen dat er geen gaten of defecten zijn.
  5. Breng met behulp van een trechter de gelatine-MA-oplossing over op de membranen.
    OPMERKING: Sluit beide zijden en laat extra ruimte binnenin om het mengsel toe te staan.
  6. Plaats de membranen met de gelatine-MA-oplossing in een container met 2 L gedestilleerd water voor dialyse en laat ze gedurende 5 dagen (500 rpm) bij 40 °C roeren.
    OPMERKING: Dek de container af om waterverdamping te voorkomen.
  7. Ververs het gedestilleerde water twee keer per dag. Draai de membranen elke keer ondersteboven voor homogenisatie.
  8. Meng op de vijfde dag 200 ml voorverwarmd ultrapijnwater (40 °C) met de gedialyseerde gelatine-MA en laat dit gedurende 15 minuten roeren bij 40 °C.
  9. Breng de gelatine-MA-oplossing over in conische buisjes van 50 ml tot 25 ml en laat de buisjes gedurende 2 dagen op -80 °C blijven.
    OPMERKING: Bewaar de buizen horizontaal om lyofilisatie te vergemakkelijken.
  10. Lyofiliseer de bevroren oplossingen gedurende 3-5 dagen en bewaar de gelma beschermd tegen vocht.

4. Bioink bereiding

OPMERKING: Om 1 ml bioink te verkrijgen, wordt aanbevolen om ten minste 3 ml biomateriaaloplossing te fabriceren, omdat er verliezen kunnen zijn tijdens filtratie.

  1. Bereiding van fibrinogeenoplossing
    1. Bereid een zoutoplossing (NaCl 0,9%) in gedeïoniseerd water en los 10 mg fibrinogeen uit runderplasma op in 1 ml van de zoutoplossing om een concentratie van 10 mg/ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Aangezien fibrinogeen adsorbeert aan glas, gebruik geen glazen kolven om de fibrinogeenoplossing te bereiden.
    2. Laat de oplossing onder roeren bij 37 °C totdat fibrinogeen volledig is opgelost.
      OPMERKING: Gebruik voor het oplossen van fibrinogeen een roterend systeem dat in een oven bij 37 °C is geplaatst. Magnetisch roeren (180 rpm) van fibrinogeen op een hete plaat bij 37 °C is ook geschikt. Onder deze voorwaarde duurt het ongeveer 40 minuten om 10 mg / ml fibrinogeen op te lossen.
  2. Bereiding van gelatine/GelMA-oplossing
    1. Weeg 0,12 g gelatine af en voeg deze toe aan 1,9 ml voorverwarmd PBS (40 °C) om een eindconcentratie van 4% (w/v) gelatine te verkrijgen. Vortex om het oplossen te vergemakkelijken.
    2. Houd de emulsie op 40 °C totdat deze volledig is opgelost.
    3. Weeg 0,06 g gelMA-gelma af en breng over in de gelatineoplossing om een eindconcentratie van 2% (w/v) GelMA te verkrijgen. Vortex om het oplossen te vergemakkelijken.
    4. Houd de oplossing op 40 °C totdat deze volledig is opgelost.
  3. Bereiding van met astrocyten beladen gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink
    1. Pipetteer 0,9 ml van de 10 mg/ml fibrinogeenoplossing en breng over naar de gelatine/GelMA-oplossing om een eindconcentratie van 3 mg/ml fibrinogeen te verkrijgen.
    2. Weeg 0,015 g photoinitiator (PI) af en breng over op de gelatine/GelMA/fibrinogeenoplossing om een eindconcentratie van 0,5% (w/v) PI te verkrijgen. Meng de oplossing door de buis op en neer te draaien en houd deze op 40 °C beschermd tegen licht om PI-degradatie te voorkomen.
      LET OP: Stockeer de bioink op 4 °C voor maximaal 24 uur.
    3. Filter de oplossing onder de laminaire stroom met behulp van een filter van 0,2 μm in een steriele conische buis van 15 ml.
      OPMERKING: De biomateriaaloplossing moet 37-40 °C hebben om filtratie mogelijk te maken.
    4. Breng 980 μL van de biomateriaaloplossing over in een conische buis van 15 ml.
    5. Verdun laminine in zoutoplossing om een stamoplossing van 100 μg/ml te verkrijgen.
    6. Pipetteer 20 μL laminine en breng over naar de buis met de bioink om een eindconcentratie van 2 μg/ml laminine te verkrijgen.
    7. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en bubbels te vermijden. Als er bellen blijven bestaan, centrifugeer dan de conische buis bij 200 x g gedurende 2 minuten. Houd de bioink op 37 °C totdat deze gemengd is met de cellen.
    8. Trypsinize primaire astrocyten met 0,05% trypsine gedurende 5 min.
      OPMERKING: Gebruik astrocyten uit passages 1 tot en met 3.
    9. Neutraliseer de trypsine-activiteit met FBS in een verhouding van 1:1 en breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 5 minuten.
    10. Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een andere conische buis. Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 5 minuten.
    11. Verwijder het supernatant en laat een klein volume (~ 200 μL) achter om de celkorrel op te hangen, door zachtjes op de bodem van de conische buis te tikken.
    12. Breng 1 ml gelatine/gelMA/fibrinogeenoplossing over in de buis die de cellen bevat en pipetteer voorzichtig op en neer om te homogeniseren, tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml.

5. Bereiding van de crosslinker-oplossing

  1. Trombine reconstitutie
    1. Bereid een stamoplossing van trombine 100 E/ml in steriel gedeïoniseerd water met 0,1% (w/v) runderserumalbumine (BSA) in een conische buis van 15 ml. Voorraad in microbuisjes bij -20 °C.
      OPMERKING: Als trombine adsorbeert aan glas, gebruik geen glazen kolven om de stamoplossing te bereiden of de aliquots op te slaan.
  2. Bereiding van trombine-CaCl2-oplossing
    1. Pipetteer 100 μL trombine-stamoplossing en breng over naar een conische buis van 50 ml met 8,9 ml steriel gedeïoniseerd water om een eindconcentratie van 1 U/ml trombine te verkrijgen.
    2. Bereid een CaCl2-oplossing van 10% (met v) in gedeïoniseerd water en steriliseer met behulp van een filter van 0,2 μm.
    3. Breng 1,1 ml van de 10% CaCl2-oplossing over op de conische buis die trombine bevat, om een eindverhouding van 1:9 (CaCl2 tot trombine) te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereid de crosslinker-oplossing voor op het volume dat in het experiment moet worden gebruikt, waarbij opslag wordt vermeden.

6. Bioprinting astrocyten-beladen bioink met behulp van een extrusie-gebaseerde bioprinter

  1. Ontwerp van het neurale weefsel
    1. Met behulp van de G-code: construeer een raster van 6 x 6 mm (vierkante vorm) met 1 mm afstand tussen elke biobedrukte lijn op de X- en Y-as, en 6 lagen op de Z-as (0,2 mm tussen elke lijn); stel de extrusie (E) in op 0,01 mm en verhoog 0,001 mm bij elke nieuwe laag van de Z-as; en stel de afdruksnelheid (F) in op 400 mm/min(aanvullende informatie).
  2. Bioprinter opgezet
    1. Stel het apparaat gedurende 15 minuten bloot aan UV-licht en veeg het vervolgens af met ethanol 70%.
    2. Schakel de bioprinter in met de aan/uit-schakelaar. Sluit het apparaat aan op de computer via een USB-kabel. Open de besturingssoftware om deze aan te sluiten op de bioprinter en laad het bestandsontwerp.
  3. Bereiding van de bioprintspuit
    1. Breng de met astrocyten beladen gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink over in een plastic spuit van 5 ml met behulp van een pipet van 1.000 μL.
      OPMERKING: Breng langzaam over om bubbelvorming te voorkomen.
    2. Sluit een steriele 22 G stompe naald aan op de spuit.
      OPMERKING: Laat de spuit gedurende 2 minuten op 4 °C staan.
    3. Sluit de spuit aan op de bioprinterprintkop en spoel de bioink handmatig door om de resterende bubbels te verwijderen.
  4. Bioprinten
    OPMERKING: De bioprinting werd uitgevoerd buiten de laminaire kap.
    1. Plaats een kweekschaal van 35 mm op de bioprintertafel en plaats de naald op 0,1 mm afstand van het oppervlak van de kweekschaal om beweging van de naald mogelijk te maken.
      OPMERKING: Gebruik één kweekschaal van 35 mm voor elke bioprinting.
    2. Druk op de knop Afdrukken.
    3. Zodra de bioprint voorbij is, zorg er dan voor dat de spuit van de schaal af beweegt. Sluit vervolgens de cultuurschotel en bereid je voor op het crosslinking-proces.
      OPMERKING: Het bioprinten van één construct duurt ongeveer 1 min en 10 s.
  5. Crosslinking van het bioprint construct en de cultuur
    1. Plaats de kweekschaal onder UV-licht op 2 mW/cm2 voor 2 x 60 s (op en neer) voor GelMA crosslinking.
    2. Breng onder de laminaire stroming de biobedrukte constructie over op een 24-wells plaat met behulp van een steriele spatel.
    3. Voeg 500 μL trombine/CaCl2-oplossing toe en laat 30 minuten staan om fibrineverknoping mogelijk te maken.
    4. Verwijder de crosslinking-oplossing en was de constructie met 2 ml PBS 1x. Vervang vervolgens de PBS door 1 ml astrocytenkweekmedium en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium om de 3 dagen.

7. Beoordeling van de levensvatbaarheid van astrocyten

  1. Levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten
    1. Breng de biobedrukte constructie met behulp van een spatel over op een kweekschaal van 35 mm.
    2. Was de constructie met 1 ml 1x PBS.
    3. Deponeer 100 μL van het Live/Dead-reagens over het construct en houd het gedurende 30 minuten op 37 °C, zodat het beschermd blijft tegen licht.
    4. Verwijder het Live/Dead-reagens en was de constructie met 1 ml 1x PBS.
    5. Breng het monster over naar een confocale schaal met behulp van een spatel en observeer de cellen in het construct onder een confocale microscoop met behulp van 488 en 570 nm excitatie voor het verkrijgen van beelden.
      OPMERKING: Gebruik een vergroting van 10x voor een algehele visualisatie van de cellen in het construct.
    6. Zorg ervoor dat het monster plat zit. Plaats indien nodig een afdeklip over het monster om de vlakheid te vergroten.
      OPMERKING: Zorg er tijdens het afbeelden voor dat de confocale schaal goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
    7. Bereken het aantal levensvatbare (groene) en dode (rode) met behulp van een rekensoftware.
  2. Levensvatbaarheid van 2D astrocyten cultuur
    1. Zaad 0,5 x 106 astrocyten (passage 1-3) in een confocale schaal van 35 mm, voeg astrocyten medium toe en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Wanneer cellen samenvloeien, verwijdert u het kweekmedium en wast u het met 1 ml 1x PBS.
    3. Deponeer 200 μL van het Live/Dead-reagens en houd de schaal gedurende 30 minuten op 37 °C, beschermd tegen licht.
    4. Verwijder het Live/Dead-reagens en was de cellen met 1 ml 1x PBS.
    5. Breng de schotel naar een confocale microscoop in combinatie met een digitale camera en gebruik 488 en 570 nm excitatie voor beeldverkrijging.
    6. Bereken het aantal levensvatbare (groene) en dode (rode) met behulp van een rekensoftware.

8. Immunostaining van astrocyten

  1. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) kleuring van 3D bioprinted astrocyten
    OPMERKING: Om de aanwezigheid van andere celmarkers te onderzoeken, moet u het primaire antilichaam dienovereenkomstig wijzigen.
    1. Haal het medium uit de put en was de constructie met 1 ml 3x PBS.
    2. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe aan de put totdat de constructie volledig bedekt is en laat het 2 uur bij 4 °C staan.
    3. Verwijder de PFA en was de constructie met 1 ml 3x PBS.
      OPMERKING: Deze procedure kan enkele maanden worden gepauzeerd als deze bij 4 °C in PBS wordt bewaard. Zorg ervoor dat de putplaat is afgedicht om PBS-verdamping te voorkomen.
    4. Behandel het monster met glycine 0,1 mol/l gedurende 5 minuten.
    5. Was met 1 ml 1x PBS gedurende 5 minuten.
    6. Permeabiliseer het monster met PBS dat 0,1% Triton X-100 en 10% FBS bevat gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie.
    7. Incubeer het construct met kippenanti-GFAP (primaire antilichaamverdunning 1:500) bij 4 °C gedurende de nacht.
    8. Aspiraleer het primaire antilichaam en was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, 3 keer.
      OPMERKING: Primaire antilichamen kunnen meerdere keren worden hergebruikt wanneer ze bij 4 °C worden bewaard.
    9. Incubeer het monster met Alexa fluor 488-geconjugeerde anti-kip (secundaire antilichaamverdunning 1:500) en 1 μg /ml DAPI gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie.
      OPMERKING: Houd het monster beschermd tegen licht.
    10. Was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, 3 keer.
    11. Breng de constructie over in een confocale schaal van 35 mm.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gerecht goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
  2. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) kleuring van 2D astrocyten cultuur
    1. Zaad 0,5 x 106 astrocyten (passage 1-3) in een confocale schaal van 35 mm, voeg astrocyten medium toe en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Wanneer de cellen samenvloeien, verwijdert u het kweekmedium en wast u ze met 1 ml 1x PBS.
    3. Herhaal stap 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrocyten cytoskelet kleuring
    1. Herhaal stap 8.1.1-8.1.6.
    2. Voeg 200 μL van 50 μg/ml fluorescerend-geconjugeerde falloïdine-oplossing toe in PBS en 1 μg/ml DAPI over het construct.
    3. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie, waardoor het monster tegen licht beschermd blijft.
    4. Was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 min 3 keer en breng het construct over in een confocale schaal met behulp van een spatel.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gerecht goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.

9. Confocale beeldvorming

  1. Breng de schotels naar een confocale microscoop in combinatie met een digitale camera voor beeldvorming (359, 488 en 570 nm excitatie).
  2. Gebruik een vergroting van 10x voor een algehele visualisatie en 40 of 63x voor ingezoomde afbeeldingen van cellen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het monster plat zit. Plaats indien nodig een afdeklip over het monster om de vlakheid te vergroten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit werk was gericht op het ontwikkelen van een neuraalachtig weefsel met behulp van de 3D-bioprinttechnologie om laag voor laag primaire astrocyten-beladen gelatine / GelMA / fibrinogeen bioink af te zetten. Astrocyten werden geëxtraheerd en geïsoleerd uit de hersenschors van muizenjongen (figuur 1), toegevoegd aan een biomateriaalsamenstelling, waardoor de biofabricage van een levend 3D-construct mogelijk werd.

Het computer-aided-design (CAD) is ontwikkeld met behulp van de G-code(Supplemental file)als een onderling verbonden frame van vierkante vorm (0,6 x 0,6 mm), met poriën van 1 mm, met als doel de diffusie van voedingsstoffen en zuurstof te vergemakkelijken. Het frame bestond uit 6 lagen die op elkaar werden geplaatst en in elke laag onder een hoek van 90° veranderden(figuur 2A i). De ontworpen structuur bezat ongeveer 5 mm hoog(figuur 2A ii),waardoor weefselmanipulatie mogelijk was. De bioink-samenstelling maakte het ook mogelijk om constructies van verschillende vormen te vervaardigen(figuur 2B).

De bereiding van de bioink bestaande uit gelatine, GelMA en fibrinogeen bestond uit twee crosslinking stappen. Eerst werd GelMA gecrosslinkt onder UV-licht, waarbij inter- en intramoleculaire covalente bindingen worden gevormd, gevolgd door fibrine-crosslinking. In deze stap splitst trombine enzymatisch fibrinogeenketens, wat resulteert in de vorming van fibrinevezels17, een reactie gestabiliseerd door Ca2 + ionen18. Vervolgens vormen GelMA- en fibrinevezels een stabiel interpenetrated polymer network (IPN) aangevuld met laminine, geschikte ondersteuning voor celaanhechting en spread19,20 (figuur 2C).

Voorafgaand aan bioprinting, na 12 dagen isolatie, werden astrocyten gekenmerkt door de aanwezigheid van GFAP, een eiwitbestanddeel van astrocyten intermediaire filamenten4 (Figuur 3A). Vervolgens werden trypsinized astrocyten gemengd met de gelatine / GelMA / fibrinogeenoplossing met een dichtheid van 1 x 106 cellen / ml, waardoor een met astrocyten beladen bioink werd gegenereerd. De bioink werd overgebracht naar een spuit van 5 ml die was aangesloten op een stompe naald van 22 G, die de bioprinter-printkop samenstelde(figuur 3B i). De naald maakte de bioink extrusie mogelijk zonder verstopping en voorkwam hoge schuifspanning voor de cellen.

Vanwege de visco-elastische eigenschappen van gelatine, die zich gedraagt als een vloeistof bij hogere temperaturen en als een gel bij lagere temperaturen21, behield het biogeprinte construct vormgetrouwheid (Figuur 3B ii). Na het bioprinten van twee opeenvolgende lagen bioink werd de vorming van een goed gedefinieerde structuur waargenomen (figuur 3C), met cellen ingesloten in het biomateriaal.

Na bioprinting- en crosslinkingprocessen werd het construct geïncubeerd met astrocytenmedium en na 1 dag bioprinten presenteerden de meeste cellen nog steeds een ronde morfologie (Figuur 3D). Biobedrukte steigers behielden de integriteit na 7 dagen incubatie, en hoewel sommige ronde cellen werden waargenomen, verspreidde een groot aantal astrocyten zich door het construct, met astrocytische morfologie en interconnectie(Figuur 3E).

Omdat de parameters van bioprinting, zoals snelheid, de levensvatbaarheid van cellen direct konden beïnvloeden, werden verschillende bioprintsnelheden (400, 600 en 800 mm / min) getest en astrocytenoverleving geëvalueerd met behulp van de Live / Dead-test met calceïne-AM (levende cellen, groene fluorescentie) en ethidium homodimer-III (EthD-II) (dode cellen, rode fluorescentie). Het percentage levensvatbare cellen werd gekwantificeerd met behulp van computationele software, door het aantal levende en dode cellen te berekenen. De levensvatbaarheid van cellen werd geëvalueerd op tijdstip 0 (direct na bioprinting) en de resultaten toonden aan dat bij de lagere snelheid, 400 mm / min, levensvatbare cellen 74,08% ± 1,33% van de totale cellen vertegenwoordigden, significant hoger dan cellen die respectievelijk 600 en 800 mm / min (60,25% ± 1,93% en 62,94 ± 6,18% waren) (Figuur 4A). Daarom werd in dit werk de snelheid van 400 mm/min gebruikt.

Voorafgaand aan bioprinting werden 2D-gekweekte astrocyten gekarakteriseerd als het percentage levensvatbare cellen en de levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten werd genormaliseerd voor deze aandoening. De resultaten toonden aan dat 2D-cultuur 90,98% ± 0,94% van de levensvatbare cellen presenteerde. De levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten (dag 7) was 83,54% ± 3,00%, wat neerkomt op 0,92 ± 0,03 van de 2D-waarde, wat aanzienlijk hoger was dan die van dag 0 (0,81 ± 0,01) (Figuur 4B). Afbeeldingen van astrocyten bevlekt met het levend/dode reagens zijn weergegeven in figuur 4Cen laten zien dat cellen na bioprinting een ronde morfologie bezaten (Figuur 4C i). Na 1 week incubatie verspreidden astrocyten zich door het construct (Figuur 4C ii), met een duidelijke morfologie van cellen uit 2D-cultuur ( Figuur4C iii).

Biogeprinte astrocyten werden gekleurd om celdichtheid en celmorfologie binnen het construct aan te tonen. Figuur 5A toont een biogeprint construct na 7 dagen incubatie, met een hoge dichtheid van astrocyten gekleurd met falloïdine, een F-actine cytoskeletkleurstof. Hoewel er weinig ronde cellen werden waargenomen, presenteerden astrocyten voornamelijk een sterachtige morfologie. Biogeprinte astrocyten bleken GFAP-positief te zijn wanneer ze na 7 dagen bioprinting werden gekleurd, wat aangeeft dat cellen hun astrocytische fenotype behielden (Figuur 5B i). Figuur 5B ii en 5B iii tonen de Z-gestapelde afbeeldingen van de biogeprinte GFAP+ astrocyten binnen het construct. Deze resultaten geven aan dat de samenstelling van bioink een biocompatibele micro-omgeving bood om de hechting, verspreiding en groei van astrocyten te bevorderen.

Figure 1
Figuur 1: Extractie van hersen- en cortexscheiding voor primaire astrocytencultuur. Primaire astrocyten werden geïsoleerd uit de hersenen van C57Bl/6 muizenjongens (postnatale dag 1). Na het extraheren van de hersenen uit het dier, werden de hersenvliezen onder een microscoop verwijderd en de cortex gescheiden, gevolgd door weefselvertering en astrocytencultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische illustratie van het 3D-bioprintproces. (A) CAD-bestand ontworpen voor het 3D-bioprinten van neuraal weefsel met (i) 2 lagen, bovenaanzicht en (ii) 6 lagen, zijaanzicht, van het construct. (B) Afbeeldingen die het vermogen van de bioink tonen om structuren van verschillende vormen (i) vierkant, (ii) capillair en (iii) ster te printen. (C) Schema van biomaterialen crosslinking na 3D bioprinting tonen, waarbij GelMA wordt gecrosslinkt onder UV-licht gevolgd door fibrine crosslinking in een trombine:Ca2+ bad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: 3D boprinting van astrocyten-beladen gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink. (A) Karakterisering van astrocyten na 12 dagen isolatie en cultuur, gekleurd voor GFAP, groen en DAPI, blauw. (B) (i) Printkop setup en (ii) 3D bioprinted construct direct na bioprinting. (B) Tweelaagse constructie met het biogeprinte frame. Vergroting van 4x. (C) Afbeelding van biogeprinte astrocyten 1 dag na bioprinting, met cellen in een ronde morfologie. DAfbeelding van biogeprinte astrocyten 7 dagen na het bioprintingproces, met cellen met astrocytische morfologie met weinig ronde cellen, wat hun affiniteit met het mimetische weefsel aangeeft. Vergroting van 10x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Beoordeling van de levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten. (A) Levensvatbaarheid van astrocyten bioprint met verschillende snelheden. (B) Levensvatbaarheid van gebioprinte astrocyten op (i) dag 0 (direct na bioprinting) en (ii) na 7 dagen bioprinting, genormaliseerd tot levensvatbaarheid van astrocyten in 2D-cultuur. Statistische analyse door middel van One-Way Anova met Tukey's test, n = 3, *p < 0,05. (C) Fluorescerende beelden van astrocyten gekleurd met Live/Dead reagens. Biogeprinte astrocyten op (i) dag 0 (direct na bioprinting), (ii) dag 7, en (iii) 2D-cultuur van astrocyten. Vergroting van 10x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Karakterisering van 3D biogeprinte astrocyten. Immunofluorescentie van 3D-biogeprinte astrocyten na 7 dagen incubatie gekleurd voor (A) F-actine (falloïdine, rood) en kernen (DAPI, blauw) met vergroting van 10x en 40x en voor (B) GFAP, groen (i) met vergroting van 10x, (ii) Z-gestapeld met de X-Y-Z-as van het biogeprinte construct, en (iii) afbeelding met de X-Z-as van GFAP + astrocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De 3D-bioprinttechnologie is naar voren gekomen als een biofabricageternatief dat de engineering van verfijnde constructies mogelijk maakt die structureel en fysiologisch lijken op inheemse weefsels22, inclusief de hersenen23. De biofabricage van neurale weefsels maakt in vitro inheemse micro-omgevingsmodellering mogelijk, een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die verband houden met de ontwikkeling en behandeling van vele ziekten die het CZS beïnvloeden11. Vanwege de belangrijke rol van gliacellen in neurale functionaliteit, zijn corticale astrocyten in veel studies gebruikt, zoals hersenontwikkeling24,biomoleculen transport25,neurietuitgroei26en in hersenachtige weefselbiofabricage14.

Methoden voor het engineeren van 3D-cultuur van astrocyten werden eerder gerapporteerd, met behulp van verschillende biomaterialen en steigertechnieken27,28,29. Evenzo werd ook een methode voor 3D-bioprinting van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) -afgeleide neurale aggregaten gerapporteerd en toonde het vermogen van deze biogeprinte cellen om in vitrote differentiëren en te rijpen30. Er zijn echter geen meldingen van methoden voor biofabricage van 3D-gerandopte astrocytenconstructen in de literatuur. Vervolgens was dit protocol gericht op het beschrijven van een reproduceerbare methode voor 3D-bioprinting corticale astrocyten.

In dit protocol werden astrocyten geïsoleerd uit de cerebrale cortices van C57Bl/6 muizenjongen, een diermodel dat veel wordt gebruikt in onderzoek31,32, dat kan worden vervangen door astrocyten afgeleid van andere bronnen, zoals HIPSC's en ruggenmerg. Na isolatie, cultuur en subcultuur blijven astrocyten in een proliferatieve toestand tot passage 3, wat het maximale aantal splitsingen is dat wordt aanbevolen vanwege hun intrinsieke beperking van proliferatie8. Er werd geverifieerd dat de proliferatie van astrocyten uit passage 4 beperkt was, omdat het moeilijk was om de gewenste hoeveelheid cellen voor 3D-bioprinting te bereiken.

In de beschreven methode werd een concentratie van 1,0 x 106 cellen/ml biomateriaaloplossing gebruikt als proof of concept om het vermogen van cellen om het bioprintingproces te overleven en hun levensvatbaarheid en intrinsieke eigenschappen tijdens de kweek in de hydrogel te behouden, te evalueren. In het vorige werk werd een 3D-biogeprint neuraalachtig weefsel gebiofabriceerd door astrocyten en neuronen samen te kweken, en om de cellulaire interactie te verhogen, was de astrocytenconcentratie 8,0 x10 6 cellen / ml14. Vervolgens kan de concentratie van cellen worden geoptimaliseerd voor specifieke studies.

Een bioink voor 3D bioprinting is samengesteld uit cellen en een biomateriaal of een combinatie van biomaterialen33. In dit protocol werd een combinatie van gelatine/GelMA/fibrinogeen gebruikt, die gunstig bleek te zijn voor zowel bioprinting als onderhoud van astrocyten in cultuur. De productie van een bioprintbare bioink is een uitdaging bij het gebruik van extrusie-gebaseerde bioprinting techniek. De samenstelling van het biomateriaal moet visco-elastische eigenschappen bezitten die tegelijkertijd de extrusie van de bioink mogelijk maken, met behoud van de 3D-vorm na het printproces34. Bovendien moet het in staat zijn om de levensvatbaarheid van de cel tijdens het proces te behouden, wat afhankelijk van de bioprinting-omstandigheden afschuifstress voor de cellen kan veroorzaken, wat tot de dood leidt35.

De biologische bedrukbaarheid werd verzekerd door gelatine, een biomateriaal dat optimale visco-elastische eigenschappen bezit vanwege zijn sol-gel overgangscapaciteit36. Hierdoor kunnen gelatine-macromoleculen zich herschikken en gedragen als een vloeistof tijdens extrusie en als een gel na bioprinten, met behoud van de 3D-structuur. Bovendien is gelatine als collageenderivaat samengesteld uit herhalingen van glycine-aminozuurpeptide-peptide, die celspecificiteit garanderen21. Intra- en intermoleculaire bindingen van gelatine zijn echter zwak en vanwege de thermoreversibiliteit heeft gelatine geen stabiliteit bij 37 °C, omdat het tijdens de celkweek uit het construct vrijkomt. Daarom werd GelMA een alternatief als een stabiele hydrogel, vanwege de covalente bindingen gevormd na UV-lichtexpositie, met behoud van celspecificiteitseigenschappen19. De fysische eigenschappen van GelMA, zoals porositeit, degradatie en elastische modulus, kunnen worden afgestemd op verschillende tissue engineering-toepassingen19. De stijfheid van GelMA-steigers kan worden gecontroleerd door de methacryloylsubstitutie37te variëren, waardoor een stijfheid kan worden bereikt die vergelijkbaar is met die van het te modelleren weefsel. Dat wil zeggen, door de mate van functionalisatie te verlagen, kan een lagere stijfheid worden bereikt37. Daarom werd, vanwege de zachtheid van het muizenbrein38,39 en het directe effect van extracellulaire matrix (ECM) stijfheid op celgedrag40, in dit protocol een lage mate van gelatine functionalisatie voorgesteld. In de vorige werken werd het vermogen van GelMA-hydrogels om fysieke kenmerken van het CZS na te bootsen, met een hoge geschiktheid voor het kweken van astrocyten, neuronen en neurale stamcellen14,41,42 gerapporteerd.

Naast GelMA is fibrinogeen, een inheems biopolymeer dat fibrinevezels vormt door enzymatische reactie, ook veel gebruikt om neuraalachtig weefsel te biofabriceren, met een hoge specificiteit en een geschikte micro-omgeving voor neurale cellen om zich te hechten en te groeien30,43,44. Andere biomaterialen, zoals alginaat en chitosan, zijn gebruikt om neurale weefsels te bioprinten, gemengd met gelatine, GelMA en / of fibrinogeen, met als doel de bedrukbaarheid en fysieke eigenschappen van de 3D-steigers te verbeteren14,30. In de huidige methode werd een optimale bioprintbaarheid, fysieke stabiliteit en celspecificiteit bereikt met behulp van gelatine, GelMA en fibrinogeen als componenten van de bioink. Om de herkenning van astrocyten aan de micro-omgeving te vergroten, werd laminine - een component van de hersen-ECM - gebruikt om de bioink aan te vullen.

In dit protocol werd gelatine gebruikt in een concentratie van 4% (w/v), waardoor de sol-gel overgang van de bioink bij 25 °C binnen ongeveer 10 min mogelijk was. Een snellere gelation kan worden bereikt door de concentratie gelatine te verhogen. Sterilisatie door filtratie met behulp van een filter van 0,2 μm kan echter in het gedrang komen. De bioinkfiltratie is een cruciale stap, waarbij wordt gecontroleerd of hogere concentraties gelatine (>5% w / v) filtratie kunnen voorkomen. Een alternatief om een sneller gelaaipunt te bereiken tijdens het bioprinten is om de spuit met de bioink gedurende 2 minuten op 4 °C te laten staan voordat u deze aansluit op de bioprinterprintkop. Na het bioprinten is het cruciaal om de constructie op 25 °C te houden om te voorkomen dat de 3D-structuur wordt gedestabiliseerd en een gelled conditie te behouden voorafgaand aan UV-expositie. Met name moet de constructie solide zijn wanneer de fibrinogeen crosslinker-oplossing aan de plaat wordt toegevoegd. Voor GelMA-crosslinking is het belangrijk om het monster (2 x 60 s aan elke kant) om te draaien om uv-expositie tijdens de constructie te garanderen. Voor fibrinogeen crosslinking moet de crosslinker-oplossing de constructie volledig bedekken. Daarom moet bij gebruik van een grotere schotel of bord het volume worden aangepast. Na crosslinking moet de hydrogel er homogeen uitzien onder fasecontrastmicroscopie en moeten cellen homogeen verdeeld zijn over het construct, met een ronde morfologie.

Dit protocol stelde de gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink in staat om structuren van verschillende vormen te printen, met behoud van de integriteit en de 3D-vorm van de constructen. Vanwege de beperkingen van de temperatuur tot 25 °C in de laminaire stroming, werd de bioprinting uitgevoerd in de kweekruimte buiten de laminaire stroming. De bioprinttijd was ongeveer 1 minuut voor elk monster en er werd geen besmetting waargenomen tijdens celkweek.

Celintegriteit kan worden beïnvloed door bioprinting, vanwege de schuifspanning die tijdens het proces wordt veroorzaakt35. Dit kan worden geregeld door afdrukparameters, zoals afdruksnelheid, te optimaliseren. In dit werk werden verschillende bioprintsnelheden getest, 400, 600 en 800 mm / min, waarbij een significante afname van de levensvatbaarheid van cellen werd waargenomen wanneer de snelheid werd verhoogd van 400 naar 600 mm / min. Na 400 mm/min bleef ongeveer 74% van de cellen levensvatbaar na bioprinting, en deze waarde steeg aanzienlijk na 7 dagen incubatie (>80%). Daarom werden lagere snelheden niet gebruikt om de overmatige blootstelling van cellen aan de omgeving te voorkomen. De 2D-cultuur van astrocyten vertoonde een hogere levensvatbaarheid (~ 90%) in vergelijking met de biogeprinte cellen. Zoals blijkt uit fluorescerende beelden, wordt de morfologie echter beïnvloed door het type cultuur. Terwijl 2D-cellen plat waren, bezaten astrocyten in 3D-omgeving een sterachtige vorm, die met elkaar verbonden was door cellulaire processen.

Met name de mimetische micro-omgeving was gunstig voor corticale astrocytencultuur, omdat de levensvatbaarheid van cellen na 1 week aanzienlijk toenam, wat suggereert dat celproliferatie binnen het construct. Laminine, een glycoproteïne aanwezig in de hersenen ECM, werd toegevoegd aan de bioink met als doel een hogere hechting van de astrocyten aan de hydrogel te bereiken14. Cytoskelet F-actine kleuring toonde aan dat biogeprinte astrocyten in hoge dichtheid binnen het construct waren, wat aangeeft dat de celconcentratie die in dit protocol werd gebruikt astrocyten interconnectie mogelijk maakte. Immunohistochemie voor GFAP-lokalisatie, een marker gecorreleerd met de uitgebreide arborisatie van astrocyten en celhypertrofie45, bevestigd door F-actinekleuring, toonde aan dat cellen typische astrocytische morfologie vertoonden, wat aangeeft dat het mimetische 3D-systeem gunstig was voor cellen om zich te hechten en zich te gedragen zoals in hun oorspronkelijke omgeving.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare procedure voor 3D bioprinting corticale astrocyten. Vanwege het belang van astrocyten in neuro-inflammatierespons op letsel, evenals bij het reguleren van neuronale functionaliteit, kunnen studies met betrekking tot deze gliacel bijdragen aan vele aspecten in het begrip van ziekten die het CZS beïnvloeden. Daarom is het hier gepresenteerde 3D-in vitromodel nuttig in toekomstige toepassingen die gericht zijn op het bestuderen van astrocyten-neuroninteracties, de functionaliteit van astrocyten in hersenpathologieën en het potentieel van astrocyten als therapeutische doelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door The São Paulo Research Foundation (FAPESP), subsidienummers 2018/23039-3 en 2018/12605-8; Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq), subsidienummers 465656/2014-5 en 309679/2018-4; en Coördinatie voor de verbetering van het personeel in het hoger onderwijs (CAPES), financiële code 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

Bio-engineering Nummer 173 astrocyten 3D bioprinting biofabricage tissue engineering neuraal weefsel centraal zenuwstelsel
3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter