Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

כאן אנו מדווחים על שיטה של אסטרוציטים קליפת המוח הדפסה ביולוגית 3D עבור biofabricating רקמות עצביות כדי ללמוד את הפונקציונליות של אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית ואת המנגנונים מעורבים תאי גליה במחלות נוירולוגיות וטיפולים.

Abstract

אסטרוציטים הם תאי גליה עם תפקיד חיוני במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), כולל תמיכה עצבית ופונקציונליות. תאים אלה מגיבים גם לפציעות עצביות ופועלים כדי להגן על הרקמה מפני אירועים ניווניים. אין ויטרו מחקרים על תפקוד אסטרוציטים חשובים כדי לבהיר את המנגנונים המעורבים באירועים כאלה ולתרום לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לביו-פטרייתית מבנה רקמות דמוי עצב עשיר באסטרוציטים על ידי ביו-סינק עתיר אסטרוציטים תלת-ממדי. נעשה שימוש בביו-הדפסה תלת-ממדית מבוססת שחול בעבודה זו, ואסטרוציטים חולצו מגורי המוח של עכברי C57Bl/6. הביו-וינק הוכן על ידי ערבוב אסטרוציטים קליפת המוח ממעבר 3 לתמיסה ביו-חומרית המורכבת מג'לטין, ג'לטין-מתיאקרילויל (GelMA) ופיברינוגן, בתוספת למינין, שהציג תנאי הדפסה ביולוגית אופטימליים. תנאי הביוהדפסה בתלת-ממד מזערו את הלחץ בתאים, ותרמו לבישאיות הגבוהה של האסטרוציטים במהלך התהליך, שבו 74.08% ± 1.33% מהתאים היו ברי קיימא מיד לאחר הדפסה ביולוגית. לאחר שבוע אחד של דגירה, הכדאיות של אסטרוציטים גדלה באופן משמעותי ל 83.54% ± 3.00%, המציין כי המבנה 3D מייצג microenvironment מתאים לצמיחת התא. ההרכב הביו-חומריםי אפשר חיבור תאים והתנהגות אסטרוציטית מגורה, עם תאים המבטאים את החלבון חומצי פרברילית גליה סמן ספציפי (GFAP) ובעל מורפולוגיה אסטרוציטית טיפוסית. פרוטוקול רבייה זה מספק שיטה בעלת ערך לביו-פבריקט של רקמה דמוית עצב תלת-ממדית עשירה באסטרוציטים הדומים למיקרו-סביבה הטבעית של התאים, שימושית לחוקרים שמטרתם להבין את תפקודם של אסטרוציטים ואת יחסם למנגנונים המעורבים במחלות נוירולוגיות.

Introduction

אסטרוציטים הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס במוח. בנוסף לתמיכה עצבית מתמשכת, אסטרוציטים אחראים על ויסות ספיגת נוירוטרנסמיטורים, שמירה על שלמות מחסום הדם - מוח, ווויסות סינפטוגנזה עצבית1,2. אסטרוציטים יש גם תפקיד חיוני דלקת מערכת העצבים, תגובה לפציעות במוח בתהליך שמוביל תגובתיות אסטרוקטריקטית או אסטרוגליוזיס תגובתי3,4, יצירת צלקת גליה המונעת תערוכת רקמות בריאה סוכנים ניווניים5. אירוע זה גורם לשינויים בביטוי הגנים, המורפולוגיה והפונקציה6,7של אסטרוציטים . לכן, מחקרים המערבים את הפונקציונליות של אסטרוציטים מועילים לפיתוח טיפולים לטיפול בהפרעות נוירולוגיות.

מודלים במבחנה חיוניים לחקר מנגנונים הקשורים לפציעות נוירולוגיות, ולמרות שבידוד מוצלח ותרבות דו-ממדית (2D) של אסטרוציטים קליפת המוח הוקמו8, מודל זה אינו מצליח לספק סביבה מציאותית המחקה התנהגות תאים מקורית ולשכפל את המורכבות של המוח9 . במצב 2D, התמיכה המכנית והביוכימית הירודה, אינטראקציות נמוכות בין תאים לתאים ולמטריצת תאים, ושיטוח תאים המוביל להיעדר קוטביות בזאלית-אפית, משפיעים על דינמיקת איתות התא ועל התוצאות הניסיוניות המובילות לשינוי מורפולוגיה של תאים וביטוי גנים, אשר פוגעים בתגובה לטיפולים10. לכן, חשוב לפתח חלופות המספקות סביבה עצבית מציאותית יותר, במטרה לתרגם את התוצאות למרפאה.

תרבית תאים תלת מימדית (תלת-ממדית) מייצגת מודל מתקדם יותר המשיב את תכונות הנאמנות המוגברות של איברים ורקמות, כולל CNS11. לגבי תרבות גליה, מודלים תלת-ממדיים תורמים לשמירה על מורפולוגיה אסטרוציטים, קוטביות בזאלית-אפית של תאים, ואיתות תאים12,13. טכנולוגיית הביו-הדפסה בתלת-ממד התפתחה ככלי רב עוצמה לביו-פבריות של רקמות חיות תלת-ממדיות באופן מבוקר באמצעות תאים וביו-חומרים כדי לשחזר את המבנה והמאפיינים של רקמות מקומיות. השימוש בטכנולוגיה זו הוביל לשיפור משמעותי בחיזוי התוצאות ותרם לרפואה רגנרטיבית המיושמת ב- CNS14,15,16.

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את הבידוד והתרבות של אסטרוציטים קליפת המוח. הפרוטוקול מפרט גם שיטה לשחזור אסטרוציטים ביו-הדפסה מוטבע ג'לטין / ג'לטין מתאקרילויל (GelMA)/פיברינוגן, בתוספת למינין. בעבודה זו, ביו-הדפסה מבוססת שחול שימשה להדפסת ההרכב הביו-חומרי המכיל אסטרוציטים קליפת המוח בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל. לחץ הגיוטה של ביו-הדפסה צומצם על ידי שליטה במהירות ההדפסה, ואסטרוציטים הראו כדאיות גבוהה לאחר התהליך. מבנים מודפסים ביו-מודפסים היו מתורבתים במשך שבוע אחד, ואסטרוציטים הצליחו להתפשט, לצרף ולשרוד בתוך ההידרוג'ל, לשמור על המורפולוגיה האסטרוציטית ולהביע סמן ספציפי של חלבון חומצי גליה (GFAP)4.

הליך זה תואם עם ביו-הדפסה מונחית בוכנה וניתן להשתמש בו כדי לבצע אסטרוציטים בהדפסה ביולוגית שמקורם במקורות שונים. המודל המודפס בתלת-ממד המוצע כאן מתאים למגוון רחב של יישומי הנדסה עצבית, כגון מחקרים של המנגנונים המעורבים בפונקציונליות אסטרוציטים ברקמות בריאות והבנת התקדמות הפתולוגיות הנוירולוגיות ופיתוח הטיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים פעלו על פי הנחיות בינלאומיות לשימוש בבעלי חיים במחקר (http://www.iclas.org) ואושרו על ידי הוועדה לאתיקה בחקר הממשלה הפדרלית של סאו פאולו (CEUA 2019/ 9292090519).

1. ניתוח מוח עכברים

  1. העבר 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ Hanks קר (HBSS) לצלחת תרבות 100 מ"מ ו 1 מ"ל למיקרו-טיוב של 1.5 מ"ל. הכן מיקרו-טיוב אחד לכל חיה.
    הערה: גם את מנת התרבות וגם את המיקרו-טיוב צריך לשמור על קרח.
  2. הכן את תרבות האסטרוציטים מדיום באמצעות DMEM F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2% גלוטמין, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). לחטא את המדיום על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  3. המת חסד C57Bl/6 גורים עכברים (לאחר הניאון 1) על ידי עריפת ראש באמצעות מספריים הפעלה חדים. באמצעות מלקחיים, למשוך את העור ולחשוף את הגולגולת. ודא הן מספריים והן מלקחיים מעוקרים עם 70% אתנול.
  4. חותכים את הגולגולת מגנום פורם לחלק העליון של הראש לאורך מישור הקשת באמצעות מספריים מעוקלים חדים.
    הערה: ודאו שהרקמה האנצפלית אינה פגומה.
  5. באמצעות מרית בעבר מעוקר עם אתנול 70%, להרים את המוח מחלל הגולגולת ולהניח אותו בצלחת התרבות המכילה 10 מ"ל של HBSS קר.
  6. הניחו את צלחת התרבות המכילה את המוח מתחת לסטריאומיקרוסקופ, והשתמשו בשני מלקחיים קהים, הסירו את הקרום המוח מהמוח(איור 1).
  7. להפריד את הקורטיס משאר המוח על ידי גלגול עדין שלהם מן הקו החציוני של המוח באמצעות מרית.
  8. לאסוף את שתי הקוריות ומיד להעביר אותם לאותו microtube המכיל 1 מ"ל של HBSS קר.

2. אסטרוציטים בידוד ותרבות

  1. מתחת לזרימת למינאר, לחתוך את רקמת קליפת המוח לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מיקרו מעוקל, ולשטוף אותם עם 1 מ"ל של HBSS על ידי צנרת למעלה ולמטה 3x. חכה שהרקמה תתיישב. הסר HBSS והוסף HBSS טרי, חוזר על התהליך פעמיים נוספות.
  2. הסר HBSS ולדגירה את הרקמה עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב 37 °C (5 דקות).
    הערה: רק עיכול טריפסין מספיק בשלב זה.
  3. מכנית לנתק את הרקמה על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה 15x.
    הערה: הניתוק המלא של הרקמה נצפה על ידי הגידול בעכורת ההשעיה ובהיעדר שברי רקמה גדולים במתלה.
  4. העבר את הפתרון לצינור חרוטי 15 מ"ל, נטרל את פעילות טריפסין על-ידי הוספת נפח שווה של FBS, וסנן את הפתרון במסנן מסננת תאים של 0.4 מיקרומטר כדי להסיר שברים שאינם מנותקים.
  5. לשטוף את המסנן עם 1 מ"ל של אסטרוציטים בינוני, לאסוף את השעיית התא שעבר דרך מסננת, וצנטריפוגה אותו במשך 5 דקות ב 200 x g ו 25 °C (70 °F). לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולהשעות את הכדור ב 1 מ"ל של אסטרוציטים תרבות בינוני.
  6. העבר את ההשעיה התאית לבקבוק תרבית T25, לפצות את הנפח של בינוני עד 3.5 מ"ל, ולדגירה את התאים ב 37 °C (5% CO2).
  7. ודא כי לאחר 24 שעות, התאים הם דבקים. לאחר מכן, להחליף את המדיום ולשנות אותו כל 3 ימים.
  8. לאחר 7 ימים, להסיר מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים מן התרבות על ידי שטיפת התאים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
  9. החלף את פתרון PBS במדיום תרבות האסטרוציטים והותיר את בקבוקנית התרבות בשייקר מסלולית ב-180 סל"ד למשך הלילה.
    הערה: אסטרוציטים יוצרים מונולייר ב-10-12 ימים של תרבות.

3. סינתזה של מתכרילויל ג'לטין (GelMA)

  1. שוקלים 10 גרם ג'לטין המתקבל מעור חזירי ומתמוססים ב-100 מ"ל של PBS על ידי מתן אפשרות לתמיסה לערבב על צלחת חימום ב-240 סל"ד ו-50 מעלות צלזיוס עד לפירוק מלא.
  2. מתחת למכסה המנוע, להוסיף 2 מ"ל של anhydride מתאקרילי (MA) עבור רמה נמוכה של פונקציונליזציה, ולתת אמולסיה ג'לטין לערבב ב 240 סל"ד ו 50 °C (50 °F) עבור 2 שעות.
    אזהרה: הצהרת סיכון MA: H302 + H332 (מזיק אם נבלע או בשאיפה), H311 (רעיל במגע עם העור), 314 (גורם לכוויות חמורות בעור ונזק לעיניים), 315 (גורם לגירוי בעור), H317 (עלול לגרום לתגובת עור אלרגית), H318 (גורם נזק חמור לעיניים), 331 (רעיל אם נשאף), H332 (מזיק אם נשאף), H335 (עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה). הנחיות טיפול: P261 (הימנע מאבק נשימה / אדים / גז / ערפל / אדים / ספריי), P305 + P351 + P338 + P310 (אם בעיניים: לשטוף בזהירות עם מים במשך כמה דקות. הסר עדשות מגע, אם קיימות וקלות להפעלה. מיד להתקשר למרכז רעל / רופא), P301 + P312 + P330 (אם נבלע: להתקשר למרכז רעל / רופא אם אתה מרגיש לא טוב. לשטוף את הפה).
    הערה: הוסף MA לאט מאוד, טיפה אחר טיפה.
  3. לדלל את פתרון ג'לטין-MA ב 100 מ"ל של PBS מחומם מראש (50 °C) כדי לקבל 200 מ"ל של נפח סופי ולתת את הפתרון לערבב ב 240 סל"ד ו 50 °C (50 °C) במשך 10 דקות.
  4. חותכים ~ 20 ס"מ של קרום דיאליזה (ניתוק מולקולרי 12-14 kDa) ולהשרות אותו במים deionized עד שהוא רך.
    הערה: מלא את הממברנות במים דה-יונים כדי לוודא שאין חורים או פגמים.
  5. באמצעות משפך, להעביר את פתרון ג'לטין-MA לממברנות.
    הערה: סגור את שני הצדדים ולהשאיר מקום נוסף בפנים כדי לאפשר תערובת.
  6. מניחים את הממברנות המכילות את פתרון ג'לטין-MA לתוך מיכל עם 2 ליטר של מים מזוקקים עבור דיאליזה, ומאפשר להם לערבב ב 40 °C (5 ימים) (500 סל"ד).
    הערה: לכסות את המיכל כדי למנוע אידוי מים.
  7. לשנות את המים מזוקקים פעמיים ביום. בכל פעם, הפוך את הממברנות להומוגניזציה.
  8. ביום החמישי, לערבב 200 מ"ל של מים אולטרה-שרף שחוממו מראש (40 °C) לג'לטין-MA המחויג, ולתת לו לערבב במשך 15 דקות ב 40 °C (50 °F).
  9. העבר את פתרון ג'לטין-MA לצינורות חרוט 50 מ"ל עד 25 מ"ל ולתת את הצינורות להישאר ב -80 °C (50 °F) במשך יומיים.
    הערה: לאחסן את הצינורות אופקית כדי להקל על ליופיליזציה.
  10. ליופיליזציה של הפתרונות הקפואים במשך 3-5 ימים ולאחסן את GelMA ליופילי מוגן מפני לחות.

4. הכנת ביוינק

הערה: על מנת להשיג 1 מ"ל של bioink, מומלץ לפברק לפחות 3 מ"ל של פתרון biomaterial, כמו ייתכנו הפסדים במהלך סינון.

  1. הכנת פתרון פיברינוגן
    1. הכן תמיסת מלח (NaCl 0.9%) במים דה-יעויתיים, ולהמיס 10 מ"ג פיברינוגן מפלזמת בקר ב 1 מ"ל של תמיסת המלח כדי להשיג ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
      הערה: כמו פיברינוגן ספיחות זכוכית, לא להשתמש צלוחיות זכוכית כדי להכין את פתרון פיברינוגן.
    2. השאירו את הפתרון תחת עצבנות ב 37 °C (50 °F) עד פירוק מלא של פיברינוגן.
      הערה: לפירוק פיברינוגן, השתמש במערכת סיבובית הממוקמת בתוך תנור ב 37 °C (7 °F). תסיסה מגנטית (180 סל"ד) של פיברינוגן על צלחת חמה ב 37 °C (70 °F) מתאים גם. במצב זה, 10 מ"ג/ מ"ל פיברינוגן לוקח בערך 40 דקות כדי להתמוסס.
  2. הכנת פתרון ג'לטין/גלמ"ל
    1. שקול 0.12 גרם של ג'לטין ולהוסיף אותו 1.9 מ"ל של PBS מחומם מראש (40 °C) כדי להשיג ריכוז סופי של 4% (w/v) ג'לטין. מערבולת כדי להקל על פירוק.
    2. שמור את אמולסיה ב 40 °C (50 °F) עד פירוק מלא.
    3. שוקלים 0.06 גרם של גלמ"ת ליופילי ומעבירים לתמיסת הג'לטין כדי להשיג ריכוז סופי של 2% (w/v) GelMA. מערבולת כדי להקל על פירוק.
    4. שמור את הפתרון ב 40 °C (50 °F) עד פירוק מלא.
  3. הכנת ג'לטין עמוס אסטרוציטים/גלמה/פיברינוגן ביו-ink
    1. פיפטה 0.9 מ"ל של פתרון פיברינוגן 10 מ"ג /מ"ל ולהעביר לפתרון ג'לטין/ GelMA כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ"ל של פיברינוגן.
    2. שקול 0.015 גרם של photoinitiator (PI) ולהעביר לפתרון ג'לטין / GelMA / פיברינוגן כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5% (w / v) PI. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה ולשמור אותו ב 40 °C מוגן מפני אור כדי למנוע השפלה PI.
      הערה: מלאי הביוינק ב 4 °C (5 °F) לכל היותר 24 שעות.
    3. מתחת לזרימת למינאר, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חרוט סטרילי 15 מ"ל.
      הערה: הפתרון הביו-חומריםי צריך להיות ב 37-40 °C (70 °F) כדי לאפשר סינון.
    4. העבר 980 μL של פתרון biomaterial לצינור חרוט 15 מ"ל.
    5. לדלל למינין בתמיסת מלח כדי להשיג תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
    6. Pipette 20 μL של למינין ולהעביר לצינור המכיל את bioink כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל למינין.
    7. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, הימנעות בועות. אם כל בועות נמשכות, צנטריפוגה הצינור חרוט ב 200 x גרם במשך 2 דקות. שמור את bioink ב 37 °C (50 °F) עד שהוא מעורבב עם התאים.
    8. טריפסיניזציה אסטרוציטים ראשוניים עם 0.05% טריפסין במשך 5 דקות.
      הערה: השתמש אסטרוציטים ממעברים 1 עד 3.
    9. לנטרל את פעילות טריפסין עם FBS ביחס של 1:1 ולהעביר את התאים לצינור חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה זה ב 200 x g במשך 5 דקות.
    10. לספור את התאים ולהעביר 1 x 106 תאים לצינור חרוט אחר. צנטריפוגה זה ב 200 x g במשך 5 דקות.
    11. הסר את supernatant עוזב נפח קטן (~ 200 μL) כדי להשעות את גלולה התא, על ידי הקשה בעדינות על החלק התחתון של הצינור חרוטי.
    12. העבר 1 מ"ל של פתרון ג'לטין / GelMA / פיברינוגן לצינור המכיל את התאים ו pipette בעדינות למעלה ולמטה הומוגניזציה, קבלת ריכוז סופי של 1 x 106 תאים / מ"ל.

5. הכנת פתרון ההצלבה

  1. שחזור תרומבין
    1. הכן פתרון מניה של תרומבין 100 U /mL במים סטריליים deionized עם 0.1% (w / v) אלבומין סרום בקר (BSA) בצינור חרוט 15 מ"ל. מלאי במיקרו-צינורות ב--20 מעלות צלזיוס.
      הערה: כמו ספיחות תרומבין זכוכית, לא להשתמש צלוחיות זכוכית כדי להכין את פתרון המלאי או לאחסן את aliquots.
  2. הכנת פתרון תרומבין-CaCl2
    1. Pipette 100 μL של פתרון מלאי תרומבין ולהעביר צינור חרוט 50 מ"ל המכיל 8.9 מ"ל של מים deionized סטרילי כדי להשיג ריכוז סופי של 1 U / mL תרומבין.
    2. הכן פתרון 10% (w/v) CaCl2 במים דה-יוניזציה וחטא באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
    3. העבר 1.1 מ"ל של פתרון 10% CaCl2 לצינור החרוט המכיל תרומבין, על מנת להשיג יחס סופי של 1:9 (CaCl2 לטרומבין).
      הערה: הכן את פתרון ההצלבה בנפח לשימוש בניסוי, תוך הימנעות מאחסון.

6. ביו-הדפסה עמוסת אסטרוציטים באמצעות ביו-הדפסה מבוססת שחול

  1. עיצוב הרקמה העצבית
    1. באמצעות קוד G: לבנות רשת של 6 x 6 מ"מ (צורה בריבוע) עם מרחק של 1 מ"מ בין כל קו מודפס ביולוגית על ציר X ו- Y, ו 6 שכבות על ציר Z (0.2 מ"מ בין כל קו); הגדר את שחול (E) ל 0.01 מ"מ, הגדלת 0.001 מ"מ בכל שכבה חדשה של ציר Z; ולהגדיר את מהירות ההדפסה (F) ל 400 מ"מ / דקה (מידע משלים).
  2. הגדרת ביו-הדפסה
    1. לחשוף את המכונה לאור UV במשך 15 דקות, ולאחר מכן לנגב אותו עם אתנול 70%.
    2. הפעל את הביו-הדפסה באמצעות מתג ההפעלה. חבר את המחשב למחשב באמצעות כבל USB. פתח את תוכנת השליטה כדי לחבר אותה להדפסה הביולוגית ולטעון את עיצוב הקובץ.
  3. הכנת מזרק ההדפסה הביולוגית
    1. העבר את הביונק ג'לטין עמוס אסטרוציטים / GelMA / פיברינוגן למזרק פלסטיק 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1,000 μL.
      הערה: העבר לאט כדי למנוע היווצרות בועה.
    2. חבר מחט סטרילית 22 G קהה למזרק.
      הערה: השאירו את המזרק ב 4 °C (7 °F) במשך 2 דקות.
    3. חבר את המזרק לראש ההדפסה של הביו-הדפסה ושטוף ידנית את הביו-וינק כדי להסיר את הבועות הנותרות.
  4. ביו-הדפסה
    הערה: הטביעה הביולוגית בוצעה מחוץ למכסה המנוע.
    1. מניחים צלחת תרבות 35 מ"מ על שולחן הביו-הדפסה וממקם את המחט במרחק של 0.1 מ"מ מפני השטח של צלחת התרבות כדי לאפשר תנועה של המחט.
      הערה: השתמש במנת תרבית אחת של 35 מ"מ לכל ביו-הדפסה.
    2. לחץ על לחצן הדפס.
    3. לאחר הביו-הדפסה מעל, להבטיח כי המזרק מתרחק מן המנה. לאחר מכן, סגור את צלחת התרבות ולהתכונן לתהליך crosslinking.
      הערה: הדפסה ביולוגית של מבנה אחד אורכת כדקה ו -10 שניות.
  5. קישור בין המבנה והתרבות המודפסים ביו-מודפסים
    1. מניחים את מנת התרבות תחת אור UV ב 2 mW / ס"מ2 עבור 2 x 60 s (למעלה ולמטה) עבור קישור GelMA.
    2. מתחת לזרימת למינאר, להעביר את המבנה המודפס ביו לצלחת 24-well באמצעות מרית סטרילית.
    3. הוסף 500 μL של פתרון תרומבין / CaCl2 ולהשאיר למשך 30 דקות כדי לאפשר קישור פיברין.
    4. הסר את פתרון crosslinking ולשטוף את המבנה עם 2 מ"ל של PBS 1x. לאחר מכן, להחליף את PBS עם 1 מ"ל של תרבות אסטרוציטים בינוני ודגרה ב 37 °C (5% CO2). לשנות את המדיום כל 3 ימים.

7. הערכת הכדאיות של אסטרוציטים

  1. הכדאיות של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית
    1. מעבירים את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת תרבית של 35 מ"מ בעזרת מרית.
    2. לשטוף את המבנה עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    3. הפקד 100 μL של ריאגנט חי / מת מעל המבנה ולשמור אותו ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות, שמירה על זה מוגן מפני אור.
    4. הסר את ריאגנט חי / מת ולשטוף את המבנה עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    5. העבר את המדגם לצלחת קונפוקלית באמצעות מרית, ובחן את התאים בתוך המבנה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עירור 488 ו 570 ננומטר לרכישת תמונות.
      הערה: השתמש בהגדלה של פי 10 להדמיה כוללת של התאים בתוך המבנה.
    6. תוודא שהדגימה יושבת שטוחה. במידת הצורך, מניחים כיסוי מעל המדגם כדי להגדיל את השטוחות.
      הערה: במהלך ההדמיה, ודא צלחת confocal אטום היטב כדי למנוע את המדגם להתייבש.
    7. חשב את מספר בת קיימא (ירוק) ומת (אדום) באמצעות תוכנה חישובית.
  2. הכדאיות של תרבות אסטרוציטים 2D
    1. זרעים 0.5 x 106 אסטרוציטים (מעבר 1-3) בצלחת קונפוקלית של 35 מ"מ, מוסיפים אסטרוציטים בינוניים ודגר אותם ב-37 °C (5% CO2).
    2. כאשר תאים הם מפגש, להסיר את המדיום התרבות לשטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    3. הפקד 200 μL של ריאגנט חי / מת, ולשמור את המנה ב 37 °C (30 °F) במשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
    4. הסר ריאגנט חי/ מת לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    5. קח את המנה למיקרוסקופ קונפוקלי בשילוב עם מצלמה דיגיטלית, והשתמש בריצת 488 ו-570 ננומטר לרכישת תמונה.
    6. חשב את מספר בת קיימא (ירוק) ומת (אדום) באמצעות תוכנה חישובית.

8. חיסונים של אסטרוציטים

  1. הכתמת חלבון חומצי פרברילי גליאלי (GFAP) של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית תלת-ממדית
    הערה: כדי לחקור את נוכחותם של סמני תאים אחרים, לשנות את הנוגדן העיקרי בהתאם.
    1. הסר את המדיום מהבאר לשטוף את המבנה עם 1 מ"ל של 3x PBS.
    2. הוסף 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS לבאר עד המבנה מכוסה לחלוטין ולהשאיר אותו במשך 2 שעות ב 4 °C (70 °F).
    3. הסר PFA ולשטוף את המבנה עם 1 מ"ל של 3x PBS.
      הערה: ניתן להשהות הליך זה למשך מספר חודשים אם הוא מאוחסן ב- 4 °C (70°F) ב- PBS. ודא צלחת הבאר אטומה כדי למנוע אידוי PBS.
    4. לטפל במדגם עם גליצין 0.1 מול / L במשך 5 דקות.
    5. לשטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS במשך 5 דקות.
    6. פרמז'י להפוך את המדגם עם PBS המכיל 0.1% Triton X-100 ו 10% FBS עבור 1 שעה ב 25 °C תחת תסיסה מסלולית.
    7. לדגור על המבנה עם עוף נגד GFAP (דילול נוגדנים ראשוני 1:500) ב 4 °C (70 °F) לילה.
    8. לשאוף את הנוגדן העיקרי לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בנוגדן ראשי מספר פעמים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 °C (70 °F).
    9. לדגור את המדגם עם אלקסה פלואור 488-מצומד אנטי עוף (דילול נוגדנים משני 1:500) ו 1 מיקרוגרם / mL DAPI עבור 1 שעה ב 25 °C תחת תסיסה מסלולית.
      הערה: שמור על הדגימה מוגנת מפני אור.
    10. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
    11. מעבירים את המבנה לצלחת קונפוקלית בקונפוקל 35 מ"מ.
      הערה: ודאו שהצלחת אטומה היטב כדי למנוע את התייבשות הדגימה.
  2. הכתמת חלבון חומצי פרברילי גליאלי (GFAP) של תרבית אסטרוציטים 2D
    1. זרעים 0.5 x 106 אסטרוציטים (מעבר 1-3) בצלחת קונפוקלית של 35 מ"מ, מוסיפים אסטרוציטים בינוניים ודגר אותם ב-37 °C (5% CO2).
    2. כאשר התאים הם מפגש, להסיר את המדיום התרבות לשטוף אותם עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    3. חזור על שלבים 8.1.2-8.1.10.
  3. אסטרוציטים ציטסקלטון מכתימים
    1. חזור על שלבים 8.1.1-8.1.6.
    2. הוסף 200 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל של פתרון פאלואידין מצומד פלואורסצנטי ב- PBS ו 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI מעל המבנה.
    3. דגירה במשך 1 שעות ב 25 °C תחת תסיסה מסלולית, שמירה על המדגם מוגן מפני אור.
    4. לשטוף את המדגם עם 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות 3 פעמים , ולהעביר את המבנה לצלחת קונפוקלית באמצעות מרית.
      הערה: ודאו שהצלחת אטומה היטב כדי למנוע את התייבשות הדגימה.

9. הדמיה קונפוקלית

  1. קח את הכלים למיקרוסקופ קונפוקלי בשילוב עם מצלמה דיגיטלית להדמיה (359, 488, ו 570 ננומטר עירור).
  2. השתמש בהגדלה של פי 10 לתצוגה חזותית כוללת וב- 40 או 63x לתמונות מוגדלות של תאים.
    הערה: ודא שהדגימה יושבת שטוחה. במידת הצורך, מניחים כיסוי מעל המדגם כדי להגדיל את השטוחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבודה זו נועדה לפתח רקמה דמוית עצב באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית להפקדת ביונק ג'לטין ראשי עמוס אסטרוציטים/גלמה/פיברינוגן. אסטרוציטים חולצו ובודדו מקליפת המוח של גורי עכברים (איור 1), נוספו להרכב ביו-חומרי, המאפשר ביו-פיכחון של מבנה תלת-ממדי חי.

העיצוב בעזרת המחשב (CAD) פותח באמצעות קוד G (קובץ משלים) כמסגרת מחוברת של צורה מרובעת (0.6 x 0.6 מ"מ), עם נקבוביות של 1 מ"מ, במטרה להקל על דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן. המסגרת הורכבה מ-6 שכבות שהונחו זו על גבי זו, ומשתנות בזווית של 90° בכלשכבה (איור 2A i). המבנה המעוצב היה בעל כ 5 מ"מ של גבוה (איור 2A ii),המאפשר מניפולציה רקמה. הרכב הביוינק אפשר גם ייצור מבנים של צורות שונות(איור 2B).

הכנת הביו-וינק המורכב מג'לטין, גלמ"א ופיברינוגן כללה שני שלבים של קישור צולב. ראשית, GelMA היה מוצלב תחת אור UV, שבו קשרים קוולנטיים בין-עיניים נוצרים, ואחריו קישור פיברין. בשלב זה, תרומבין cleave באופן אנזימטי שרשראות פיברינוגן, וכתוצאה מכך היווצרות של סיבי פיברין17, תגובה התייצבה על ידי Ca2 + יונים18. לאחר מכן, סיבי גלמ"א ופיברין יוצרים רשת פולימרים משולבת יציבה (IPN) בתוספת למינין, תמיכה מתאימה לחיבור תאים והתפשטות19,20 (איור 2C).

לפני הדפסה ביולוגית, לאחר 12 ימים של בידוד, אסטרוציטים התאפיינו בנוכחות GFAP, מרכיב חלבון המרכיב את חוטי הביניים אסטרוציטים4 (איור 3A). לאחר מכן, אסטרוציטים טריפסינים היו מעורבים עם פתרון ג'לטין / GelMA / פיברינוגן בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל, יצירת ביוינק עמוס אסטרוציטים. הביונק הועבר למזרק בגודל 5 מ"ל המחובר למחט קהה של 22 גרם, והלחין את ראש ההדפסה שלהביו-הדפסה (איור 3B i). המחט אפשרה את שחול הביוינק מבלי לסתום ולמנוע לחץ גיסת גבוה לתאים.

בשל המאפיינים הצמיגיים של ג'לטין, אשר מתנהג כנוזל בטמפרטורות גבוהות יותר וכג'ל בטמפרטורות נמוכות יותר21, המבנה המודפס ביו-מודפס שמר על נאמנות הצורה(איור 3B ii). לאחר הדפסה ביולוגית של שתי שכבות רצופות של ביו-ינק, נצפתה היווצרות מבנה מוגדר היטב (איור 3C), עם תאים לכודים בתוך הביו-חומרים.

לאחר תהליכי ביו-הדפסה והצלבה, המבנה דוגר במדיום אסטרוציטים, ואחרי יום אחד של ביו-הדפסה, רוב התאים עדיין הציגו מורפולוגיה עגולה(איור 3D). פיגומים מודפסים ביו-מודפסים שמרו על שלמות לאחר 7 ימים של דגירה, ולמרות שנצפתו כמה תאים עגולים, מספר רב של אסטרוציטים התפשטו ברחבי המבנה, והציגו מורפולוגיה אסטרוציטית ויחסים זהים (איור 3E).

מכיוון שהפרמטרים של ביו-הדפסה, כגון מהירות, יכולים להשפיע ישירות על הכדאיות של התא, מהירויות ביו-הדפסה שונות (400, 600 ו-800 מ"מ/דקה) נבדקו והישרדות אסטרוציטים הוערכו באמצעות בדיקת חי/מת עם קלצ'ין-AM (תאים חיים, פלואורסצנטיות ירוקה) ואתידיום הומודימר-III (EthD-II) (תאים מתים, פלואורסצנטיות אדומה). אחוז התאים הנים כותם באמצעות תוכנה חישובית, על ידי חישוב מספר התאים החיים והמתים. הכדאיות של התאים הוערכה בזמן 0 (מיד לאחר ביו-הדפסה), והתוצאות הראו כי במהירות נמוכה יותר, 400 מ"מ לדקה, תאים בני קיימא ייצגו 74.08% ± 1.33% מכלל התאים, להיות גבוה משמעותית מאשר תאים ביוהדפסה ב 600 ו 800 מ"מ / דקה (60.25% ± 1.93% ו 62.94 ± 6.18%, בהתאמה) (איור 4A). לכן, המהירות של 400 מ"מ / דקה שימש בעבודה זו.

לפני ביו-הדפסה, אסטרוציטים בתרבית 2D אופיינו כאחוז התאים הקיימים, והיכולת של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית נרמלה למצב זה. התוצאות הראו כי תרבית 2D הציגה 90.98% ± 0.94% של תאים קיימא. הכדאיות של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית (יום 7) הייתה 83.54% ± 3.00%, המייצגת 0.92 ± 0.03 של הערך הדו-ממדי, שהיה גבוה משמעותית מזה של היום 0 (0.81 ± 0.01) (איור 4B). תמונות של אסטרוציטים מוכתמים בריאגנט חי/מת מוצגות באיור 4C,ומראים שלאחר הדפסה ביולוגית, לתאים הייתה מורפולוגיה עגולה(איור 4C i). לאחר שבוע של דגירה, אסטרוציטים מתפשטים ברחבי המבנה (איור 4C ii),המציגים מורפולוגיה ברורה של תאים מתרבית דו-קומתית(איור 4C iii).

אסטרוציטים מודפסים ביולוגית הוכתמו כדי להראות צפיפות תאים ומורפולוגיה של תאים בתוך המבנה. איור 5A מראה מבנה מודפס ביו-מודפס לאחר 7 ימים של דגירה, עם צפיפות גבוהה של אסטרוציטים מוכתמים בפאלודין, צבע ציטוסקלטון F-actin. למרות כמה תאים עגולים נצפו, אסטרוציטים הציגו בעיקר מורפולוגיה דמוית כוכב. אסטרוציטים מודפסים ביו-מודפסים הראו שהם חיוביים ל-GFAP כאשר הם מוכתמים לאחר 7 ימים של ביו-הדפסה, מה שמצביע על כך שהתאים שמרו על הפנוטיפ האסטרוציטי שלהם (איור 5B i). איור 5B ii ו- 5B iii מציגים את התמונות המוערמות ב- Z של אסטרוציטים GFAP+ מודפסים ביו-מודפסים בתוך המבנה. תוצאות אלה מצביעות על כך שהרכב הביו-וינק סיפק מיקרו-סביבה ביו-תואמת לקידום הידבקות, התפשטות וצמיחה של אסטרוציטים.

Figure 1
איור 1: הפקת הפרדת מוח וקליפת המוח לתרבות אסטרוציטים ראשונית. אסטרוציטים ראשוניים היו מבודדים מקליפת המוח של C57Bl/6 עכברים של גורים (לאחר הלידה יום 1) המוח. לאחר חילוץ המוח מן החיה, קרום המוח הוסרו תחת מיקרוסקופ, ואת קליפת המוח מופרדת ואחריו עיכול רקמות ותרבות אסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: איור סכמטי של תהליך ביו-הדפסה תלת-ממדי. (A)קובץ CAD המיועד להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של רקמות עצביות המציגות (i) 2 שכבות, תצוגה עליונה ו -6שכבות, מבט צדדי, של המבנה. (B)תמונות המציגות את יכולת הביוינק להדפיס מבנים של צורות שונות (i) מרובע, (ii) נימי, ו (iii) כוכב. (C)ערכת ביו-חומרים מקשרים לאחר הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, כאשר GelMA מוצלב תחת אור UV ואחריו פיברין מקשרים בתרומבין:Ca2+ אמבטיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדפסה תלת-ממדית של ג'לטין עמוס אסטרוציטים/ג'למה/פיברינוגן ביונק. (A)אפיון אסטרוציטים לאחר 12 ימים של בידוד ותרבות, מוכתם עבור GFAP, ירוק ו- DAPI, כחול. (B)(i) הגדרת ראש הדפסה ו (ii) מבנה מודפס בתלת-ממד מיד לאחר הדפסה ביולוגית. (B)מבנה דו-שכבתי המציג את המסגרת המודפסת ביולוגית. הגדלה של 4x. (C) תמונה של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית יום אחד לאחר הדפסה ביולוגית, המציגה תאים במורפולוגיה עגולה. (D)תמונה של אסטרוציטים מודפסים ביולוגית 7 ימים לאחר תהליך הביו-הדפסה, המציגים תאים עם מורפולוגיה אסטרוציטית עם מעט תאים עגולים, מה שמצביע על זיקתם לרקמת הפנטיקה. הגדלה של פי 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הערכת הכדאיות של אסטרוציטים מודפסים ביו-מודפסים. (א) הכדאיות של אסטרוציטים ביוהדפסה במהירויות שונות. (B)הכדאיות של אסטרוציטיםמודפסים ביו-מודפסים ביום 0 (מיד לאחר הדפסה ביולוגית) ו - (ii) לאחר 7 ימים של ביו-הדפסה, מנורמלת לתרכות של אסטרוציטים בתרבות 2D. ניתוח סטטיסטי באמצעות Anova חד כיווני עם המבחן של טוקי, n = 3, *p < 0.05. (ג)תמונות פלואורסצנטיות של אסטרוציטים מוכתמים עם ריאגנט חי / מת. אסטרוציטים מודפסים ביולוגיתביום 0 (מיד לאחר ביו-הדפסה), (ii) יום 7, ו -( iii) תרבית 2D של אסטרוציטים. הגדלה של פי 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אפיון אסטרוציטים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית. אימונופלואורסצנטיות של אסטרוציטים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית לאחר 7 ימים של דגירה מוכתמת עבור (A)F-actin (פאלואידין, אדום) וגרעינים (DAPI, כחול) עם הגדלה של 10x ו- 40x ול עבור (B)GFAP, ירוק (i) עם הגדלה של 10x, (ii) Z-מוערם המציג את ציר X-Y-Z של המבנה המודפס ביולוגית, ו -( iii) תמונה המציגה את ציר X-Z של אסטרוציטים GFAP + . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכנולוגיית הביו-הדפסה התת-ממדית התפתחה כחלופה ביו-פיברית המאפשרת הנדסת מבנים מעודנים הדומים מבחינה מבנית ופיזיולוגית לרקמות מקומיות22, כולל המוח23. biofabrication של רקמות דמויי עצבים מאפשר הנדסה במבחנה מיקרו-וירוסמנט מקומי מודלים, להיות כלי חשוב להבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים הקשורים להתפתחות וטיפול במחלות רבות המשפיעות על מערכתהעצבים 11. בשל התפקיד החשוב של תאי גליה בפונקציונליות עצבית, אסטרוציטים קליפת המוח שימשו במחקרים רבים, כגון התפתחות המוח24, ביומולקולס להעביר25, נויריט תולדה26, ובביו-ביו-שברון רקמות דמויי מוח14.

שיטות להנדסת תרבות תלת מימד של אסטרוציטים דווחו בעבר, באמצעות ביו-חומרים שונים וטכניקות פיגומים27,28,29. באופן דומה, דווחה גם שיטה להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) עצביים שמקורם בה, והראתה את היכולת של תאים מודפסים ביולוגיים אלה להבדיל ולהתבגר במבחנה30. עם זאת, אין דיווחים על שיטות לביו-פיבריות של מבנים אסטרוציטים תלת-ממדיים בספרות. לאחר מכן, פרוטוקול זה נועד לתאר שיטה לשחזור עבור אסטרוציטים קליפת המוח הדפסה ביולוגית 3D.

בפרוטוקול זה, אסטרוציטים היו מבודדים מן הקורטיס המוחי של C57Bl / 6 גורים עכברים, מודל בעלי חיים בשימוש נרחב במחקר31,32, אשר ניתן להחליף על ידי אסטרוציטים נגזר ממקורות אחרים, כגון hiPSCs וחוט השדרה. לאחר בידוד, תרבות ותת-תרבות, אסטרוציטים נשארים במצב שגשוג עד מעבר 3, שהוא המספר המרבי של פיצול מומלץ בשל המגבלה המהותית שלהם שלהתפשטות 8. זה אומת כי התפשטות של אסטרוציטים ממעבר 4 היה מוגבל, להיות קשה להשיג את הכמות הרצויה של תאים עבור הדפסה ביולוגית 3D.

בשיטה המתוארת, ריכוז של 1.0 x 106 תאים / מ"ל של פתרון ביו-חומרים שימש, כהוכחה של מושג כדי להעריך את היכולת של תאים לשרוד את תהליך הביוהדפסה ולשמור על הכדאיות שלהם ואת המאפיינים המהותיים במהלך התרבות בתוך הידרוג'ל. בעבודה הקודמת, רקמה עצבית דמוית ביו-הדפסה תלת-ממדית הודפסה ביולוגית על ידי אסטרוציטים ותאי עצב פולחניים, ולהגברת האינטראקציה התאית, ריכוז אסטרוציטים היה 8.0 x 106 תאים /mL14. לאחר מכן, ריכוז התאים עשוי להיות מותאם למחקרים ספציפיים.

ביו-סינק להדפסה תלת-ממדית מורכב מתאים וביו-חומרים או שילוב של ביו-חומרים33. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשילוב של ג'לטין/ GelMA / פיברינוגן, אשר הראה להיות חיובי הן עבור ביו הדפסה ושמירה על אסטרוציטים בתרבות. הייצור של ביו-הדפסה ביולוגית הוא מאתגר בעת שימוש בטכניקת ביו-הדפסה מבוססת שחול. הרכב biomaterial חייב להיות בעל תכונות ויסקולאסטיות, באותו זמן, לאפשר שחול של bioink, תוך שמירה על הצורה 3D לאחר תהליך ההדפסה34. בנוסף, זה צריך להיות מסוגל לשמור על כדאיות התא במהלך התהליך, אשר בהתאם לתנאי ביוהדפסה, יכול לגרום ללחץ גיסת לתאיםהמובילים למוות 35.

יכולת הדפסה ביולוגית הובטחה על ידי ג'לטין, ביו-חומרים בעלי תכונות ויסקוליות אופטימליות בשל יכולת המעבר של סול-ג'ל36. זה מאפשר macromolecules ג'לטין לסדר מחדש ולהתנהג כנוזל במהלך שחול, וכג'ל לאחר ביוהדפסה, שמירה על המבנה 3D. בנוסף, כמו קולגן נגזר, ג'לטין מורכב של חומצת אמינו גליצין פפטיד חזרות שלישייה, אשר מבטיחים ספציפיות לתא21. עם זאת, קשרים תוך-עיניים ובין-מולקולריים של ג'לטין חלשים, ובשל יכולת ההסרה שלו, לג'לטין אין יציבות ב-37 מעלות צלזיוס, ומשתחררים מהמבנה במהלך תרבית התא. לכן, GelMA הפך חלופה כמו הידרוג'ל יציב, בשל קשרים covalent שנוצרו לאחר תערוכת אור UV, שמירה על תכונות ספציפיות לתא19. המאפיינים הפיזיים של GelMA, כגון נקבוביות, השפלה, מודולוס אלסטי ניתן לכוונן כדי להתאים יישומים שונים הנדסתרקמות 19. נוקשות של פיגומי GelMA ניתן לשלוט על ידי שינוי תחליף מתיאקרילויל37, המאפשר להשיג נוקשות דומה לזו של הרקמה להיות מודל. כלומר, על ידי הפחתת מידת הפונקציונליזציה, נוקשות נמוכה יותר ניתן להשיג37. לכן, בשל הרכות של מוח העכבר38,39 ואת ההשפעה הישירה של נוקשות מטריצה חוץ תאית (ECM) על התנהגות התא40, בפרוטוקול זה הוצעה רמה נמוכה של פונקציונליזציה ג'לטין. בעבודות הקודמות, היכולת של הידרוג'ל GelMA לחקות תכונות פיזיות של מערכת העצבים, מראה התאמה גבוהה עבור אסטרוציטים פולחן, נוירונים, ותאי גזע עצביים14,41,42 דווח.

מלבד GelMA, פיברינוגן, ביופולימר מקומי היוצר סיבי פיברין באמצעות תגובה אנזימטית, שימש גם לביו-פבריקט של רקמה דמוית עצב, מראה ייחודיות גבוהה ומציע מיקרו-סביבה מתאימה לתאים עצביים לחבר ולגדול30,43,44. ביו-חומרים אחרים, כגון אלגינט וצ'יטוסן שימשו לרקמות דמויי ביו-הדפסה, מעורבבים לג'לטין, GelMA ו/או פיברינוגן, במטרה לשפר את יכולת ההדפסה ואת התכונות הפיזיות של הפיגומים3D 14,30. בשיטה הנוכחית, ביו-הדפסה אופטימלית, יציבות פיזית וספציפיות לתאים הושגה באמצעות ג'לטין, גלמ"א ופיברינוגן כרכיבים של הביו-ink. על מנת להגביר את ההכרה של אסטרוציטים למיקרו-סביבה, למינין-מרכיב של המוח ECM-שימש כדי להשלים את הביו-ink.

בפרוטוקול זה, ג'לטין שימש בריכוז של 4% (w / v), אשר אפשר את המעבר סול-ג'ל של bioink ב 25 °C (55 °F) בתוך כ 10 דקות. ג'לציה מהירה יותר ניתן להשיג על ידי הגדלת הריכוז של ג'לטין. עם זאת, עיקור על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר יכול להיות בסכנה. סינון הביו-וינק הוא צעד קריטי, המוודא שריכוזים גבוהים יותר של ג'לטין (>5% w/v) עשויים למנוע סינון. חלופה להשגת נקודת ג'לציה מהירה יותר במהלך הדפסה ביולוגית היא להשאיר את המזרק המכיל את הביוינק ב 4 °C (75 °F) במשך 2 דקות לפני חיבורו בראש ההדפסה ביו הדפסה. לאחר ביו-הדפסה, חיוני לשמור על המבנה ב 25 °C (70 °F) כדי למנוע ערעור המבנה 3D ולשמור על מצב gelled לפני תערוכת UV. ראוי לציין, המבנה צריך להיות מוצק כאשר פתרון crosslinker פיברינוגן מתווסף לצלחת. עבור קישור GelMA, חשוב להפוך את המדגם (2 x 60 s לכל צד) כדי להבטיח תערוכת UV לאורך כל המבנה. עבור קישור פיברינוגן, פתרון crosslinker צריך לכסות את המבנה לחלוטין. לכן, אם משתמשים בצלחת או צלחת גדולה יותר, יש לכוונן את עוצמת הקול. לאחר crosslinking, הידרוג'ל צריך להיראות הומוגני תחת מיקרוסקופיה ניגוד פאזה ותאים צריכים להיות מופצים הומוגנית ברחבי המבנה, בעל מורפולוגיה עגולה.

פרוטוקול זה אפשר ביו-ink ג'לטין/ GelMA / פיברינוגן להדפיס מבנים של צורות שונות, תוך שמירה על שלמות ועל הצורה 3D של המבנים. בשל מגבלות הטמפרטורה להגיע 25 °C (5 °F) בתוך זרימת למינאר, הביו-הדפסה בוצעה בחדר התרבות מחוץ לזרם למינאר. זמן הביו-הדפסה היה כדקה אחת עבור כל דגימה, ולא נצפה זיהום במהלך תרבית התא.

שלמות התא יכולה להיות מושפעת מהדפסה ביולוגית, בשל לחץ הגימרה שנגרם בתהליך35. ניתן לשלוט באפשרות זו על-ידי מיטוב פרמטרי ההדפסה, כגון מהירות ההדפסה. בעבודה זו נבדקו מהירויות ביו-הדפסה שונות, 400, 600 ו-800 מ"מ/דקה, תוך התבוננות בירידה משמעותית בכדאיות התאים כאשר המהירות עלתה מ-400 ל-600 מ"מ/דקה. ב 400 מ"מ / דקה, סביב 74% מהתאים נותרו קיימא לאחר ביוהדפסה, וערך זה עלה באופן משמעותי לאחר 7 ימים של דגירה (>80%). לכן, מהירויות נמוכות יותר לא שימשו על מנת למנוע את התערוכה המוגזמת של תאים לסביבה. תרבית הדו-כשל של אסטרוציטים הראתה כדאיות גבוהה יותר (כ-90%) בהשוואה לתאים המודפסים ביולוגית. עם זאת, כפי שמוצג על ידי תמונות פלואורסצנטיות, מורפולוגיה מושפעת מסוג התרבות. בעוד שתאי 2D היו שטוחים, אסטרוציטים בסביבת תלת-ממד היו בעלי צורה דמוית כוכב, התחברו זה לזה על ידי תהליכים תאיים.

ראוי לציין, microenvironment מיקמטי היה חיובי עבור תרבות אסטרוציטים קליפת המוח, כמו הכדאיות התא גדל באופן משמעותי לאחר שבוע אחד, מציע התפשטות תאים בתוך המבנה. למינין, גליקופרוטאין הנמצא במוח ECM, נוסף ל- bioink במטרה להשיג דבקות גבוהה יותר של אסטרוציטים להידרוג'ל14. כתמי ציטוסקלטון F-actin הראו כי אסטרוציטים מודפסים ביולוגית היו בצפיפות גבוהה בתוך המבנה, מה שמצביע על כך שריכוז התא המשמש בפרוטוקול זה אפשר חיבור אסטרוציטים. אימונוהיסטוכימיה עבור לוקליזציה GFAP, סמן בקורלציה עם arborization הנרחב של אסטרוציטים היפרטרופיה התא45, אומת על ידי כתמי F-actin, הראה כי תאים הציגו מורפולוגיה אסטרוציטית טיפוסית, המציין כי מערכת 3D פנטית היה נוח עבור תאים לצרף ולהתנהג כמו בסביבה הטבעית שלהם.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר הליך יעיל ושחזורי עבור אסטרוציטים קליפת המוח ביו-הדפסה תלת-ממדית. בשל החשיבות של אסטרוציטים בתגובה neuroinflammation לפציעה, כמו גם בוויסות פונקציונליות עצבית, מחקרים מעורבים תא גליה זה יכול לתרום היבטים רבים בהבנת מחלות המשפיעות על CNS. לכן, מודל 3D במבחנה המוצג כאן הוא שימושי ביישומים עתידיים שמטרתם לחקור אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים, את הפונקציונליות של אסטרוציטים בפתולוגיות המוח, ואת הפוטנציאל של אסטרוציטים כיעדים טיפוליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP), מספרי מענקים 2018/23039-3 ו-2018/12605-8; המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq), מספרי מענקים 465656/2014-5 ו-309679/2018-4; ותיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES), קוד פיננסי 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 173 אסטרוציטים ביו-הדפסה תלת-ממדית ביו-פייברציה הנדסת רקמות רקמה עצבית מערכת העצבים המרכזית
הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter