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Bioengineering

इंजीनियरिंग न्यूरल-जैसे ऊतक के लिए मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की 3डी बायोप्रिंटिंग

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

यहां हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों और उपचारों में ग्लियल कोशिकाओं से जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका जैसे ऊतकों के लिए बायोफैब्रिकेट के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग मुरीन कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं।

Abstract

एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में एक आवश्यक भूमिका के साथ ग्लियल कोशिकाएं हैं, जिसमें न्यूरोनल समर्थन और कार्यक्षमता शामिल है। ये कोशिकाएं तंत्रिका चोटों का भी जवाब देती हैं और ऊतक को अपक्षयी घटनाओं से बचाने के लिए कार्य करती हैं। एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता के इन विट्रो अध्ययन ऐसी घटनाओं में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने और न्यूरोलॉजिकल विकारों के इलाज के लिए उपचार विकसित करने में योगदान देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल 3 डी बायोप्रिंटिंग एस्ट्रोसाइट्स-लादेन बायोइंक द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध तंत्रिका जैसी ऊतक संरचना को बायोफैब्रिकेट करने की विधि का वर्णन करता है। इस काम में एक एक्सट्रूशन-आधारित 3डी बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स C57Bl/6 चूहों पिल्ले के ब्रेन कॉर्टिस से निकाले गए थे । बायोइंक को कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को 3 से पारित होने तक जिलेटिन, जिलेटिन-मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) और फाइब्रिनोजेन से बना बायोमे्टरियल समाधान में मिलाकर तैयार किया गया था, जो लेमिनिन के साथ पूरक था, जिसने इष्टतम बायोप्रिंटिंग स्थितियां प्रस्तुत कीं। 3 डी बायोप्रिंटिंग स्थितियों ने सेल तनाव को कम किया, इस प्रक्रिया के दौरान एस्ट्रोसाइट्स की उच्च व्यवहार्यता में योगदान दिया, जिसमें बायोप्रिंटिंग के बाद 1.33% कोशिकाओं के 74.08% ± व्यवहार्य थे। इनक्यूबेशन के 1 सप्ताह के बाद, एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता काफी बढ़कर 3.00% ± 83.54% हो गई, जो यह दर्शाती है कि 3 डी निर्माण सेल विकास के लिए एक उपयुक्त माइक्रोएनवायरमेंट का प्रतिनिधित्व करता है। बायोमैटेरियल संरचना ने कोशिका लगाव और उत्तेजित एस्ट्रोसाइटिक व्यवहार की अनुमति दी, जिसमें कोशिकाओं ने विशिष्ट एस्ट्रोसाइट्स मार्कर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को व्यक्त किया और विशिष्ट एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान रखा। यह प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स में समृद्ध 3 डी तंत्रिका जैसे ऊतक को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक मूल्यवान विधि प्रदान करता है जो कोशिकाओं के देशी माइक्रोएनवायरमेंट जैसा दिखता है, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है जिसका उद्देश्य एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और न्यूरोलॉजिकल रोगों में शामिल तंत्र से उनके संबंध को समझना है।

Introduction

एस्ट्रोसाइट्स सेंट्रल नर्वस सिस्टम (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार हैं और मस्तिष्क होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। स्थायी न्यूरोनल समर्थन के अलावा, एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोट्रांसमीटर तेज को मॉडुल करने, रक्त-मस्तिष्क बाधा अखंडता को बनाए रखने और न्यूरोनल सिनेप्टोजेनेसिस1,2को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार हैं। सीएनएस सूजन में एस्ट्रोसाइट्स की भी एक आवश्यक भूमिका होती है, जो मस्तिष्क को चोटों का जवाब देता है, जो एस्ट्रोसिटरी रिएक्टिविटी या प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोग्लियोसिस3,4की ओर जाता है, एक चमकदार निशान बनाता है जो अपक्षयी एजेंटों के स्वस्थ ऊतकों को उजागर करने से रोकता है5। इस घटना के परिणामस्वरूप एस्ट्रोसाइट्स की जीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन6, 7में परिवर्तनहोताहै। इसलिए, एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता से जुड़े अध्ययन न्यूरोलॉजिक विकारों के इलाज के लिए उपचारों के विकास के लिए सहायक हैं।

इन विट्रो मॉडल न्यूरोलॉजिकल चोटों से संबंधित तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और हालांकि कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की सफल अलगाव और दो-आयामी (2डी) संस्कृति8 स्थापितकी गई है, यह मॉडल एक यथार्थवादी वातावरण प्रदान करने में विफल रहता है जो देशी कोशिका व्यवहार की नकल करता है और मस्तिष्क की जटिलता को पुन: पेश करताहै 9 . 2डी स्थिति में, खराब यांत्रिक और जैव रासायनिक समर्थन, कम सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन, और सेल सपाट बेसल-एपिकल ध्रुवीकरण की अनुपस्थिति के लिए अग्रणी, सेल सिग्नलिंग गतिशीलता और प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित करता है जिससे सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति बदल जाती है, जो उपचार10के प्रति प्रतिक्रिया से समझौता करती है। इसलिए, यह विकल्प है कि एक और अधिक यथार्थवादी तंत्रिका वातावरण प्रदान विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्लिनिक के लिए परिणामों का अनुवाद करने के लिए लक्ष्य ।

त्रि-आयामी (3 डी) कोशिका संस्कृति एक अधिक उन्नत मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है जो सीएनएस11सहित अंगों और ऊतकों की बढ़ी हुई निष्ठा सुविधाओं के साथ पुनः मृत्यु हो जाती है। ग्लियल संस्कृति के बारे में, 3 डी मॉडल एस्ट्रोसाइट्स आकृति विज्ञान, सेल बेसल-एपिकल ध्रुवता, और सेल सिग्नलिंग12, 13के रखरखाव में योगदानदेतेहैं। 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक देशी ऊतकों की संरचना और गुणों को फिर से बनाने के लिए कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स का उपयोग करके नियंत्रित तरीके से 3 डी जीवित ऊतकों को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा। इस तकनीक के प्रयोग से परिणामों की भविष्यवाणी में काफी सुधार हुआ है और इसने सीएनएस14 , 15,16पर लागू पुनर्योजी दवा में योगदान दिया है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति का विवरण दिया गया है । प्रोटोकॉल में जिलेटिन/जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (जेल्मा) /फाइब्रिनोजेन में एम्बेडेड एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि का भी विवरण दिया गया है, जो लेमिनिन के साथ पूरक है । इस काम में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स युक्त बायोमैटेरियल कंपोजिशन को प्रिंट करने के लिए एक्सट्रूस बेस्ड बायोप्रिंटर का इस्तेमाल किया गया । प्रिंटिंग की गति को नियंत्रित करके बायोप्रिंटिंग कतरनी तनाव को कम किया गया था, और एस्ट्रोसाइट्स ने प्रक्रिया के बाद उच्च व्यवहार्यता दिखाई। बायोप्रिंटेड निर्माण 1 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे, और एस्ट्रोसाइट्स हाइड्रोगेल के भीतर फैलने, संलग्न करने और जीवित रहने में सक्षम थे, एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान को बनाए रखते थे और एक विशिष्ट मार्कर ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी)4व्यक्त करते थे।

यह प्रक्रिया पिस्टन-संचालित एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर के साथ संगत है और इसका उपयोग विभिन्न स्रोतों से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स को बायोप्रिंट करने के लिए किया जा सकता है। यहां प्रस्तावित 3 डी बायोप्रिंटेड मॉडल तंत्रिका इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है, जैसे स्वस्थ ऊतकों में एस्ट्रोसाइट्स कार्यक्षमता में शामिल तंत्र का अध्ययन और न्यूरोलॉजिकल विकृतियों और उपचार विकास की प्रगति को समझना।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं ने अनुसंधान (http://www.iclas.org) में पशु उपयोग के लिए अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन किया और यूनीवर्सिडे फेडरल डी साओ पाउलो (सीईआ 2019/9292090519) के अनुसंधान में नैतिकता के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. चूहों मस्तिष्क विच्छेदन

  1. कोल्ड हैंक्स बफर्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) के 10 एमएल को 100 एमएम कल्चर डिश और 1 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में ट्रांसफर करें। प्रति पशु एक माइक्रोट्यूब तैयार करें।
    नोट: संस्कृति पकवान और माइक्रोट्यूब दोनों को बर्फ पर रखने की जरूरत है ।
  2. डीएमईएम एफ 12 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2% ग्लूटामीन, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति माध्यम तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके माध्यम को स्टरलाइज करें।
  3. एक तेज ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग करके डेपुटेशन द्वारा C57Bl/6 चूहों पिल्ले (प्रसवोत्तर दिन 1) को इच्छामृत्यु दें। संदंश का उपयोग करना, त्वचा को खींचें और खोपड़ी का पर्दाफाश करें। सुनिश्चित करें कि कैंची और संदंश दोनों 70% इथेनॉल के साथ निष्फल हैं।
  4. एक तेज घुमावदार टिप कैंची का उपयोग कर sagittal विमान के साथ सिर के शीर्ष करने के लिए foramen मैग्नम से खोपड़ी काटें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एन्सेफेलिक ऊतक क्षतिग्रस्त नहीं है।
  5. पहले इथेनॉल 70% के साथ निष्फल एक स्पैटुला का उपयोग करना, कपाल गुहा से मस्तिष्क को उठाएं और इसे 10 एमएल ठंडे एचबीएसएस वाले संस्कृति पकवान में रखें।
  6. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे मस्तिष्क युक्त संस्कृति पकवान रखें, और दो कुंद टिप संदंश का उपयोग कर, मस्तिष्क से मेनिंग्स को हटादें (चित्र 1)।
  7. एक स्पैटुला का उपयोग करके मस्तिष्क की औसत रेखा से धीरे-धीरे उन्हें रोलिंग करके मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से कॉर्टिस को अलग करें।
  8. दोनों कोर्टिस को इकट्ठा करें और तुरंत उन्हें एक ही माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल कोल्ड एचबीएसएस होता है।

2. एस्ट्रोसाइट्स अलगाव और संस्कृति

  1. लैमिनार प्रवाह के तहत, कॉर्टिकल ऊतक को घुमावदार माइक्रो कैंची का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में काट लें, और उन्हें 3x के ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एचबीबीएस के 1 एमएल से धोएं। ऊतक के बसने के लिए प्रतीक्षा करें। एचबीएसएस को हटाएं और ताजा एचबीबीएस जोड़ें, इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं।
  2. एचबीएसएस निकालें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्राइपसिन के 1 मिलील के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस बिंदु पर केवल ट्राइपसिन पाचन पर्याप्त है।
  3. यांत्रिक रूप से ऊतक को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे 15x द्वारा अलग करें।
    नोट: ऊतक का पूर्ण विघटन निलंबन टर्बिडिटी में वृद्धि और निलंबन में ऊतक के बड़े टुकड़ों की अनुपस्थिति से मनाया जाता है।
  4. समाधान को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें, एफबीएस की बराबर मात्रा जोड़कर ट्राइपसिन गतिविधि को बेअसर करें, और गैर-वियोजन टुकड़ों को हटाने के लिए 0.4 माइक्रोन के सेल छलनी फिल्टर में समाधान को फ़िल्टर करें।
  5. एस्ट्रोसाइट्स माध्यम के 1 एमएल के साथ फिल्टर धोएं, छलनी के माध्यम से पारित सेल निलंबन इकट्ठा करें, और इसे 200 x g और 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और एस्ट्रोसाइट्स कल्चर माध्यम के 1 मिलील में गोली को निलंबित करें।
  6. सेल निलंबन को टी-25 संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करें, माध्यम की मात्रा को 3.5 मिलील तक बनाएं, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  7. सुनिश्चित करें कि 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं का पालन कर रहे हैं। इसके बाद मीडियम को बदलकर हर 3 दिन में बदल लें।
  8. 7 दिनों के बाद, 1x पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोकर संस्कृति से माइक्रोग्लिया और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स को हटा दें।
  9. एस्ट्रोसाइट्स कल्चर मीडियम के साथ पीबीएस सॉल्यूशन को बदलें और रातभर 180 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर में कल्चर फ्लास्क छोड़ दें।
    नोट: एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति के लगभग 10-12 दिनों में एक ढुलमुल मोनोलेयर बनाते हैं।

3. जिलेटिन मेथाक्रिलोइल (GelMA) का संश्लेषण

  1. पोर्सिन त्वचा से प्राप्त जिलेटिन के 10 ग्राम वजन और पूर्ण विघटन तक 240 आरपीएम और 50 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर समाधान हलचल देकर पीबीएस के 100 मिलीएल में भंग करें।
  2. एक हुड के तहत, कम डिग्री कार्यात्मकता के लिए मेथाक्रिलिक एंहाइड्राइड (एमए) का 2 एमएल जोड़ें, और जिलेटिन पायस को 240 आरपीएम और 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हलचल करें।
    सावधानी: एमए खतरा बयान: H302 + H332 (हानिकारक अगर निगल लिया या साँस), H311 (त्वचा के साथ संपर्क में विषाक्त), ३१४ (गंभीर त्वचा जलता है और आंखों की क्षति का कारण बनता है), ३१५ (त्वचा जलन का कारण बनता है), H317 (एलर्जी त्वचा प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है), H318 (गंभीर आंखों की क्षति का कारण बनता है), 331 (विषाक्त अगर साँस), H332 (हानिकारक अगर साँस), H335 (श्वसन जलन का कारण हो सकता है) । हैंडलिंग दिशानिर्देश: P261 (सांस लेने की धूल/धुएं/गैस/धुंध/वाष्प/स्प्रे से बचें), P305 + P351 + P338 + P310 (यदि आंखों में: कई मिनट के लिए पानी के साथ सावधानी से कुल्ला । कॉन्टैक्ट लेंस निकालें, यदि वर्तमान और आसानी से करें। rinsing जारी रखें। तुरंत एक जहर केंद्र/डॉक्टर), P301 + P312 + P330 कॉल (यदि निगल: एक जहर केंद्र/डॉक्टर को फोन अगर आप अस्वस्थ महसूस करते हैं । मुंह कुल्ला) ।
    नोट: एमए बहुत धीरे जोड़ें, ड्रॉप से ड्रॉप करें।
  3. प्रीहीटेड पीबीएस (50 डिग्री सेल्सियस) के 100 मिलीएल में जिलेटिन-एमए समाधान को पतला करें ताकि अंतिम मात्रा के 200 एमएल प्राप्त किए जा सके और समाधान को 10 मिनट के लिए 240 आरपीएम और 50 डिग्री सेल्सियस पर हलचल करने दें।
  4. ~ 20 सेमी डायलिसिस झिल्ली (आणविक कटऑफ 12-14 केडीए) काटें और इसे नरम होने तक डिएकॉनाइज्ड पानी में भिगो दें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली को डिओनाइज्ड पानी से भरें कि कोई छेद या दोष नहीं हैं।
  5. एक फ़नल का उपयोग करके, झिल्ली में जिलेटिन-एमए समाधान स्थानांतरित करें।
    नोट: मिश्रण की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त स्थान छोड़ने वाले दोनों पक्षों को बंद करें।
  6. जिलेटिन-एमए समाधान युक्त झिल्ली को डायलिसिस के लिए 2 एल आसुत पानी के साथ एक कंटेनर में रखें, जिससे वे 5 दिनों (500 आरपीएम) के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर हलचल कर दें।
    नोट: पानी वाष्पीकरण से बचने के लिए कंटेनर को कवर करें।
  7. डिफाल्टर पानी को दिन में दो बार बदलें। हर बार, समरूपता के लिए झिल्ली को उल्टा करें।
  8. पांचवें दिन, 200 मिलील पूर्व गरम अल्ट्रापुरे पानी (40 डिग्री सेल्सियस) को डायलिज्ड जिलेटिन-एमए में मिलाएं, और इसे 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तक हिलाएं।
  9. जिलेटिन-एमए समाधान को 25 एमएल तक 50 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करें और ट्यूबों को 2 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रहने दें।
    नोट: लिओफिलाइजेशन की सुविधा के लिए ट्यूबों को क्षैतिज रूप से स्टोर करें।
  10. 3-5 दिनों के लिए जमे हुए समाधानों को Lyophilize करें और आर्द्रता से सुरक्षित लयोफिलाइज्ड जेलएमए को स्टोर करें।

4. बायोइंक तैयारी

नोट: बायोइंक के 1 एमएल प्राप्त करने के लिए, कम से कम 3 एमएल बायोमटेरियल समाधान बनाने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि फिल्ट्रेशन के दौरान नुकसान हो सकता है।

  1. फिब्रिनोजेन समाधान की तैयारी
    1. खारा समाधान (NaCl 0.9%) को डिओनाइज्ड पानी में तैयार करें, और 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए खारे समाधान के 1 एमएल में गोजातीय प्लाज्मा से 10 मिलीग्राम फाइब्रिनोजन को भंग करें।
      नोट: कांच के लिए फाइब्रिनोजेन एसोर्ब के रूप में, फाइब्रिनोजेन समाधान तैयार करने के लिए ग्लास फ्लास्क का उपयोग न करें।
    2. फाइब्रिनोजन के पूर्ण विघटन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के तहत समाधान छोड़ दें।
      नोट: फाइब्रिनोजेन विघटन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर ओवन के अंदर रखी रोटरी प्रणाली का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर फाइब्रिनोजन का चुंबकीय आंदोलन (180 आरपीएम) भी उपयुक्त है। इस स्थिति के तहत, 10 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन को भंग करने में लगभग 40 मिनट लगते हैं।
  2. जिलेटिन/जेल्मा समाधान की तैयारी
    1. जिलेटिन के 0.12 ग्राम वजन और 4% (w/v) जिलेटिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इसे पूर्व गरम पीबीएस (40 डिग्री सेल्सियस) के 1.9 मिलील में जोड़ें। विघटन की सुविधा के लिए भंवर।
    2. पायस को पूर्ण विघटन तक 40 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. 0.06 ग्राम लियोफिलाइज्ड गेल्मा का वजन करें और 2% (w/v) गेल्मा की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जिलेटिन समाधान में स्थानांतरित करें। विघटन की सुविधा के लिए भंवर।
    4. समाधान को पूर्ण विघटन तक 40 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. एस्ट्रोसाइट्स से लदे जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन बायोइंक की तैयारी
    1. 10 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान का पिपेट 0.9 एमएल और फाइब्रिनोजेन के 3 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जिलेटिन/गेल्मा समाधान में स्थानांतरित करें।
    2. फोटोनिइटिएटर (पीआई) के 0.015 ग्राम वजन और 0.5% (w/v) PI की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जिलेटिन/GelMA/fibrinogen समाधान के लिए स्थानांतरण। ट्यूब को ऊपर और नीचे फ्लिप करके समाधान मिलाएं और पीआई क्षरण से बचने के लिए इसे प्रकाश से सुरक्षित 40 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: अधिकतम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बायोइंक स्टॉक करें।
    3. लैमिनार प्रवाह के तहत, एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: छानने की अनुमति देने के लिए बायोमटेरियल समाधान 37-40 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।
    4. 15 एमएल शंकु नली में बायोमटेरियल सॉल्यूशन के 980 माइक्रोन ट्रांसफर करें।
    5. 100 μg/mL का स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए खारे समाधान में पतला लेमिनिन।
    6. पिपेट 20 μL लेमिनिन और बायोइंक युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए 2 μg/mL laminin की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
    7. बुलबुले से बचते हुए, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। यदि कोई बुलबुले बने रहते हैं, तो शंकु नली को 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। बायोइंक को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक रखें जब तक कि वह कोशिकाओं के साथ न मिलाए।
    8. 5 मिनट के लिए 0.05% ट्राइप्सिन के साथ प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स को ट्रिप्सिन करें।
      नोट: 1 से 3 अंश से एस्ट्रोसाइट्स का उपयोग करें।
    9. 1:1 के अनुपात में एफबीएस के साथ ट्राइप्सिन गतिविधि को बेअसर करें और कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। यह 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    10. कोशिकाओं की गणना करें और 1 x 106 कोशिकाओं को एक अलग शंकु नली में स्थानांतरित करें। यह 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    11. शंकु नली के नीचे धीरे-धीरे टैप करके, सेल पेलेट को निलंबित करने के लिए एक छोटी मात्रा (~ 200 माइक्रोन) छोड़ने वाले सुपरनैक्ट को हटा दें।
    12. कोशिकाओं वाली ट्यूब में जिलेटिन/जेल्मा/फाइब्रिनोजेन समाधान के 1 एमएल को स्थानांतरित करें और 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर औरनीचे पिपेट करें।

5. क्रॉसलिंकर समाधान की तैयारी

  1. थ्रोम्बिन पुनर्गठन
    1. 15 एमएल शंकु नली में 01% (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ बाँझ डिओनाइज्ड पानी में थ्रोम्बिन 100 यू/एमएल का स्टॉक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोट्यूब में स्टॉक।
      नोट: ग्लास के लिए थ्रोम्बिन एसोर्ब के रूप में, स्टॉक समाधान तैयार करने या एलिकोट्स स्टोर करने के लिए ग्लास फ्लास्क का उपयोग न करें।
  2. थ्रोम्बिन-सीसीएल2 समाधान की तैयारी
    1. पिपेट 100 माइक्रोन थ्रोम्बिन स्टॉक समाधान और 1 यू/एमएल थ्रोम्बिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ deionized पानी के 8.9 एमएल युक्त 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    2. डिओनाइज्ड वॉटर में 10% (w/v) CaCl2 सॉल्यूशन तैयार करें और ०.२ माइक्रोन फिल्टर का इस्तेमाल करके स्टरलाइज करें ।
    3. 1:9 (सीएसीएल2 से थ्रोम्बिन) का अंतिम अनुपात प्राप्त करने के लिए, थ्रोम्बिन युक्त शंकु नली में 10% सीएसीएल 2 समाधान के1.1 एमएल को स्थानांतरित करें।
      नोट: संग्रहण से बचने के लिए प्रयोग में उपयोग की जाने वाली मात्रा पर क्रॉसलिंकर समाधान तैयार करें।

6. एक एक्सट्रूसेशन-आधारित बायोप्रिंटर का उपयोग करके बायोप्रिंटिंग एस्ट्रोसाइट्स-लादेन बायोइंक

  1. तंत्रिका ऊतक का डिजाइन
    1. जी-कोड का उपयोग करना: एक्स और वाई-एक्सिस पर प्रत्येक बायोप्रिंटेड लाइन के बीच 1 मिमी दूरी के साथ 6 x 6 मिमी (चुकता आकार) के ग्रिड का निर्माण करें, और जेड-एक्सिस (प्रत्येक पंक्ति के बीच 0.2 मिमी) पर 6 परतें; एक्सट्रूज़न (ई) को 0.01 मिमी तक सेट करें, जेड-एक्सिस की प्रत्येक नई परत पर 0.001 मिमी बढ़ रहा है; और प्रिंटिंग स्पीड (एफ) को 400 मिमी/मिनट(पूरक सूचना)सेट करें ।
  2. बायोप्रिंटर सेट अप
    1. मशीन को 15 मिनट के लिए यूवी लाइट में बेनकाब करें, और फिर इसे इथेनॉल 70% से मिटा दें।
    2. पावर स्विच का उपयोग करके बायोप्रिंटर चालू करें। यूएसबी केबल के जरिए मशीन को कंप्यूटर से कनेक्ट करें। इसे बायोप्रिंटर से कनेक्ट करने और फाइल डिजाइन लोड करने के लिए कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
  3. बायोप्रिंटिंग सिरिंज की तैयारी
    1. एस्ट्रोसाइट्स से लदे जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन बायोइंक को १,००० माइक्रोन पिपेट का इस्तेमाल करते हुए 5 एमएल प्लास्टिक सिरिंज में ट्रांसफर करें ।
      नोट: बुलबुला गठन से बचने के लिए धीरे-धीरे स्थानांतरित करें।
    2. सिरिंज के लिए एक बाँझ 22 जी कुंद सुई कनेक्ट करें।
      नोट: सिरिंज को 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    3. सिरिंज को बायोप्रिंटर प्रिंटहेड से कनेक्ट करें और शेष बुलबुले को हटाने के लिए बायोइंक को मैन्युअल रूप से फ्लश करें।
  4. बायोप्रिंटिंग
    नोट: बायोप्रिंटिंग लैमिनार हुड के बाहर किया गया था।
    1. बायोप्रिंटर टेबल पर 35 मिमी कल्चर डिश रखें और सुई के आंदोलन की अनुमति देने के लिए सुई को संस्कृति पकवान सतह से 0.1 मिमी दूर रखें।
      नोट: प्रत्येक बायोप्रिंटिंग के लिए एक 35 मिमी संस्कृति पकवान का उपयोग करें।
    2. प्रिंट बटन दबाएं।
    3. एक बार बायोप्रिंटिंग खत्म होने के बाद, सुनिश्चित करें कि सिरिंज पकवान से दूर चले जाते हैं। फिर, कल्चर डिश को बंद करें और क्रॉसलिंकिंग प्रक्रिया के लिए तैयार करें।
      नोट: एक निर्माण की बायोप्रिंटिंग में लगभग 1 मिनट और 10 एस लगते हैं।
  5. बायोप्रिंटेड निर्माण और संस्कृति को क्रॉसलिंक करना
    1. गेल्मा क्रॉसलिंकिंग के लिए 2 x 60 एस (ऊपर और नीचे) के लिए2 mW/सेमी 2 पर यूवी लाइट के तहत कल्चर डिश रखें ।
    2. लैमिनार प्रवाह के तहत, एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके बायोप्रिंटेड निर्माण को 24-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    3. थ्रोम्बिन/सीएसीएल 2 समाधान के 500माइक्रोल जोड़ें और फाइब्रिन क्रॉसलिंकिंग की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    4. क्रॉसलिंकिंग समाधान निकालें और पीबीएस 1x के 2 एमएल के साथ निर्माण धोएं। फिर, पीबीएस को एस्ट्रोसाइट्स कल्चर मीडियम के 1 मिलील से बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें । हर 3 दिन में माध्यम बदलें।

7. एस्ट्रोसाइट्स व्यवहार्यता का आकलन

  1. बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता
    1. एक स्पैटुला का उपयोग करके बायोप्रिंटेड निर्माण को 35 मिमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
    2. 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ निर्माण धो लें।
    3. निर्माण के ऊपर लाइव/डेड रिएजेंट का 100 माइक्रोन जमा करें और इसे प्रकाश से सुरक्षित रखते हुए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. लाइव/डेड रिएजेंट निकालें और 1x पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ निर्माण को धोएं ।
    5. नमूना को एक स्पैटुला का उपयोग करके एक कॉन्फोकल डिश में स्थानांतरित करें, और छवियों के अधिग्रहण के लिए 488 और 570 एनएम उत्तेजन का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निर्माण के भीतर कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
      नोट: निर्माण के भीतर कोशिकाओं के समग्र दृश्य के लिए 10x के आवर्धन का उपयोग करें।
    6. सुनिश्चित करें कि नमूना फ्लैट बैठा है। यदि आवश्यक हो, तो फ्लैटनेस बढ़ाने के लिए नमूने के ऊपर एक कवरलिप रखें।
      नोट: इमेजिंग के दौरान, सुनिश्चित करें कि नमूने को सूखने से रोकने के लिए कॉन्फोकल डिश को अच्छी तरह से सील कर दिया गया है।
    7. कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके व्यवहार्य (हरे) और मृत (लाल) की संख्या की गणना करें।
  2. 2डी एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति की व्यवहार्यता
    1. बीज 0.5 x 106 एस्ट्रोसाइट्स (मार्ग 1-3) 35 मिमी कॉन्फोकल डिश में, एस्ट्रोसाइट्स माध्यम जोड़ें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
    2. जब कोशिकाएं संकुचित हों, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें और 1x पीबीएस के 1 एमएल से धोएं।
    3. लाइव/डेड रिएजेंट के २०० माइक्रोन जमा करें, और डिश को 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें, जो प्रकाश से सुरक्षित है ।
    4. लाइव/डेड रिएजेंट निकालें और 1x पीबीएस के 1 एमसीएल से कोशिकाओं को धोएं ।
    5. एक डिजिटल कैमरे के साथ मिलकर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए पकवान ले लो, और छवि अधिग्रहण के लिए ४८८ और ५७० एनएम उत्तेजन का उपयोग करें ।
    6. कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके व्यवहार्य (हरे) और मृत (लाल) की संख्या की गणना करें।

8. एस्ट्रोसाइट्स का इम्यूनोस्टेटिंग

  1. ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) 3 डी बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स का धुंधला
    नोट: अन्य सेल मार्कर की उपस्थिति की जांच करने के लिए, तदनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी बदलें।
    1. कुएं से माध्यम निकालें और 3x पीबीएस के 1 एमएल के साथ निर्माण धोएं।
    2. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को तब तक कुएं में जोड़ें जब तक कि निर्माण पूरी तरह से कवर न हो जाए और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए छोड़ दें।
    3. पीएफए निकालें और 3x पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ निर्माण धोएं।
      नोट: इस प्रक्रिया को कई महीनों के लिए रोका जा सकता है अगर PBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । सुनिश्चित करें कि पीबीएस वाष्पीकरण से बचने के लिए अच्छी तरह से प्लेट को सील कर दिया गया है।
    4. 5 मिनट के लिए ग्लाइसिन 0.1 मोल/एल के साथ नमूने का इलाज करें।
    5. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ धोएं।
    6. कक्षीय आंदोलन के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 10% एफबीएस वाले पीबीएस के साथ नमूना को पार करें।
    7. रात 4 डिग्री सेल्सियस पर चिकन एंटी-जीएफएपी (प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने 1:500) के साथ निर्माण को इनक्यूबेट करें।
    8. प्राथमिक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें और 5 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के 1 एमएल के साथ नमूना धोएं।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर कई बार पुन: इसया जा सकता है।
    9. एलेक्सा फ्लोरर 488-संयुग्मित एंटी-चिकन (माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने 1:500) और कक्षीय आंदोलन के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1 μg/mL DAPI के साथ नमूना इनक्यूबेट ।
      नोट: नमूना प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    10. 5 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के 1 एमएल के साथ नमूना धोएं।
    11. निर्माण को 35 मिमी कॉन्फोकल डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पकवान अच्छी तरह से बाहर सुखाने से नमूना रोकने के लिए सील कर दिया है ।
  2. ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) 2D एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति का धुंधला
    1. बीज 0.5 x 106 एस्ट्रोसाइट्स (मार्ग 1-3) 35 मिमी कॉन्फोकल डिश में, एस्ट्रोसाइट्स माध्यम जोड़ें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
    2. जब कोशिकाएं संकुचित हों, तो संस्कृति माध्यम को हटा दें और उन्हें 1x पीबीएस के 1 एमएल से धोएं।
    3. कदम 8.1.2-8.1.10 दोहराएं।
  3. एस्ट्रोसाइट्स साइटोस्केलेटन धुंधला
    1. दोहराएं कदम 8.1.1-8.1.6।
    2. पीबीएस में फ्लोरोसेंट-कंजूग्ड फॉलोइडिन समाधान के 50 माइक्रोन/एमएल और निर्माण पर डीएपीआई के 1 माइक्रोग्राम/एमएल जोड़ें।
    3. कक्षीय आंदोलन के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट, नमूना प्रकाश से संरक्षित रखते हुए।
    4. 5 मिनट 3 बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ नमूना धोएं, और एक स्पैटुला का उपयोग करके निर्माण को कॉन्फोकल डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पकवान अच्छी तरह से बाहर सुखाने से नमूना रोकने के लिए सील कर दिया है ।

9. कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. इमेजिंग (359, 488, और 570 एनएम उत्तेजन) के लिए एक डिजिटल कैमरे के साथ मिलकर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए व्यंजन लें।
  2. एक समग्र दृश्य के लिए 10x के आवर्धन का उपयोग करें और कोशिकाओं की ज़ूम छवियों के लिए 40 या 63x।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना फ्लैट बैठा है। यदि आवश्यक हो, तो फ्लैटनेस बढ़ाने के लिए नमूने के ऊपर एक कवरलिप रखें।

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Representative Results

इस काम का उद्देश्य 3डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके एक तंत्रिका जैसे ऊतक विकसित करना है ताकि परत-दर-परत प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स-लादेन जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन बायोइंक जमा किया जा सके । एस्ट्रोसाइट्स को चूहों पिल्ले(चित्रा 1)के सेरेब्रल कॉर्टेक्स से निकाला गया और अलग किया गया, जो बायोमटेरियल संरचना में जोड़ा गया, जिससे जीवित 3 डी निर्माण के बायोफैब्रिकेशन की अनुमति मिलती है।

कंप्यूटर-एडेड-डिज़ाइन (सीएडी) को जी-कोड(पूरक फ़ाइल)का उपयोग करके वर्ग आकार (0.6 x 0.6 मिमी) के एक परस्पर फ्रेम के रूप में विकसित किया गया था, जिसका लक्ष्य 1 मिमी के छिद्रों के साथ, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रसार को सुविधाजनक बनाने के लिए है। फ्रेम एक दूसरे के ऊपर रखी 6 परतों से बना था, हर परत में 90 डिग्री के कोण पर बदल रहा है(चित्रा 2A i)। डिजाइन की गई संरचना में लगभग 5 मिमी उच्च(चित्रा 2A ii)था, जिससे ऊतक हेरफेर की अनुमति मिली। बायोइंक संरचना ने विभिन्न आकृतियों(चित्रा 2 बी)के निर्माण के निर्माण की भी अनुमति दी।

जिलेटिन, जेल्मा और फाइब्रिनोजेन से बने बायोइंक की तैयारी में दो क्रॉसलिंकिंग कदम शामिल थे। सबसे पहले, गेल्मा को यूवी लाइट के तहत क्रॉसलिंक किया गया था, जिसमें इंटर और इंट्रामोल्यूलर सहसंयोजक बांड बनते हैं, इसके बाद फाइब्रिन क्रॉसलिंकिंग होती है। इस चरण में, थ्रोम्बिन एंजाइमेटिक रूप से फाइब्रिनोजेन चेन को झुकाता है, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रिन फाइबर17का गठन होता है, जो सीए2 + आयनों 18द्वारा स्थिर प्रतिक्रिया है। फिर, गेल्मा और फाइब्रिन फाइबर एक स्थिर इंटरपेनेटेड पॉलीमर नेटवर्क (आईपीएन) बनाते हैं, जो लेमिनिन के साथ पूरक होता है, सेल अटैचमेंट के लिए उपयुक्त समर्थन और19,20 (चित्रा 2 सी) फैलाता है।

बायोप्रिंटिंग से पहले, अलगाव के 12 दिनों के बाद, एस्ट्रोसाइट्स को GFAP की उपस्थिति की विशेषता थी, जो एस्ट्रोसाइट इंटरमीडिएट फिलामेंट्स4 (चित्रा 3 ए)का प्रोटीन घटक था। फिर, ट्राइप्सिनाइज्ड एस्ट्रोसाइट्स को 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमसीएल के घनत्व पर जिलेटिन/गेल्मा/फाइब्रिनोजेन समाधान के साथ मिलायागया, जिससे एस्ट्रोसाइट्स से लदे बायोइंक पैदा होते हैं । बायोइंक को 22 जी कुंद सुई से जुड़े 5 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित कर दिया गया था, जो बायोप्रिंटर प्रिंटहेड(चित्रा 3 बी i) की रचना करता था। सुई ने कोशिकाओं को उच्च कतरनी तनाव को रोकने और बिना किसी तरह के बायोइंक एक्सट्रूज़न की अनुमति दी।

जिलेटिन के चिपचिपा गुणों के कारण, जो उच्च तापमान पर तरल पदार्थ के रूप में और कम तापमान21पर जेल के रूप में व्यवहार करता है, बायोप्रिंटेड निर्माण ने आकार निष्ठा(चित्रा 3 बी ii)बनाए रखा। बायोइंक की लगातार दो परतों के बायोप्रिंटिंग के बाद, एक सुपरिभाषित संरचना(चित्रा 3सी)का गठन देखा गया, जिसमें बायोमैटेरियल के भीतर कोशिकाएं फंसी हुई थीं।

बायोप्रिंटिंग और क्रॉसलिंकिंग प्रक्रियाओं के बाद, निर्माण को एस्ट्रोसाइट माध्यम के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था, और बायोप्रिंटिंग के 1 दिन के बाद, अधिकांश कोशिकाओं ने अभी भी एक गोल आकृति विज्ञान(चित्रा 3 डी)प्रस्तुत किया। बायोप्रिंटेड मचानों ने इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद अखंडता बनाए रखी, और हालांकि कुछ गोल कोशिकाओं को देखा गया, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स की एक बड़ी संख्या पूरे निर्माण में फैल गई, जो एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान और इंटरकनेक्शन(चित्रा 3E)पेश करती है।

क्योंकि बायोप्रिंटिंग के मापदंडों, जैसे गति, सीधे सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है, विभिन्न बायोप्रिंटिंग गति (400, 600, और 800 मिमी/ व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या की गणना करके, एक कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन समय 0 (बायोप्रिंटिंग के ठीक बाद) किया गया था, और परिणामों से पता चला कि कम गति से, 400 मिमी/ व्यवहार्य कोशिकाओं ने कुल कोशिकाओं ± 1.33% के 74.08% का प्रतिनिधित्व किया, जो 600 और 800 मिमी/न्यूनतम (60.25% ± 1.93% और 62.94 ± क्रमशः 6.18%)(चित्रा 4A) (चित्रा 4A)पर बायोप्रिंटेड कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक है। इसलिए इस काम में 400 एमएम/मिनट की स्पीड का इस्तेमाल किया गया।

बायोप्रिंटिंग से पहले, 2डी सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स को व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में चिह्नित किया गया था, और बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता को इस स्थिति में सामान्य किया गया था। परिणामों से पता चला है कि 2डी संस्कृति ने 0.94% व्यवहार्य कोशिकाओं ± 90.98% प्रस्तुत किया। बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स (दिन 7) की व्यवहार्यता 3.00% ± 83.54% थी, जो 2D मूल्य के 0.92 ± 0.03 का प्रतिनिधित्व करता था, जो दिन 0 (0.81 ± 0.01)(चित्रा 4B)की तुलना में काफी अधिक था। लाइव/डेड रिएजेंट के साथ दाग एस्ट्रोसाइट्स की छवियां चित्रा 4Cमें प्रस्तुत की जाती हैं, और दिखाती हैं कि बायोप्रिंटिंग के बाद, कोशिकाओं के पास एक गोल आकृतिविज्ञान(चित्र 4सी i)था । इनक्यूबेशन के 1 सप्ताह के बाद, एस्ट्रोसाइट्स पूरे निर्माण(चित्रा 4C ii)में फैल गए, जो 2D संस्कृति(चित्रा 4C iii)से कोशिकाओं की एक अलग आकृति विज्ञान दिखाता है।

निर्माण के भीतर सेल घनत्व और सेल आकृति विज्ञान दिखाने के लिए बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स को दाग दिया गया था। चित्रा 5A इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद एक बायोप्रिंटेड निर्माण दिखाता है, जिसमें एस्ट्रोसाइट्स का उच्च घनत्व फालोइडिन, एफ-ऐक्टिन साइटोस्केलेटन डाई के साथ दाग दिया जाता है। हालांकि कुछ गोल कोशिकाओं को देखा गया, एस्ट्रोसाइट्स ने मुख्य रूप से एक स्टार जैसी आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया। बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स ने बायोप्रिंटिंग के 7 दिनों के बाद दाग लगने पर जीएफएपी सकारात्मक दिखाया, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं ने अपने एस्ट्रोसाइटिक फेनोटाइप(चित्रा 5B i)को बनाए रखा। चित्रा 5B ii और 5B iii निर्माण के भीतर बायोप्रिंटेड GFAP + एस्ट्रोसाइट्स की जेड-स्टैक्ड छवियों को दिखाते हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बायोइंक संरचना ने एस्ट्रोसाइट्स के आसंजन, प्रसार और विकास को बढ़ावा देने के लिए एक जैव संगत माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान किया।

Figure 1
चित्रा 1:प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति के लिए मस्तिष्क और कॉर्टेक्स जुदाई का निष्कर्षण। प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स C57Bl/6 चूहों पिल्ले ' (प्रसव के बाद दिन 1) मस्तिष्क के प्रांतस्था से अलग थे । जानवर से मस्तिष्क निकालने के बाद, मेनिंग्स को माइक्रोस्कोप के नीचे हटा दिया गया था, और ऊतक पाचन और एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति के बाद कॉर्टेक्स अलग हो गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। (A)सीएडी फाइल जो न्यूरल टिश्यू के 3डी बायोप्रिंटिंगकेलिए तैयार की गई है, जिसमें निर्माण की 2 लेयर, टॉप व्यू और(ii)6 लेयर, साइड व्यू दिखाया गया है । (ख)विभिन्न आकृतियों(i)वर्ग,(ii)केशिका, और(iii)स्टार की संरचनाओं को मुद्रित करने के लिए बायोइंक की क्षमता दिखाने वाली छवियां । (ग)3डी बायोप्रिंटिंग दिखाने के बाद बायोमैटेरियल्स की योजना क्रॉसलिंकिंग, जहां गेल्मा को यूवी लाइट के तहत क्रॉसलिंक किया जाता है और इसके बाद थ्रोम्बिन में फाइब्रिन क्रॉसलिंकिंग: Ca2 + बाथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एस्ट्रोसाइट्स-लादेन जिलेटिन/जिलेमा/फाइब्रिनोजेन बायोइंक की 3डी बोप्रिंटिंग । (ए)ए) ए) अलगाव और संस्कृति के 12 दिनों के बाद एस्ट्रोसाइट्स का लक्षण वर्णन, GFAP, हरे और DAPI, नीले रंग के लिए दाग । (B)(i)प्रिंटहेड सेटअप और(ii)3डी बायोप्रिंटेड निर्माण बायोप्रिंटिंग के ठीक बाद। (ख)बायोप्रिंटेड फ्रेम दिखाते हुए दो स्तरित निर्माण। 4x का आवर्धन।(C)बायोप्रिंटिंग एस्ट्रोसाइट्स की छवि बायोप्रिंटिंग के 1 दिन बाद, एक गोल आकृति विज्ञान में कोशिकाओं को दिखाती है। (घ)बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के 7 दिन बाद बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की छवि, कुछ गोल कोशिकाओं के साथ एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं को दिखाना, जो मिमेटिक ऊतकों के साथ उनकी आत्मीयता का संकेत देता है। 10x का आवर्धन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स व्यवहार्यता का आकलन। (क) विभिन्न गति से बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता। (ख)बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता(i)दिन 0 (बायोप्रिंटिंग के ठीक बाद) और(ii)बायोप्रिंटिंग के 7 दिनों के बाद, 2डी संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स की व्यवहार्यता को सामान्य बनाया गया है। तुकी के परीक्षण के साथ वन-वे एनोवा के माध्यम से सांख्यिकीय विश्लेषण, एन = 3, *पी < 0.05। (ग)लाइव/डेड रिएजेंट के साथ दाग एस्ट्रोसाइट्स की फ्लोरोसेंट छवियां । बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स(i)दिन 0 (बायोप्रिंटिंग के ठीक बाद),(ii)दिन 7, और(iii)एस्ट्रोसाइट्स की 2डी संस्कृति। 10x का आवर्धन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:3 डी बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स का लक्षण वर्णन। 7 दिनों के बाद 3 डी बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स इनक्यूबेशन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस(ए)एफ-ऐक्टिन (फ्लोइडिन, लाल) और नाभिक (DAPI, नीला) 10x और 40x के आवर्धन के साथ और(बी)GFAP, ग्रीन(i)10x के आवर्धन के साथ,(ii)जेड-स्टैक्ड बायोप्रिंटेड निर्माण के एक्स-वाई-जेड धुरी दिखा रहा है, और(iii)छवि जीएफएपी + एस्ट्रोसाइट्स के एक्स-जेड धुरी दिखा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

3डी बायोप्रिंटिंग तकनीक एक बायोफैब्रिकेशन विकल्प के रूप में उभरी है जो परिष्कृत निर्माणों की इंजीनियरिंग की अनुमति देता है जो संरचनात्मक और शारीरिक रूप से देशी ऊतकों के समानहोता है,जिसमें मस्तिष्क23शामिल है । तंत्रिका जैसे ऊतकों का बायोफैब्रिकेशन इन विट्रो नेटिव माइक्रोएनवायरमेंट मॉडलिंग के लिए अनुमति देता है, जो सीएनएस11को प्रभावित करने वाले कई बीमारियों के विकास और उपचार से जुड़े सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। तंत्रिका कार्यक्षमता में ग्लियल कोशिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, मस्तिष्क विकास24,बायोमॉलिक्यूल्स परिवहन 25, न्यूराइट आउटग्रोथ26और मस्तिष्क जैसे ऊतक बायोफैब्रिकेशन14जैसे कई अध्ययनों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स का उपयोग किया गया है।

एस्ट्रोसाइट्स की इंजीनियरिंग 3 डी संस्कृति के लिए तरीकों की सूचना पहले दी गई थी, विभिन्न बायोमैटेरियल्स और मचान तकनीकों का उपयोग करके27,28,29। इसी तरह, 3 डी बायोप्रिंटिंग मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) व्युत्पन्न तंत्रिका समुच्चय के लिए एक विधि भी सूचित किया गया था, और इन बायोप्रिंटेड कोशिकाओं की क्षमता को विट्रो30में अंतर और परिपक्व दिखाया । हालांकि, साहित्य में 3 डी ब्रिओप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स निर्माणों के बायोफैब्रिकेशन के तरीकों की कोई रिपोर्ट नहीं है। फिर, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य 3 डी बायोप्रिंटिंग कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लिए एक प्रजनन विधि का वर्णन करना है।

इस प्रोटोकॉल में, एस्ट्रोसाइट्स को C57Bl/6 चूहों पिल्ले के मस्तिष्क कॉर्टिस से अलग किया गया था, जो अनुसंधान31, 32में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एक पशु मॉडल है, जिसे हिप्ससी औररीढ़की हड्डी जैसे अन्य स्रोतों से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अलगाव, संस्कृति और उपसंस्कृति के बाद, एस्ट्रोसाइट्स 3 पारित होने तक एक प्रसारीय स्थिति में रहते हैं, जो प्रसार 8 की आंतरिक सीमा के कारणअनुशंसितबंटवारे की अधिकतम संख्या है। यह सत्यापित किया गया था कि मार्ग 4 से एस्ट्रोसाइट्स का प्रसार सीमित था, 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए कोशिकाओं की वांछित राशि प्राप्त करना मुश्किल था।

वर्णित विधि में, बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया से बचने और हाइड्रोगेल के भीतर संस्कृति के दौरान उनकी व्यवहार्यता और आंतरिक गुणों को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने और अवधारणा के प्रमाण के रूप में बायोमटेरियल समाधान की1.0 x 10 6 6 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता का उपयोग किया गया था। पिछले काम में, एक 3 डी बायोप्रिंटेड तंत्रिका जैसे ऊतक को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को सह-संस्कृति द्वारा बायोफैब्रिकेटेड किया गया था, और सेलुलर इंटरैक्शन को बढ़ाने के लिए, एस्ट्रोसाइट्स एकाग्रता 8.0 x 106 कोशिकाओं/एमएल14थी। फिर, विशिष्ट अध्ययनों के लिए कोशिकाओं की एकाग्रता को अनुकूलित किया जा सकता है।

3डी बायोप्रिंटिंग के लिए बायोइंक कोशिकाओं और बायोमैटेरियल या बायोमैटेरियल्स33के संयोजन से बना है। इस प्रोटोकॉल में जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन के संयोजन का इस्तेमाल किया गया, जिसमें संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स के बायोप्रिंटिंग और रखरखाव दोनों के लिए अनुकूल दिखाया गया । एक्सट्रूशन-आधारित बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करते समय बायोप्रिंटेबल बायोइंक का उत्पादन चुनौतीपूर्ण है। बायोमटेरियल संरचना में चिपचिपा गुण होने चाहिए, जो एक ही समय में, प्रिंटिंग प्रक्रिया34के बाद 3 डी आकार को बनाए रखते हुए बायोइंक के निष्कासन की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, यह प्रक्रिया के दौरान कोशिका व्यवहार्यता बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए, जो बायोप्रिंटिंग स्थितियों के आधार पर, कोशिकाओं को कतरनी तनाव पैदा कर सकता है जिससे मृत्यु35हो सकती है।

बायोप्रिंटेबिलिटी को जिलेटिन द्वारा आश्वस्त किया गया था, एक बायोमटेरियल जिसमें सोल-जेल संक्रमण क्षमता36के कारण इष्टतम चिपचिपा गुण होते हैं। यह जिलेटिन मैक्रोमॉलिक्यूल्स को एक्सट्रूशन के दौरान तरल पदार्थ के रूप में पुनर्व्यवस्थित करने और व्यवहार करने की अनुमति देता है, और बायोप्रिंटिंग के बाद जेल के रूप में, 3 डी संरचना को बनाए रखता है। इसके अलावा, कोलेजन व्युत्पन्न के रूप में, जिलेटिन ग्लाइसिन-अमीनो एसिड पेप्टाइड ट्रिपल पुनरावृत्ति से बना है, जो सेल-विशिष्टता21को आश्वस्त करता है। हालांकि, जिलेटिन के अंतर और अंतरमॉलीयरीय बंधन कमजोर हैं, और इसकी तरमोर्वरेबिलिटी के कारण, जिलेटिन में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोई स्थिरता नहीं है, सेल संस्कृति के दौरान निर्माण से जारी किया जा रहा है। इसलिए, गेल्मा यूवी लाइट प्रदर्शनी के बाद गठित सहसंयोजक बांड के कारण, सेल-विशिष्टता गुणों कोबनाएरखने के कारण एक स्थिर हाइड्रोगेल के रूप में एक विकल्प बन गया। गेल्मा के भौतिक गुण, जैसे कि पोरोसिटी, क्षरण और लोचदार मॉड्यूलस को विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों19के अनुरूप ट्यून किया जा सकता है। गेल्मा मचानों की कठोरता को मेथाक्रिलोइल प्रतिस्थापन37को अलग करके नियंत्रित किया जा सकता है, जिससे ऊतक के समान कठोरता को मॉडलिंग किया जा सकता है। यही है, कार्यात्मकता की डिग्री को कम करके, कम कठोरता प्राप्त की जा सकतीहै। इसलिए, माउस मस्तिष्क की कोमलता38,39 और सेल व्यवहार40पर बाहृशिक मैट्रिक्स (ईसीएम) कठोरता के प्रत्यक्ष प्रभाव के कारण, इस प्रोटोकॉल में जिलेटिन कार्यात्मकता की कम डिग्री का प्रस्ताव किया गया था। पिछले कार्यों में, सीएनएस भौतिक सुविधाओं की नकल करने के लिए गेल्मा हाइड्रोगेल्स की क्षमता, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और तंत्रिका स्टेम सेल14, 41,42 को बनाने के लिए उच्च उपयुक्तता दिखाता है।

गेल्मा के अलावा, फाइब्रिनोजेन, एक देशी बायोपॉलिमर जो एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के माध्यम से फाइब्रिन फाइबर बनाता है, का व्यापक रूप से उपयोग तंत्रिका जैसे ऊतकों को बायोफैब्रिकेट करने के लिए भी किया गया है, जो उच्च विशिष्टता दिखाता है और तंत्रिका कोशिकाओं को30, 43,44को संलग्न करने और विकसित करने के लिए उपयुक्त माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करता है। एल्गिनेट और चिटोसन जैसे अन्य बायोमैटेरियल्स का उपयोग तंत्रिका जैसे ऊतकों को बायोप्रिंट करने के लिए किया गया है, जो जिलेटिन, जेल्मा और/या फाइब्रिनोजन में मिश्रित हैं, जिसका लक्ष्य 3 डी मचान14,30के प्रिंटेबिलिटी और भौतिक गुणों में सुधार करना है। वर्तमान विधि में, बायोइंक के घटकों के रूप में जिलेटिन, जेल्मा और फाइब्रिनोजेन का उपयोग करके एक इष्टतम बायोप्रिंटेबिलिटी, भौतिक स्थिरता और सेल-विशिष्टता हासिल की गई थी। माइक्रोएनवायरमेंट के लिए एस्ट्रोसाइट्स की मान्यता बढ़ाने के लिए, लेमिनिन-ब्रेन ईसीएम का एक घटक-बायोइंक के पूरक के लिए इस्तेमाल किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में, जिलेटिन का उपयोग 4% (w/v) की एकाग्रता पर किया गया था, जिसने लगभग 10 मिनट के भीतर 25 डिग्री सेल्सियस पर बायोइंक के सोल-जेल संक्रमण की अनुमति दी थी। जिलेटिन की एकाग्रता बढ़ाकर तेजी से जेलेशन हासिल किया जा सकता है। हालांकि, 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके निस्पंदन द्वारा नसबंदी से समझौता किया जा सकता है। बायोइंक निस्पंदन एक महत्वपूर्ण कदम है, यह सत्यापित करता है कि जिलेटिन (>5% w/v) की उच्च सांद्रता निस्पंदन को रोक सकती है । बायोप्रिंटर प्रिंटिंग के दौरान तेजी से जेलेशन पॉइंट प्राप्त करने का एक विकल्प बायोप्रिंटर प्रिंटहेड पर कनेक्ट करने से पहले 2 मिनट के लिए बायोइंक युक्त सिरिंज को 2 मिनट के लिए छोड़ना है। बायोप्रिंटिंग के बाद, 3 डी संरचना को अस्थिर करने से बचने और यूवी प्रदर्शनी से पहले एक गेलेड स्थिति बनाए रखने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर निर्माण को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, निर्माण ठोस होना चाहिए जब फाइब्रिनोजेन क्रॉसलिंकर समाधान प्लेट में जोड़ा जाता है। गेल्मा क्रॉसलिंकिंग के लिए, पूरे निर्माण में यूवी प्रदर्शनी सुनिश्चित करने के लिए नमूना (2 x 60 एस प्रत्येक पक्ष) को फ्लिप करना महत्वपूर्ण है। फाइब्रिनोजेन क्रॉसलिंकिंग के लिए, क्रॉसलिंकर समाधान को पूरी तरह से निर्माण को कवर करना चाहिए। इसलिए, यदि एक बड़ी डिश या प्लेट का उपयोग करते हैं, तो वॉल्यूम को समायोजित किया जाना चाहिए। क्रॉसलिंकिंग के बाद, हाइड्रोगेल को चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत सजातीय दिखना चाहिए और कोशिकाओं को पूरे निर्माण में सजातीय रूप से वितरित किया जाना चाहिए, जिसमें एक गोल आकृति विज्ञान हो।

इस प्रोटोकॉल ने जिलेटिन/जेल्मा/फिब्रिनोजेन बायोइंक को विभिन्न आकृतियों की संरचनाओं को मुद्रित करने, अखंडता को बनाए रखने और निर्माणों के 3 डी आकार की अनुमति दी । लेमिनार प्रवाह के अंदर 25 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए तापमान की सीमाओं के कारण, लैमिनार प्रवाह के बाहर संस्कृति कक्ष में बायोप्रिंटिंग किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए बायोप्रिंटिंग समय लगभग 1 मिनट था, और सेल संस्कृति के दौरान कोई संदूषण नहीं देखा गया था।

इस प्रक्रिया में होने वाले कतरनी तनाव के कारण सेल अखंडता बायोप्रिंटिंग से प्रभावित हो सकती है35। इसे प्रिंटिंग मापदंडों को अनुकूलित करके नियंत्रित किया जा सकता है, जैसे मुद्रण गति। इस कार्य में, विभिन्न बायोप्रिंटिंग गति का परीक्षण किया गया, 400, 600, और 800 मिमी/ 400 मिमी/मिनट पर, लगभग 74% कोशिकाएं बायोप्रिंटिंग के बाद व्यवहार्य रहीं, और इनक्यूबेशन के 7 दिनों (>80%) के बाद यह मूल्य काफी बढ़ गया। इसलिए, पर्यावरण के लिए कोशिकाओं की अत्यधिक प्रदर्शनी से बचने के लिए कम गति का उपयोग नहीं किया गया था। एस्ट्रोसाइट्स की 2डी संस्कृति ने बायोप्रिंटेड कोशिकाओं की तुलना में उच्च व्यवहार्यता (~ 90%) दिखाई। हालांकि, जैसा कि फ्लोरोसेंट छवियों द्वारा दिखाया गया है, आकृति विज्ञान संस्कृति के प्रकार से प्रभावित है। जबकि 2D कोशिकाएं सपाट थीं, 3 डी वातावरण में एस्ट्रोसाइट्स के पास एक स्टार जैसी आकृति थी, जो सेलुलर प्रक्रियाओं द्वारा एक दूसरे के साथ आपस में जोड़ती थी।

विशेष रूप से, मिमेटिक माइक्रोएनवायरमेंट कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स संस्कृति के लिए अनुकूल था, क्योंकि 1 सप्ताह के बाद सेल व्यवहार्यता में काफी वृद्धि हुई, जिससे निर्माण के भीतर सेल प्रसार का सुझाव दिया गया। लेमिनिन, मस्तिष्क ईसीएम में मौजूद ग्लाइकोप्रोटीन, बायोइंक में जोड़ा गया था, जिसका लक्ष्य हाइड्रोजेल14के एस्ट्रोसाइट्स का उच्च पालन प्राप्त करना था। साइटोस्केलेटन एफ-ऐक्टिन स्टेनिंग से पता चला कि बायोप्रिंटेड एस्ट्रोसाइट्स निर्माण के भीतर उच्च घनत्व में थे, यह दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सेल एकाग्रता ने एस्ट्रोसाइट्स इंटरकनेक्शन की अनुमति दी। GFAP स्थानीयकरण के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एस्ट्रोसाइट्स के व्यापक आर्बोराइजेशन और सेल हाइपरट्रॉफी45के साथ सहसंबद्ध एक मार्कर, एफ-ऐक्टिन स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं ने विशिष्ट एस्ट्रोसाइटिक आकृति विज्ञान प्रस्तुत किया, यह दर्शाता है कि मिमेटिक 3 डी प्रणाली कोशिकाओं को अपने मूल वातावरण में संलग्न और व्यवहार करने के लिए अनुकूल थी।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल 3 डी बायोप्रिंटिंग कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य प्रक्रिया का वर्णन करता है। चोट के लिए न्यूरोइंफ्लैमेशन प्रतिक्रिया में एस्ट्रोसाइट्स के महत्व के साथ-साथ न्यूरोनल कार्यक्षमता को विनियमित करने के कारण, इस ग्लियल सेल से जुड़े अध्ययन सीएनएस को प्रभावित करने वाली बीमारियों की समझ में कई पहलुओं में योगदान दे सकते हैं। इसलिए, यहां प्रस्तुत 3 डी इन विट्रो मॉडल भविष्य के अनुप्रयोगों में उपयोगी है जिसका उद्देश्य एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन, मस्तिष्क विकृतियों में एस्ट्रोसाइट्स की कार्यक्षमता और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में एस्ट्रोसाइट्स की क्षमता का अध्ययन करना है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP), अनुदान संख्या 2018/23039-3 और 2018/12605-8 द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद (CNPq), अनुदान संख्या 465656/2014-5 और 309679/2018-4; और उच्च शिक्षा कर्मियों (CAPES), वित्तीय कोड 001 के सुधार के लिए समन्वय।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

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References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 173 एस्ट्रोसाइट्स 3 डी बायोप्रिंटिंग बायोफैब्रिकेशन ऊतक इंजीनियरिंग तंत्रिका ऊतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र
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de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

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