Summary
ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。
Abstract
アストロサイトは、神経の支持および機能性を含む中枢神経系(CNS)に不可欠な役割を持つグリア細胞である。これらの細胞はまた、神経損傷に応答し、変性事象から組織を保護するために作用します。アストロサイトの機能性の インビトロ 研究は、このような事象に関与するメカニズムを解明し、神経疾患を治療するための治療法の開発に貢献するために重要である。このプロトコルは、3Dバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインクによってアストロサイトに富んだ神経様組織構造をバイオファブリケートする方法を説明する。この研究では、押出ベースの3Dバイオプリンターを使用し、C57Bl/ 6マウスの脳皮質からアストロサイトを抽出した。バイオインクは、ゼラチン、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)、フィブリノーゲンからなる生体材料溶液に皮質アストロサイトを最大3から混合して調製し、最適なバイオプリンティング条件を提示した。3Dバイオプリンティング条件は細胞ストレスを最小限に抑え、74.08%±細胞がバイオプリンティング直後に生存可能であったプロセス中のアストロサイトの高い生存率に寄与した。インキュベーションの1週間後、アストロサイトの生存率は3.00%±83.54%に有意に増加し、3D構築物が細胞増殖に適した微小環境を表すことを示している。生体材料組成物は、細胞結合および刺激された星状細胞の挙動を可能にし、細胞は特異的なアストロサイトマーカーの線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現し、典型的な星状形態を有する。この再現性プロトコルは、細胞の天然微小環境に似たアストロサイトに富んだ3D神経様組織をバイオファブリケートする貴重な方法であり、アストロサイトの機能性と神経疾患に関与するメカニズムとの関係を理解することを目的とした研究者に有用である。
Introduction
アストロサイトは中枢神経系(CNS)の中枢細胞の中で最も豊富な細胞型であり、脳恒常性において重要な役割を果たす。神経細胞の永続的なサポートに加えて、アストロサイトは神経伝達物質の取り込みを調節し、血液脳関門の完全性を維持し、ニューロンシナプス発生1、2を調節する役割を果たします。アストロサイトはまた、CNS炎症に必須の役割を有し、アストロシタリ機能または反応性アストログリオーシス3、4に至る過程で脳の傷害に反応し、変性剤5に対する健康な組織の広がりを防ぐグリア瘢痕を形成する。この事象は、アストロサイトの遺伝子発現、形態、および機能6,7の変化をもたらす。したがって、アストロサイトの機能性を含む研究は、神経疾患を治療するための治療法の開発に役立ちます。
インビトロ モデルは神経損傷に関連するメカニズムを研究するために重要であり、皮質アストロサイトの正常な分離と2次元(2D)培養が確立されたが、このモデルは、ネイティブの細胞挙動を模倣し、脳の複雑さを再現する現実的な環境を提供することができない.2D条件では、機械的および生化学的支持が悪いこと、低細胞および細胞マトリックス相互作用、および基底-腹極性の欠如につながる細胞平坦化は、細胞のシグナル伝達ダイナミクスおよび細胞形態および遺伝子発現の変化をもたらす実験的結果に影響を及ぼし、治療10に対する応答性を損なう。したがって、より現実的な神経環境を提供する代替案を開発し、その結果をクリニックに翻訳することを目指することが重要です。
3次元(3D)細胞培養は、CNS11を含む器官および組織の忠実性の高い特徴を再現する、より高度なモデルを表す。グリア培養に関しては、3Dモデルは、アストロサイト形態、細胞基底-極性、および細胞シグナル伝達12,13の維持に寄与する。3Dバイオプリンティング技術は、細胞と生体材料を使用してネイティブ組織の構造と特性を再現することで、3D生体組織を制御された方法でバイオハブ化する強力なツールとして登場しました。この技術の使用は、結果予測の大幅な改善につながり、CNS14、15、16に適用される再生医療に貢献しています。
ここで説明するプロトコルは、皮質アストロサイトの分離と培養について詳述する。このプロトコルはまた、ラミニンを補充したゼラチン/ゼラチンメタクリロイル(GelMA)/フィブリノーゲンに埋め込まれたアストロサイトをバイオプリントする再現可能な方法を詳述する。本研究では、1 x106細胞/mLの密度で皮質アストロサイトを含む生体材料組成物を印刷するために、押出ベースのバイオプリンターを使用した。バイオプリンティングせん断応力は、印刷速度を制御することによって最小限に抑え、そして、アストロサイトは、プロセス後に高い生存率を示した。バイオプリント構築物を1週間培養し、アストロサイトはヒドロゲル内で広がり、付着し、生存し、星状形態を維持し、特異的マーカーグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(GFAP)4を発現することができた。
この手順は、ピストン駆動押出ベースのバイオプリンターと互換性があり、異なるソースから得られたバイオプリントアストロサイトに使用することができます。ここで提案される3Dバイオプリントモデルは、健康組織のアストロサイト機能に関与するメカニズムの研究や、神経学的病理の進行や治療開発の理解など、幅広い神経工学用途に適しています。
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Protocol
動物に関するすべての手順は、研究における動物の使用に関する国際的なガイドライン(http://www.iclas.org)に従い(http://www.iclas.org)、サンパウロ連邦大学研究倫理委員会(CEUA 2019/9292090519)によって承認されました。
1. マウスの脳解剖
- 冷たいハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の10 mLを100mm培養皿に、1 mLを1.5 mLマイクロチューブに移します。動物1匹につき1本のマイクロチューブを用意する。
注:文化料理とマイクロチューブの両方を氷の上に保管する必要があります。 - DMEM F12+ 10% 胎児血清 (FBS) 2% グルタミン、および 1% ペニシリンストレプトマイシン (P/S) を使用してアストロサイト培地を調製します。0.2 μm フィルターを使用してフィルター処理して、培地を殺菌します。
- C57Bl/6マウスの子犬(出生後1日目)を鋭利な操作ハサミを使用して切断して安楽死させる。鉗子を使用して、皮膚を引っ張り、頭蓋骨を露出させます。はさみと鉗子の両方が70%エタノールで殺菌されることを確認する。
- 鋭い湾曲した先端のはさみを使用して、頭蓋のマグナムから頭の上に頭蓋骨を切ります。
注:脳の組織が損傷していないことを確認してください。 - エタノール70%で殺菌したヘラを使用して、脳を頭蓋腔から持ち上げ、10mLの冷たいHBSSを含む培養皿に入れる。
- 脳を含む培養皿を実体顕微鏡下に置き、2つの鈍い先端鉗子を使用して、髄液を脳から取り除く(図1)。
- ヘラを使用して脳の中央値線からそっと転がすことによって、脳の残りの部分から皮質を分離します。
- 両方の皮質を収集し、すぐに冷たいHBSSの1 mLを含む同じマイクロチューブにそれらを転送します。
2. アストロサイトの孤立と文化
- 層流の下で、湾曲したマイクロハサミを使用して皮質組織を小さく切り、3倍上下にピペットを入れて1mLのHBSSで洗浄します。組織が落ち着くのを待ちます。HBSSを取り外し、新しいHBSSを追加して、このプロセスをさらに2回繰り返します。
- HBSSを取り除き、37°Cで0.05%トリプシンの1 mLで組織を5分間インキュベートします。
注:この時点で、トリプシン消化だけで十分です。 - 15倍上下に軽くピペットを入れ、組織を機械的に解化します。
注:組織の完全な解離は、懸濁度の増加と懸濁液中の組織の大きな断片の欠如によって観察される。 - 溶液を15 mLの円錐形チューブに移し、同量のFBSを加えてトリプシン活性を中和し、0.4μmの細胞ストレーナーフィルターで溶液をフィルタリングして解化されていない断片を除去します。
- フィルターを1mLのアストロサイト培地で洗浄し、ストレーナーを通過した細胞懸濁液を回収し、200xgおよび25°Cで5分間遠心分離する。 遠心分離後、上清を捨て、1mLのアストロサイト培養培地中にペレットを懸濁させた。
- 細胞懸濁液をT25培養フラスコに移し、培地の体積を3.5mLにし、37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。
- 24時間後、細胞が接着していることを確認してください。その後、培地を交換し、3日ごとに交換します。
- 7日後、2mLの1xPBSで細胞を洗浄することにより、培養液からミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを除去する。
- PBS溶液をアストロサイト培地に交換し、培養フラスコを一晩180rpmで軌道シェーカーに残します。
注:アストロサイトは、約10〜12日間の文化でコンフルエント単層を形成します。
3. ゼラチンメタクリロイルの合成(GelMA)
- ブタ皮から得られたゼラチン10gを秤量し、溶液を完全溶解するまで240rpmおよび50°Cの加熱板で攪拌させることによりPBSの100mLに溶解する。
- フードの下に、低い機能化のためにメタクリル無水物(MA)の2mLを加え、ゼラチンエマルジョンを240rpmと50°Cで2時間撹拌します。
注意:MAハザードステートメント:H302 + H332(飲み込んだり吸入した場合に有害)、H311(皮膚に接触する毒性)、314(重度の皮膚火傷および眼の損傷を引き起こす)、315(皮膚刺激を引き起こす) )、H317(アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある)、H318(重篤な眼の損傷を引き起こす)、331(吸入すると有毒)、H332(吸入すると有害)、H335(呼吸刺激を引き起こす可能性がある)。取り扱いガイドライン:P261(ほこり/煙/ガス/ミスト/蒸気/スプレーを吸い込むのを避ける)、P305 + P351 + P338 + P310(IF IN EYES:数分間水で慎重にすすいます。コンタクトレンズを外し、存在していて簡単に行うことができます。すぐにポイズンセンター/医師を呼び出す)、P301 + P312 + P330 (飲み込んだ場合:気分がよくな場合は毒センター/医師を呼び出します。口をすすいでください)。
注:MAを非常にゆっくりと追加し、ドロップでドロップします。 - 予熱したPBS(50°C)の100mLでゼラチン-MA溶液を希釈し、200mLの最終体積を得て、240rpmと50°Cで10分間攪拌させます。
- 約20cmの透析膜(分子カットオフ12-14kDa)を切断し、脱イオン水に浸して柔らかくなるまで浸します。
注:膜に脱イオン水を充填して、穴や欠陥がないことを確認します。 - 漏斗を使用して、ゼラチンMA溶液を膜に移す。
注: 混合を許可するために、内部に余分なスペースを残して両側を閉じます。 - ゼラチンMA溶液を含む膜を透析用蒸留水2Lの容器に入れ、40°Cで5日間(500rpm)かき混ぜます。
注:水の蒸発を避けるために容器を覆います。 - 蒸留水を1日に2回交換します。毎回、膜を裏返して均質化します。
- 5日目には、予熱した超純水(40°C)を透析したゼラチンMAに200mL混ぜ、40°Cで15分間かき混ぜます。
- ゼラチン-MA溶液を最大25 mLの円錐管に移し、チューブを-80°Cで2日間保持します。
注:凍結乾燥を容易にするためにチューブを水平に保管してください。 - 凍結溶液を3〜5日間凍結乾燥し、乾燥したGelMAを湿度から保護して保存します。
4. バイオインク製剤
注:バイオインクの1 mLを得るためには、濾過中に損失が生じる可能性があるため、少なくとも3 mLの生体材料溶液を製造することをお勧めします。
- フィブリノーゲン溶液の調製
- 脱イオン水中に生理食塩水(NaCl 0.9%)を調製し、10mgの濃度の濃度を得るために10mg/mLの生理食塩水に牛血漿から10mgのフィブリノーゲンを溶解します。
注:フィブリノゲンがガラスに吸い付くように、フィブリノーゲン溶液を調製するためにガラスフラスコを使用しないでください。 - フィブリノーゲンが完全に溶解するまで、溶液を37°Cで撹拌したままにしておきます。
注:フィブリノーゲン溶解の場合は、37°Cのオーブン内に置かれた回転式システムを使用してください。 37°Cのホットプレート上のフィブリノーゲンの磁気攪拌(180rpm)も適している。この条件下では、10mg/mLフィブリノーゲンは溶解するのに約40分かかります。
- 脱イオン水中に生理食塩水(NaCl 0.9%)を調製し、10mgの濃度の濃度を得るために10mg/mLの生理食塩水に牛血漿から10mgのフィブリノーゲンを溶解します。
- ゼラチン/ゲルマ溶液の調製
- 0.12gのゼラチンを秤量し、予熱したPBS(40°C)の1.9mLに加え、4%(w/v)ゼラチンの最終濃度を得る。溶解を促進するボルテックス。
- エマルジョンは完全に溶解するまで40°Cに保ちます。
- 0.06 gの凍結乾燥ゲルMAを秤量し、ゼラチン溶液に移し、2%(w/v)GelMAの最終濃度を得た。溶解を促進するボルテックス。
- 溶液を完全に溶解するまで40°Cに保ちます。
- アストロサイトを含むゼラチン/ゲルマ/フィブリノーゲンバイオインクの調製
- ピペット0.9 mLの10 mg/mLフィブリノーゲン溶液をゼラチン/GelMA溶液に移し、フィブリノーゲンの最終濃度3mg/mLを得た。
- 0.015 gの光導入剤(PI)を秤量し、ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液に移して0.5%(w/v)PIの最終濃度を得る。チューブを上下に反転して溶液を混ぜ、40°Cで光から保護し、PIの劣化を防ぎます。
注:4°Cで最大24時間ビオインをストックしてください。 - 層流下で、0.2 μmフィルターを使用して溶液を無菌15 mL円錐管にフィルターします。
注:生体材料溶液は、ろ過を可能にするために37〜40°Cでなければなりません。 - 生体材料溶液980μLを15 mLの円錐チューブに移します。
- 生理食塩水にラミニンを希釈し、100 μg/mLのストック溶液を得る。
- ピペット20μLのラミニンを、バイオインを含むチューブに移し、2μg/mLラミニンの最終濃度を得る。
- 泡を避けて上下にピペットで軽く混ぜます。気泡が持続する場合は、200 x g で円錐管を2分間遠心する。ビオインキを細胞と混合するまで37°Cに保ちます。
- 0.05%トリプシンで5分間、一次アストロサイトをトリプシン化します。
注:1から3の通路からアストロサイトを使用してください。 - 1:1の比率でFBSでトリプシン活性を中和し、細胞を15 mLの円錐形チューブに移します。200 x g で 5 分間遠心します。
- セルを数え、1 x 106 細胞を別の円錐形のチューブに移します。200 x g で 5 分間遠心します。
- 小容量(〜200μL)を残した上清を取り除き、円錐管の底部を軽くタップして細胞ペレットを吊り下げます。
- ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液1 mLを細胞を含むチューブに移し、ピペットを上下に穏やかに上下して均質化し、1 x 106 細胞/mLの最終濃度を得る。
5. 架橋剤の調製
- トロンビン再構成
- 15 mL円錐管に0.1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)を用いた滅菌脱イオン水中のトロンビン100 U/mLのストック溶液を準備します。マイクロチューブの在庫は-20 °C。
注:トロンビンはガラスに吸い込むので、ストック液を準備したり、アリコートを保管したりするためにガラスのフラスコを使用しないでください。
- 15 mL円錐管に0.1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)を用いた滅菌脱イオン水中のトロンビン100 U/mLのストック溶液を準備します。マイクロチューブの在庫は-20 °C。
- トロンビン-CaCl2 溶液の調製
- ピペット100 μLのトロンビンストック溶液を、8.9 mLの無菌脱イオン水を含む50 mLの円錐状チューブに移し、1 U/mLトロンビンの最終濃度を得た。
- 脱イオン水で10%(w/v)CaCl2溶液を調製し、0.2 μmフィルターを使用して滅菌します。
- 10%CaCl2溶液の1.1mLをトロンビンを含む円錐管に移し、最終比1:9(クロンビンに対するCaCl2)を得た。
メモ:実験で使用するボリュームでクロスリンカーソリューションを準備し、ストレージを避けてください。
6. 押出しベースのバイオプリンターを用いたバイオプリンティングアストロサイトを含むバイオインク
- 神経組織の設計
- Gコードを使用する:X軸とY軸上の各バイオプリント線の間の距離の1mm、Z軸(各線の間に0.2mm)の6層の間の距離を持つ6 x 6 mm(正方形)のグリッドを構築します。押し出し(E)を0.01mmに設定し、Z軸の新しい層ごとに0.001 mmを増加させます。印刷速度(F)を400 mm/min(補足情報)に設定します。
- バイオプリンターのセットアップ
- 15分間紫外線に機械を露出させ、エタノール70%で拭き取ります。
- 電源スイッチを使用して、バイオプリンターの電源を入れます。USBケーブルでコンピュータにコンピュータを接続します。制御ソフトウェアを開いてバイオプリンターに接続し、ファイル設計をロードします。
- バイオプリンティングシリンジの調製
- アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを1,000 μLピペットを使用して5 mLプラスチックシリンジに移します。
注:バブルの形成を避けるためにゆっくりと転送します。 - 滅菌22G鈍い針を注射器に接続します。
メモ:注射器は4°Cで2分間放置します。 - シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動でフラッシュして残りの気泡を取り除きます。
- アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを1,000 μLピペットを使用して5 mLプラスチックシリンジに移します。
- バイオプリンティング
注:バイオプリンティングは、ラミナーフードの外側で行われました。- バイオプリンターテーブルに35mmの培養皿を置き、針の動きを可能にするために、培養皿表面から0.1mm離れた場所に針を置きます。
注:各バイオプリンティングに35mmの培養皿を1つ使用してください。 - 印刷ボタンを押します。
- バイオプリンティングが終わったら、注射器が皿から離れるようにしてください。次に、培養皿を閉じ、架橋処理に備えます。
メモ:1つの構成体のバイオプリンティングは約1分と10 sかかります。
- バイオプリンターテーブルに35mmの培養皿を置き、針の動きを可能にするために、培養皿表面から0.1mm離れた場所に針を置きます。
- バイオプリント構造と培養物の架橋
- GelMA架橋用の2 x 60 s(上下)の場合は、2 mW/cm2 の UV 光の下に培養皿を置きます。
- 層流の下で、生殖不能のへらを使用して24ウェルプレートにバイオプリント構造を移す。
- 500 μLのトロンビン/CaCl2 溶液を加え、30分間放置してフィブリン架橋を可能にします。
- 架橋液を取り出し、2 mLのPBS 1xで洗浄します。次いで、PBSを1mLのアストロサイト培養培地に置き換え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。3日ごとにメディアを変更します。
7. アストロサイトの生存率の評価
- バイオプリントアストロサイトの生存率
- スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを35mm培養皿に移します。
- 1mLの1x PBSで構成体を洗浄します。
- ライブ/デッド試薬の100 μLをコンストラクトに堆積させ、37°Cで30分間保ち、光から保護します。
- ライブ/デッド試薬を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
- サンプルをヘラを使用して共焦点皿に移し、画像取得のために488および570 nmの励起を使用して共焦点顕微鏡の下で構築物内の細胞を観察する。
注: コンストラクト内のセル全体を視覚化するには、10 倍の倍率を使用します。 - サンプルが平らに座っていることを確認します。必要に応じて、サンプルの上にカバースリップを置き、平坦性を高めます。
注:イメージング中は、コンフォーカルディッシュが十分に密閉されていることを確認して、サンプルが乾燥するのを防ぎます。 - 計算ソフトウェアを使用して、実行可能(緑)とデッド(赤)の数を計算します。
- 2Dアストロサイト文化の生存可能性
- 35mm共焦点皿に種子0.5 x 106アストロサイト(通路1-3)を入れ、アストロサイト培地を加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- 細胞がコンフルエントである場合は、培養培地を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
- ライブ/デッド試薬の200 μLを堆積させ、37°Cで30分間、光から保護します。
- ライブ/デッド試薬を取り出し、1mLの1x PBSで細胞を洗います。
- デジタルカメラと結合された共焦点顕微鏡に皿を取り、イメージ獲得のための488および570 nmの励起を使用する。
- 計算ソフトウェアを使用して、実行可能(緑)とデッド(赤)の数を計算します。
8. アストロサイトの免疫染色
- 3Dバイオプリントアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)染色
注:他の細胞マーカーの存在を調べるには、それに応じて一次抗体を変更してください。- ウェルから培地を取り出し、3倍PBSの1mLで構造を洗浄します。
- 構造が完全に覆われるまで、PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、4°Cで2時間放置します。
- PFAを取り出し、3倍PBSの1 mLで構造を洗浄します。
メモ:この手順は、PBSで4°Cで保存した場合、数ヶ月間一時停止することができます。PBSの蒸発を避けるために、ウェルプレートが密封されていることを確認してください。 - サンプルをグリシン 0.1 mol/L で 5 分間処理します。
- 1mLの1x PBSで5分間洗浄します。
- 試料を、軌道撹拌下で25°Cで0.1%トリトンX-100と10%FBSを1時間含有するPBSで透過化します。
- 一晩4°Cで鶏抗GFAP(一次抗体希釈1:500)でコンストラクトをインキュベートします。
- 一次抗体を吸引し、1 mLのPBSで5分間、3回洗浄します。
注:一次抗体は、4°Cで保存すると数回再利用することができます。 - アレクサフルオール488コンジュゲート抗鶏(二次抗体希釈1:500)と1 μg/mL DAPIを眼窩撹拌下で25°Cで1時間インキュベートします。
注: サンプルを光から保護してください。 - サンプルを1mLのPBSで5分間、3回洗浄します。
- コンストラクトを35mmコンフォーカル皿に移します。
注:サンプルが乾燥するのを防ぐために、皿が十分に密封されていることを確認してください。
- 2Dアストロサイト培養のグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)染色
- 35mm共焦点皿に種子0.5 x 106アストロサイト(通路1-3)を入れ、アストロサイト培地を加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- 細胞がコンフルエントである場合は、培養培地を取り出し、1mLの1x PBSで洗浄します。
- ステップ 8.1.2 から 8.1.10 を繰り返します。
- アストロサイト細胞骨格染色
- ステップ 8.1.1 から 8.1.6 を繰り返します。
- PBSに蛍光共役ファロイジン溶液50μg/mLの200 μLを加え、構築物にDAPIを1 μg/mL加えます。
- 25°Cで1時間、軌道撹拌下でインキュベートし、試料を光から保護します。
- サンプルをPBS 1 mLで5分間3回洗浄し、ヘラを使用してコンフォーカル皿にコンフォーカルディッシュにコンフォーカルディッシュに移します。
注:サンプルが乾燥するのを防ぐために、皿が十分に密封されていることを確認してください。
9. 共焦点イメージング
- 画像撮影用のデジタルカメラ(359、488、および570 nm励起)と結合された共焦点顕微鏡に皿を取ります。
- 全体のビジュアライゼーションには 10 倍、拡大したセルの画像には 40 または 63 倍の倍率を使用します。
メモ:サンプルが平らに座っていることを確認してください。必要に応じて、サンプルの上にカバースリップを置き、平坦性を高めます。
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Representative Results
この研究は、3Dバイオプリンティング技術を用いて、層ごとの一次アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを堆積させる神経様組織の開発を目的とした。アストロサイトをマウスの子犬の大脳皮質(図1)から抽出して単離し、生体物質組成物に添加し、生きた3D構築物のバイオファブリケーションを可能にした。
コンピュータ支援設計(CAD)は、栄養素と酸素の拡散を促進することを目的として、1mmの細孔を持つ正方形の形状(0.6 x 0.6mm)の相互接続されたフレームとしてGコード(補足ファイル)を使用して開発されました。フレームは、各層の上に配置された6つの層で構成され、すべての層の90°の角度で変化した(図2Ai)。 設計された構造は、約5mmの高い(図2A ii)を有し、組織操作を可能にする。バイオインク組成物はまた、異なる形状の構成体の製造を可能にした(図2B)。
ゼラチン、GelMA、およびフィブリノーゲンからなるバイオインクの調製は、2つの架橋工程を含む。まず、GelMAをUV光下で架橋し、分子間および分子間共有結合が形成され、続いてフィブリン架橋が形成される。この工程では、トロンビンはフィブリノーゲン鎖を酵素的に切断し、フィブリン繊維17の形成をもたらし、Ca2+イオン18によって反応安定化を行う。次いで、GelMAおよびフィブリン繊維は、ラミニンを補った安定なインター浸透ポリマーネットワーク(IPN)を形成し、細胞付着に適した支持を形成し、19,20(図2C)に広がる。
バイオプリンティングの前に、12日間の単離の後、アストロサイトは、アストロサイト中間フィラメント4のタンパク質成分であるGFAPの存在を特徴としていた(図3A)。次いで、トリプシン化されたアストロサイトを、1 x106細胞/mLの密度でゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液と混合し、アストロサイトを含むバイオインクを生成した。バイオインクを22G鈍針に接続した5mLの注射器に移し、バイオプリンタープリントヘッドを構成した(図3Bi)。 針は、細胞に高いせん断応力を防ぐために詰まり、バイオインク押出を可能にしました。
より高い温度で流体として、より低い温度21でゲルとして動作するゼラチンの粘弾性特性のために、バイオプリントは形状忠実度を保持した構築物である(図3B ii)。2層連続したバイオインクのバイオプリンティングの後、生体材料内に細胞を閉じ込めた明確な構造(図3C)の形成が観察された。
バイオプリンティングおよび架橋プロセスの後、構築物をアストロサイト培地でインキュベートし、1日後のバイオプリンティングの後、ほとんどの細胞は依然として丸い形態を提示した(図3D)。バイオプリントされた足場は、7日間のインキュベーション後も完全性を維持し、いくつかの丸い細胞が観察されたが、多数のアストロサイトが構造全体に広がり、占星術形態および相互接続を提示した(図3E)。
速度などのバイオプリンティングのパラメータは細胞の生存率に直接影響を与える可能性があるため、異なるバイオプリンティング速度(400、600、800 mm/min)をテストし、カルセインAM(生細胞、緑色蛍光)およびエチジウムホモジマーIII(EthD-II)(死細胞、赤フッ素)を用いたライブ/デッドアッセイを使用してアストロサイト生存率を評価しました。生存細胞の割合を計算ソフトを用いて定量化し、生存細胞数と死細胞数を計算した。細胞生存率は時間0(バイオプリンティング直後)で評価され、結果は、より低速で、400mm/min、生存可能な細胞が全細胞の74.08%±1.33%を表し、600および800mm/minでバイオプリントされた細胞よりも有意に高いことを示 ±した(60.25%±1.93%および62.946.18%)そのため、この作業では400mm/分の速度が使用されました。
バイオプリンティングの前に、2D培養アストロサイトは生存細胞の割合として特徴付け、バイオプリントアストロサイトの生存率はこの状態に正規化した。結果は、2D培養が生存細胞の90.98%±0.94%を示したことを示した。バイオプリントアストロサイトの生存率(7日目)は、3.00%±83.54%、2D値の0.92±0.03を表し、0日目(0.81±0.01)よりも有意に高かった(図4B)。生死性試薬で染色されたアストロサイトの画像を図4Cに示し、バイオプリンティング後に細胞が円形形態を有していることを示している(図4Ci)。 1週間のインキュベーションの後、アストロサイトは構築物全体に広がり(図4C ii)、2D培養からの細胞の明確な形態を示す(図4Ciii)。
バイオプリントされたアストロサイトは、構築物内の細胞密度および細胞形態を示すために染色された。図5Aは、7日後のインキュベーション後のバイオプリント構築物を示し、高密度のアストロサイトをファロイジンで染色した、F−アクチン細胞骨格色素である。円形の細胞はほとんど見られなかったが、星状の形態を主として提示したアストロサイト。バイオプリントアストロサイトは、7日後に染色した場合にGFAP陽性であることが示され、細胞がそれらの占星型を維持していることを示す(図5Bi)。 図5Biiおよび5B iiiは、構築物内のバイオプリントGFAP+アストロサイトのZ積層画像を示す。これらの結果は、バイオインク組成物が、アストロサイトの接着、広がり、成長を促進するために生体適合性の微小環境を提供したことを示している。
図1:初等星状細胞培養における脳と皮質分離の抽出 原発性アストロサイトは、C57Bl/6マウスの子犬(出生後1日目)脳の皮質から単離された。動物から脳を抽出した後、髄液を顕微鏡で取り出し、皮質を分離し、続いて組織消化およびアストロサイト培養を行った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3Dバイオプリンティングプロセスの模式図(A)(i)2層、上視、および(ii)6層、サイドビュー、構築物を示す神経組織の3Dバイオプリンティング用に設計されたCADファイル。(B) 異なる形状の構造を印刷するバイオインクの容量を示す画像 (i) 正方形, (ii) 毛細血管, および (iii) 星.(C)3Dバイオプリンティング後に架橋する生体材料のスキームは、GelMAがUV光下で架橋され、続いてトロンビンでフィブリン架橋が続く:Ca2+浴場。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクの3Dボスプリント. (A) 12日間の分離と培養後のアストロサイトの特徴付け,GFAP,緑およびDAPI,青に染色された。(B) (i) プリントヘッドセットアップと (ii) バイオプリント直後の 3D バイオプリントコンストラクト(B)バイオプリントフレームを示す二層構造。4xの拡大(C)バイオプリントアストロサイトの画像は、バイオプリンティングの1日後に、丸型形態で細胞を示す。(D)バイオプリントされたアストロサイトの画像は、バイオプリンティングプロセスの7日後に、円形細胞の少ない星状形態を有する細胞を示し、模倣組織との親和性を示す。10倍の倍率。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:バイオプリントアストロサイトの生存率の評価(A)異なる速度でバイオプリントされたアストロサイトの生存率。(B) バイオプリンティングアストロサイトの生存率(i)0日目 (バイオプリンティング直後) および (ii) バイオプリンティングの7日後に、 2D培養におけるアストロサイトの生存可能性に正規化した。Tukeyの検定を用いた一方道アノバによる統計分析は、n = 3、* p<0.05です。(C) 生死試薬で染色されたアストロサイトの蛍光画像。バイオプリントアストロサイト(i)0日目(バイオプリンティング直後)、7日目(iii)のアストロサイトの2D培養。10倍の倍率。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:3Dバイオプリントアストロサイトの特徴付け(A)F-アクチン(ファロイジン、F-アクイジン)に対して染色されたインキュベーションの7日後の3Dバイオプリントアストロサイトの蛍光免疫 赤)および核(DAPI、青)および(B)GFAP、緑色(i)10倍の倍率を有する、(ii)バイオプリント構築体のX-Y-Z軸を示すZスタック、およびGFAP+アストロサイトのX-Z軸を示す画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
3Dバイオプリンティング技術は、脳23を含む天然組織22に構造的および生理的に類似した精製構造の工学を可能にするバイオファブリケーション代替手段として浮上している。神経様組織のバイオファブリケーションは、生体外の天然の微小環境モデリングを可能にし、CNS11に影響を及ぼす多くの疾患の開発および治療に関連する細胞および分子機構を理解するための重要なツールである。神経機能におけるグリア細胞の重要な役割のために、皮質アストロサイトは、脳発達24、生体分子輸送25、神経突起伸長26、および脳様組織バイオファブリケーション14など多くの研究で使用されてきた。
アストロサイトの3D培養を設計する方法は、以前に報告されました, 異なる生体材料と足場技術を使用して27,28,29.同様に、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来神経凝集体を3Dバイオプリンティングする方法も報告され、これらのバイオプリント細胞が分化し、成熟する能力をvitro30で示した。しかし、文献中に3Dブリオプリントアストロサイト構築物のバイオファブリケーションの方法の報告はない。そして、このプロトコルは、3Dバイオプリンティング皮質アストロサイトの再現可能な方法を記述することを目的とした。
このプロトコルでは、アストロサイトをC57Bl/6マウスの大脳皮質から単離し、研究31、32で広く使用されている動物モデルであり、hiPSCおよび脊髄などの他の供給源に由来するアストロサイトに置き換えることができる。分離、文化、およびサブカルチャーの後、アストロサイトは、その本質的な増殖限界8のために推奨される分割の最大数である、通過3までの増殖状態にとどまる。通過4からのアストロサイトの増殖が限られていることが確認され、3Dバイオプリンティングに必要な量の細胞を達成することは困難であった。
記載された方法では、生体印刷プロセスを生き残るために細胞の能力を評価し、ヒドロゲル内の培養中に細胞の生存率および本質的特性を維持するための概念実証として、1.0 x 106細胞/mLの濃度を使用した。前作では、3Dバイオプリントされた神経様組織を、アストロサイトとニューロンを共培養してバイオハブを行い、細胞相互作用を増加させるため、アストロサイト濃度は8.0 x 106細胞/mL14であった。次に、細胞の濃度は、特定の研究のために最適化されてもよい。
3Dバイオプリンティング用のバイオインクは、細胞と生体材料または生体材料33の組み合わせから構成される。このプロトコルでは、ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンの組み合わせが使用され、培養中のアストロサイトのバイオプリンティングおよび維持性の両方に有利であることが示された。押出しベースのバイオプリンティング技術を使用する場合、バイオプリント可能なバイオインクの製造は困難です。生体材料組成物は、印刷プロセス34の後に3D形状を保持しながら、同時に、バイオインクの押し出しを可能にする粘弾性特性を有しなくてはならない。また、プロセス中に細胞生存率を維持することができるはずであり、これは、バイオプリンティング条件に応じて、死に至る細胞にせん断応力を引き起こす可能性がある35。
バイオプリント性はゼラチンによって保証された、そのゾルゲル転移能36に起因する最適な粘弾性特性を有する生体材料である。これにより、ゼラチン高分子は押出中に流体として、またバイオプリンティング後のゲルとして、3D構造を維持して再配置して動作させることができます。また、コラーゲン誘導体として、ゼラチンはグリシンアミノ酸ペプチドの三重反復で構成され、細胞特異性21を保証する。しかし、ゼラチンの分子内結合と分子間結合が弱く、そしてその熱可逆性のために、ゼラチンは37°Cで安定性がなく、細胞培養中に構築物から放出される。したがって、GelMAは安定なヒドロゲルとして代替となり、UV光博覧会後に形成される共有結合に起因して、細胞特異性特性19を維持する。ゲルMAの物理的性質は、気孔率、分解、弾性率など、異なる組織工学アプリケーション19に合わせて調整することができる。GelMA足場の剛性は、メタクリロイル置換37を変化させることによって制御することができ、モデル化される組織と同様の剛性を達成することを可能にする。すなわち、機能化の程度を小さくすることで、剛性が低い37を達成できる。そこで、マウス脳38、39の柔らかさと、細胞外マトリックス(ECM)の剛性が細胞挙動40に直接作用するため、このプロトコルではゼラチンの機能化の程度が低い方法が提案された。これまでの研究では、GelMAヒドロゲルがCNSの物理的特徴を模倣する能力について、アストロサイト、ニューロン、および神経幹細胞14、41、42を培養するための高い適合性を示す結果が報告された。
GelMA以外にも、酵素反応を通じてフィブリン繊維を形成する天然の生体高分子であるフィブリノーゲンは、神経様組織をバイオファブリケートするために広く使用されており、高い特異性を示し、30、43、44を成長させる神経細胞に適した微小環境を提供している。アルギン酸塩やキトサンなどの他の生体材料は、神経様組織をバイオプリントするために使用されており、ゼラチン、GelMA、および/またはフィブリノーゲンに混合して、3D足場14,30の印刷性および物性の向上を目指している。本方法では、ゼラチン、GelMA、およびフィブリノーゲンをバイオインクの成分として使用して、最適な生物印刷性、物理的安定性、および細胞特異性を達成した。微小環境に対するアストロサイトの認識を高めるために、脳ECM-のラミニン-a成分をビオインクを補うために使用した。
このプロトコルでは、ゼラチンを4%(w/v)の濃度で使用し、25°Cでのバイオインのゾルゲル転移を約10分以内に可能とした。より速いゲル化はゼラチンの濃度を高めることによって達成することができる。しかし、0.2 μmフィルターを用いた濾過による殺菌は危険にさらされる可能性があります。バイオインク濾過は重要なステップであり、より高い濃度のゼラチン(>5%w/v)がろ過を防ぐことができることを確認する。バイオプリンティング中に迅速なゲル化点を達成する代わりに、バイオプリンタープリントヘッドで接続する前に、バイオインクを含むシリンジを4°Cで2分間放置する方法があります。バイオプリンティングの後、3D構造を不安定化させ、UV博覧会の前にゲル化した状態を維持するために、25°Cで構築物を維持することが重要です。特に、フィブリノーゲン架橋剤溶液をプレートに添加すると、構築物は固体であるべきである。GelMA架橋の場合、構築物全体でUV博覧を確実にするためにサンプル(2 x 60 sの両側)を反転することが重要です。フィブリノーゲン架橋の場合、架橋剤溶液は構築物を完全に覆う必要があります。したがって、より大きな皿やプレートを使用する場合は、ボリュームを調整する必要があります。架橋後、ヒドロゲルは位相コントラスト顕微鏡下で均質に見える必要があり、細胞は円形形態を有する構造全体に均質に分布するべきである。
このプロトコルは、ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクが異なる形状の構造を印刷することを可能にし、コンストラクトの完全性と3D形状を維持しました。層流の内部で25°Cに達する温度の制限により、バイオプリンティングは層流の外側の培養室で行った。バイオプリンティング時間はサンプル毎に約1分で、細胞培養中に汚染は認められなかった。
細胞の完全性は、プロセス35で引き起こされるせん断応力のために、バイオプリンティングによって影響を受ける可能性があります。これは、印刷速度などの印刷パラメータを最適化することで制御できます。この研究では、400、600、および800 mm/minの異なるバイオプリンティング速度をテストし、速度を400から600mm/minに増加させた場合の細胞生存率の有意な低下を観察した。400mm/minでは、バイオプリンティング後も約74%の細胞が生存可能であり、7日間のインキュベーション(>80%)後もこの値が大幅に増加しました。そのため、環境への細胞の過剰な博覧会を避けるために、より低い速度を使用しなかった。アストロサイトの2D培養は、バイオプリント細胞と比較して高い生存率(〜90%)を示した。しかし、蛍光画像によって示されるように、形態は培養の種類によって影響を受ける。2D細胞は平坦であったが、3D環境のアストロサイトは星のような形をしており、細胞プロセスによって互いに相互接続していた。
特に、この模倣微小環境は皮質アストロサイト培養に好適であり、細胞の生存率が1週間後に有意に増加したため、構築物内の細胞増殖が示唆された。ラミニンは、脳ECMに存在する糖タンパク質を、ヒドロゲル14へのアストロサイトのより高い付着を達成することを目的とするバイオインクに添加した。細胞骨格F-アクチン染色は、バイオプリントアストロサイトが構築物内で高密度であることを示し、このプロトコルで使用される細胞濃度がアストロサイト間の相互接続を可能にしたことを示した。GFAP局在化のための免疫組織化学は、Fアクチン染色によって裏付けられたアストロサイトの広範な樹型および細胞肥大45と相関するマーカーであり、細胞が典型的な星状形態を提示することを示し、模倣3D系は細胞が自生環境で付着し、行動するのに有利であることを示した。
ここで示すプロトコルは、3Dバイオプリンティング皮質アストロサイトのための効率的で再現可能な手順を説明します。神経炎症反応の神経炎症反応や神経機能の調節においてアストロサイトの重要性により、このグリア細胞を含む研究は、CNSに影響を与える疾患の理解において多くの側面に寄与する可能性がある。したがって、ここで紹介する3D in vitro モデルは、アストロサイトとニューロンの相互作用、脳病理におけるアストロサイトの機能性、および治療標的としてのアストロサイトの可能性を研究することを目的とした将来の用途に有用である。
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Disclosures
著者らは開示する矛盾はない。
Acknowledgments
この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP)、助成金番号2018/23039-3および2018/12605-8によって支えられました。国家科学技術開発評議会(CNPq)、助成金数465656/2014-5および309679/2018-4;高等教育人材の向上のための調整 (CAPES), 金融コード 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
| Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6--30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
| Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
| Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
| Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
| Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
| Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
| Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
| Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
| Operating scissor | Integra Miltex | 05--02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
| Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
| Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
| Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
| Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002--04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
| Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
| Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |
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